專利名稱：一種檢測植物激素β-3-吲哚乙酸的電化學(xué)免疫傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測方法，具體是一種檢測植物激素β -3-吲哚乙酸的電化學(xué)免疫傳感方法。
背景技術(shù)：
^^是化(1016-3-3061化acid的簡稱，中文化學(xué)名稱為β-3-吲哚乙酸，生物學(xué)名稱為生長素，是傳統(tǒng)五大類植物激素中最早被發(fā)現(xiàn)的一種，也是具有相當(dāng)重要的生物學(xué)意義以及應(yīng)用價值的一種植物生長物質(zhì)。β -3-吲哚乙酸在植物的葉芽和嫩葉等分生組織中廣泛存在。植物細胞經(jīng)常利用色氨酸來合成β-3-吲哚乙酸。它普遍存在于植物體內(nèi)，高濃度抑制植物生長，低濃度促進植物生長，對非植物安全無害，亦無作用。正是由于IAA在生物生理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中均有重要的作用，而其含量又較低，化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易分解，所以如何對IAA含量進行準確的測定就具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種植物樣品中IAA含量的檢測方法。本發(fā)明能較好的滿足IAA測定的需要，且方法簡單，快速，靈敏度高，為檢測 IAA提供了一種新的途徑。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的檢測植物樣品中IAA含量的方法包括以下步驟在金電極表面制備無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器；繪制標準工作曲線； 對實際植物樣品中IAA含量進行檢測。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案還可以進一步完善。所述無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器可以由以下步驟制備(1)將處理干凈的金電極首先浸入0.02 M半胱胺溶液中4°C下反應(yīng)他，使其表面形成致密的自組裝單層膜。 (2)水洗晾干后，在室溫條件下將其浸入10 mg/mL的酵母細胞溶液中反應(yīng)4h，取出，水洗， 晾干。(3)然后滴加40ml的0.5 mg/mL IAA抗體溶液(PBS，pH 7.5)于金電極表面，37°C下溫育lh。取出水洗，晾干。(4)最后，采用30ml的lOmg/mLBSA溶液封閉晶振表面的非特異性反應(yīng)位點。按照此方法即獲得無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器，修飾好的免疫傳感器電極探針可浸入適宜PH值的PBS溶液中于4°C下保存?zhèn)溆谩Ｋ龅闹谱鳂藴使ぷ髑€方法為 將修飾有抗體的工作電極(即制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器)置于不同濃度的抗原(IAA)溶液中孵育60min (37°C )，在相同條件下測定其循環(huán)伏安曲線，響應(yīng)電流差值與IAA濃度成正比。為獲得一個穩(wěn)定的實驗結(jié)果，對生物傳感器表面的電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定值。改變IAA標準溶液的濃度，按上述步驟測定一系列不同濃度的IAA標準溶液，用免疫傳感器表面的循環(huán)伏安電流變化值與IAA濃度繪制標準工作曲線。所述的樣品測定方法為先測定制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器表面循環(huán)伏安電流值；然后取處理好的樣品溶液取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器，37°C環(huán)境下反應(yīng)60min ；對免疫傳感器表面的循環(huán)伏安電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值。將響應(yīng)電流差值與繪制好的標準工作曲線對照獲得植物樣品溶液中IAA含量的數(shù)值。IAA電化學(xué)免疫傳感器的檢測原理本發(fā)明是基于利用電化學(xué)免疫傳感器具有高靈敏度、簡便、快速、可靠等特點，結(jié)合生物識別系統(tǒng)(抗原抗體特異性結(jié)合)而形成的一種自動化分析檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)植物樣品中IAA含量的快速檢測。本發(fā)明利用自組裝技術(shù)和酵母細胞活體固定化技術(shù)，將IAA抗體固定在通過由自組裝單層半胱氨膜和靜電吸附活體酵母細胞修飾的金電極表面，解決了抗體固定的難題，然后在電極上滴加待測樣品，由于IAA能與anti-IAA發(fā)生高特異性的免疫反應(yīng)，如果樣品中IAA含量高，結(jié)合到金電極表面的IAA的量就多，然后用循環(huán)伏安法測定。本發(fā)明實際上響應(yīng)信號與樣品中2，4-D含量成正比，即樣品中IAA越多，連接到金電極上的抗原就越多，免疫響應(yīng)電流差值就越大，信號越明顯。本發(fā)明效果是 在IAA濃度為lng/mL-125ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，校正曲線是y=0. 0395x+0. 6499，相關(guān)性系數(shù)R為0. 9976，檢測下限為0. 05ng/mL。經(jīng)應(yīng)用證實此方法能較好的滿足植物樣品中 IAA含量測定的需要。
權(quán)利要求
1.一種檢測植物激素β-3-吲哚乙酸(IAA)的電化學(xué)免疫傳感方法，其特征在于包括以下步驟(1)在金電極表面制備無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器；(2)制作標準工作曲線；(3)對實際植物樣品中IAA含量進行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器由以下步驟制備將處理干凈的金電極首先浸入0.02 M半胱胺溶液中4°C下反應(yīng)他，使其表面形成致密的自組裝單層膜；水洗晾干后，在室溫條件下將其浸入10 mg/mL的酵母細胞溶液中反應(yīng)4h，取出，水洗，晾干；然后滴加40ml的0.5 mg/mL IAA抗體溶液(PBS，pH 7.5)于金電極表面，37°C 下溫育Ih ；取出水洗，晾干；最后，采用30ml的lOmg/mLBSA溶液封閉晶振表面的非特異性反應(yīng)位點；按照此方法即獲得無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器，修飾好的免疫傳感器電極探針可浸入適宜PH值的PBS溶液中于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標準工作曲線的制作，其特征在于將修飾有抗體的工作電極(即制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器)置于不同濃度的抗原(IAA)溶液中孵育 60min (37°C )，在相同條件下測定其循環(huán)伏安曲線，響應(yīng)電流差值與IAA濃度成正比；為獲得一個穩(wěn)定的實驗結(jié)果，對生物傳感器表面的電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定值；改變 IAA標準溶液的濃度，按上述步驟測定一系列不同濃度的IAA標準溶液，用免疫傳感器表面的循環(huán)伏安電流變化值與IAA濃度繪制標準工作曲線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測植物樣品中IAA含量的方法，其特征在于先測定制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器表面循環(huán)伏安電流值；然后取處理好的樣品溶液取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型IAA電化學(xué)免疫傳感器，37°C環(huán)境下反應(yīng)60min ；對免疫傳感器表面的循環(huán)伏安電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值；將響應(yīng)電流差值與繪制好的標準工作曲線對照獲得植物樣品溶液中IAA含量的數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種檢測植物激素β-3-吲哚乙酸的電化學(xué)免疫傳感方法，主要包括以下步驟來實現(xiàn)1)電極修飾與免疫傳感器的制備；2)標準曲線的制備；3)樣品的檢測。本發(fā)明有益的效果是在傳感器界面構(gòu)建中，利用酵母細胞對IAA抗體進行活體定向固定，提高了檢測下限和靈敏度，從而實現(xiàn)IAA的高靈敏定量測定。該方法在IAA濃度為1ng/mL～125ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢測下限為0.05ng/mL，能較好的滿足對植物樣品中IAA含量測定的需要，且具有方法簡便，結(jié)果可靠，成本較低等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/74GK102253223SQ20111011105
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月30日
發(fā)明者李合松, 王若仲, 肖浪濤, 藺萬煌, 黃志剛 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)