專利名稱：應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的篩選方法，尤其涉及豬產(chǎn)仔相關(guān)候選基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
家畜一般都是從野生種經(jīng)過(guò)若干年人工馴化而來(lái)，其許多重要的經(jīng)濟(jì)性狀得到改善，例如生長(zhǎng)速度、產(chǎn)仔數(shù)、肉質(zhì)等等。家豬是大約在9000年前從野豬通過(guò)人工馴化而來(lái)，同樣，在過(guò)去的幾千年里，通過(guò)人工選擇，許多重要經(jīng)濟(jì)性狀得到改善，如生長(zhǎng)速度、肉質(zhì)、產(chǎn)仔數(shù)和抗病性等。例如，中國(guó)梅山豬的窩產(chǎn)仔數(shù)在18頭以上，而中國(guó)野豬的窩產(chǎn)仔數(shù)只有大約8頭。繁殖性狀，尤其是產(chǎn)仔數(shù)，是降低豬肉生產(chǎn)成本的重要組成部分，因此有很多研究用來(lái)改善這些性狀。豬窩產(chǎn)仔數(shù)多少直接影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)效益。據(jù)Chris (1996)計(jì)算， 只要產(chǎn)仔數(shù)提高1頭/胎，英國(guó)養(yǎng)豬業(yè)每年就可多獲利7億英鎊，而整個(gè)歐共體則可多獲純利20億歐元。在我國(guó)，如果母豬產(chǎn)仔數(shù)每胎提高1頭，每年將增收至少190億人民幣的純利，并能顯著提供我國(guó)國(guó)民的蛋白食入量，改善人們的膳食結(jié)構(gòu)，提供人民身體素質(zhì)；同時(shí)， 國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上豬肉的穩(wěn)定和提高供應(yīng)也成為我國(guó)糧食安全建設(shè)的重要內(nèi)容；高繁殖力的遺傳必將為我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。如何提高豬的產(chǎn)仔數(shù)？傳統(tǒng)上的人工選擇是從豬出生后對(duì)其表型的觀察用來(lái)篩選高產(chǎn)仔數(shù)的豬，這個(gè)表型是由于基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果。雖然已經(jīng)取得了一些成果，由于產(chǎn)仔數(shù)的遺傳力很低，大約為0. 09，此外，這種表型的測(cè)定只有在豬很大的時(shí)候才能進(jìn)行并且還有性別限制，因此傳統(tǒng)的方法并沒(méi)有得到充分有效的利用。在過(guò)去的幾十年中，分子生物學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)方法的進(jìn)步，例如分子標(biāo)記輔助選擇(MAQ技術(shù)增加了繁殖性狀的遺傳改良效率。這種技術(shù)能夠在豬剛出生的時(shí)候并且可以在雌豬和雄豬中進(jìn)行篩選，此外，其準(zhǔn)確度也有很大程度的提高。如果我們要利用這種技術(shù)來(lái)提高豬的產(chǎn)仔數(shù)，首先得找到一個(gè)基因或者基因組區(qū)域作為與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)聯(lián)的特定標(biāo)記。候選基因法已經(jīng)被證明是一個(gè)非常有力的用來(lái)鑒定顯著影響表型的基因的手段。產(chǎn)仔數(shù)候選基因通常是在重要生理過(guò)程中起著重要的功能并可以通過(guò)關(guān)聯(lián)分析證實(shí)。豬繁殖性狀是復(fù)雜性狀，從排卵、 受精、著床、直到仔豬出生，每一個(gè)過(guò)程都可能會(huì)影響豬的產(chǎn)仔數(shù)。由于傳統(tǒng)的候選基因法嚴(yán)重依賴于這些基因生物學(xué)功能和生物學(xué)表型，但是到目前為止，大多數(shù)生物學(xué)表型和基因生物學(xué)功能是未知的，因此，候選基因法的利用受到了很大的限制。雖然目前已經(jīng)報(bào)道了很多產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因，例如FSHi3、EP0R、FUTl、TGFi3 1、ESR、PRLR和RBP4等，但是真正被驗(yàn)證并真正用于生產(chǎn)的很少?，F(xiàn)有方式篩選候選基因效率低下。動(dòng)物體內(nèi)真正發(fā)揮作用的是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)扮演著構(gòu)筑生命大廈的“磚塊”角色， 隨著破譯生命密碼的人類基因組計(jì)劃的完成，一個(gè)以蛋白質(zhì)為研究重點(diǎn)的后基因組時(shí)代已經(jīng)拉開(kāi)序幕，蛋白質(zhì)將是今后的生命科學(xué)重點(diǎn)研究方向之一。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)主要涉及兩方面內(nèi)容一是蛋白質(zhì)組的組成成分，即蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究；二是蛋白質(zhì)組的功能，即蛋白質(zhì)組功能模式的研究。對(duì)蛋白質(zhì)組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要部分，它要求對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定的圖譜化。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)有(1)分離技術(shù)，包括雙向電泳和液相色譜(HPLC)，( 鑒定技術(shù)，主要是生物質(zhì)譜技術(shù)。分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心。目前，研究蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線主要有兩條，一條是以雙向電泳加生物質(zhì)譜的方法鑒定生物體系中各種蛋白的表達(dá)譜以及各蛋白表達(dá)程度的相對(duì)變化，另一條路線就是多維色譜與生物質(zhì)譜相結(jié)合的稱之為鳥(niǎo)槍法的技術(shù)路線。其中國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究是以雙向電泳為主要手段，其原理是雙向電泳(Two Dimensional Electrophoresis, 2DE)的第一向電泳是等點(diǎn)聚焦電泳(Iso—Electric Focusing, IEF)，然后通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行第二向電泳；在IEF中，蛋白質(zhì)因等電點(diǎn)不同而被分離，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白質(zhì)被分開(kāi)，再用考馬斯亮蘭或銀染進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和解[1 ；2 ；3]。由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量是兩個(gè)彼此不相關(guān)的重要特性，而2DE利用了這兩個(gè)特性來(lái)分離蛋白質(zhì)，因此2DE的分離特性非常強(qiáng)大，它甚至能將細(xì)胞中的5000種蛋白質(zhì)分離開(kāi)。2DE 在分離蛋白混合樣品，比較差異方面有著不可替代的作用W]。2D-DIGE技術(shù)適合用于差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析，這種技術(shù)只需要一塊膠就可以檢測(cè)兩組蛋白樣品之間的差異表達(dá)蛋白。其原理是分別利用熒光染料Cy3和Cy5標(biāo)記這兩組蛋白樣品，同時(shí)用另一種熒光標(biāo)記由這兩組蛋白樣品等量混合的樣品記為內(nèi)參，然后把這三組樣品同時(shí)上樣進(jìn)行雙向電泳。因此，2D-DIGE技術(shù)較普通雙向電泳具有更高的靈敏度和重復(fù)性[5 ；6]。蛋白質(zhì)組的鑒定技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的支柱。質(zhì)譜是對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的一種重要方法，也是蛋白質(zhì)組研究中最關(guān)鍵的一步。質(zhì)譜技術(shù)是目前在鑒定蛋白質(zhì)的多種方法中發(fā)展最快、最具潛力的技術(shù)，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、自動(dòng)化等特點(diǎn)[7]。利用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定主要有2種方法(1)肽質(zhì)量指紋譜(P印tide mass fingerprint, PMF) 法是在經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)分離后(如利用2DE技術(shù)分離蛋白質(zhì))，將蛋白質(zhì)分離，用特定的酶進(jìn)行酶切，獲得肽段混合物，而后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行肽段質(zhì)量的測(cè)定，從而獲得該蛋白質(zhì)各切割肽段的質(zhì)量，通過(guò)這些質(zhì)量搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)，得以進(jìn)一步識(shí)別出該蛋白質(zhì)。( 串聯(lián)質(zhì)譜 (Tandem mass spectrum)法是在蛋白質(zhì)酶解后，對(duì)酶解肽段進(jìn)一步裂解，并對(duì)其裂解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，最后利用這些測(cè)定的質(zhì)量反推肽段的氨基酸序列[8]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法，用以克服現(xiàn)有技術(shù)篩選效率不高的問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明篩選與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法是通過(guò)差顯技術(shù)比較梅山豬與野豬(Sus Scrofa)卵巢之間蛋白表達(dá)的差異，并由此確定候選基因。由于卵巢是卵泡發(fā)生和卵子成熟的場(chǎng)所，卵巢在控制排卵數(shù)和卵子質(zhì)量上具有很重要的作用，因此卵巢的功能也與產(chǎn)仔數(shù)存在著密切的聯(lián)系。利用家畜和野生種在產(chǎn)仔數(shù)上的巨大差異，可以通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)手段來(lái)確定這兩種卵巢中表達(dá)的蛋白，從而能夠快速而準(zhǔn)確地篩選影響產(chǎn)仔數(shù)的基因。在本發(fā)明實(shí)施例中，采用梅山豬和野豬(Sus krofa)，作為研究對(duì)象，從中篩選得到多種與產(chǎn)仔相關(guān)的候選基因。
上述差顯技術(shù)可以是雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(MALDI-T0F-MS)，也可以是通過(guò)mRNA差異顯示來(lái)考察上述兩者的差異，但對(duì)蛋白的考察則更加直接有效。具體地，本發(fā)明方法包括如下步驟1)利用2D-DIGE尋找差異蛋白a、分別將梅山豬卵巢組織和野豬卵巢組織用PBS清洗后，加入DIGE裂解液并勻漿，超聲破碎細(xì)胞，離心取上清，得到蛋白樣品；b、用不同熒光染料分子分別標(biāo)記梅山豬卵巢蛋白樣品和野豬卵巢蛋白樣品，進(jìn)行雙向電泳，用熒光掃描儀獲得2D-DIGE圖像，并基于此獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；2)差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定將步驟l)a得到的蛋白樣品分別進(jìn)行雙向電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，并切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析。更具體地，本發(fā)明方法包括如下步驟1)利用2D-DIGE尋找差異蛋白a、分別將梅山豬卵巢組織和野豬卵巢組織300mg在冰上剪切成3mm見(jiàn)方的小塊， 用PBS洗3遍，加入Iml含酶抑制劑的DIGE裂解液，勻漿；轉(zhuǎn)入離心管中，超聲破碎細(xì)胞， 12，OOOg離心45分鐘，得上清蛋白樣品；b、取各蛋白樣品50μ g，分別標(biāo)記400pmol的不同染料分子，并進(jìn)行雙向電泳，電泳條件為PH值3-10NL，12. 5% SDS-PAGE,用熒光掃描儀獲得2D-DIGE圖像，并基于此獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；2)取步驟l)a得到的蛋白樣品Img分別進(jìn)行雙向電泳，電泳條件為pH值 3-10NL,12.5% SDS-PAGE，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，膠內(nèi)酶解， MALDI-TOF-MS 分析結(jié)果。在分析時(shí)，可以結(jié)合梅山豬與野豬的雜交后代進(jìn)行分析。此外，在熒光雙向電泳前，還可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)(等電聚焦凝膠電泳)來(lái)查看雙向電泳的可行性。另外，還可以預(yù)先測(cè)試樣品的標(biāo)記可行性。本發(fā)明提供了能夠高效篩選與家畜產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法，本發(fā)明實(shí)施例利用該方法鑒定了一些豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因。本發(fā)明方法對(duì)克隆控制家畜高產(chǎn)仔性狀的優(yōu)質(zhì)基因提供了一個(gè)方法借鑒。在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)仔數(shù)家畜上具有很重要的參考價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、能快速和有效地篩選到與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)聯(lián)的候選基因；2、本發(fā)明很好地利用了我國(guó)特有高產(chǎn)豬種梅山豬和低產(chǎn)豬種野豬并且運(yùn)用 2D-DIGE這一高通量、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段來(lái)研究與豬性狀相關(guān)的候選基因；3、可以廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的研究和開(kāi)發(fā)并且結(jié)合轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)來(lái)培育高產(chǎn)仔數(shù)的新品種豬。


圖1是豬卵巢蛋白的雙向電泳銀染的結(jié)果圖，Al C2分別是Al C2六個(gè)樣本；圖2是熒光染料分子標(biāo)記的豬卵巢蛋白電泳圖，圖中9個(gè)泳道是隨機(jī)選的3個(gè)樣品用熒光染料Cy2、Cy5和Cy3進(jìn)行標(biāo)記，然后以4 2 1上樣進(jìn)行SDS-PAGE ；圖3豬卵巢蛋白的2D-DIGE圖像之一；圖4是差異蛋白在不同豬種中表達(dá)量的總體趨勢(shì)圖；圖5是差異表達(dá)蛋白的GO分類圖；圖6顯示的是半定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白的結(jié)果；圖7顯示的是Wfestern Blot驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的篩選一、利用2D-DIGE技術(shù)分析梅山豬與野豬以及這兩種豬的雜交豬的卵巢的差異蛋白取2頭梅山豬的卵巢，標(biāo)記為A1、A2 ；2頭野豬(Sus Scrofa)和梅山豬雜交而來(lái)的雜種豬的卵巢，標(biāo)記為B1、B2 ；2頭湖北野豬的卵巢，標(biāo)記為C1、C2。樣品采集后馬上凍于液氮中，用于后續(xù)試驗(yàn)部分。以上卵巢均取自華蓋養(yǎng)殖廠。各取300mg的組織在冰上剪切成3mm見(jiàn)方的小塊，用PBS洗3遍，加入DIGE裂解液(DIGE裂解液和蛋白酶抑制劑以體積比50 1混合，7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 羅氏cooktail蛋白酶抑制劑)lml，用Dounce’ s勻漿器勻漿。轉(zhuǎn)入離心管中，超聲破碎細(xì)胞(80W, 5次，每次10秒，間隔15秒，冰上完成)。離心，12，OOOg, 45分鐘，上清用Bradford 法定量，分裝成IOOyg—管，置于500 μ 1離心管中，低溫保存(-80°C )。預(yù)備試驗(yàn)，每個(gè)樣品上樣100 μ g，IEF為pH3_10非線性膠條，Amersham公司產(chǎn)品 (電泳條件30v 12hrs,500v lhr, IOOOv lhr, 8000v8hrs, 500v 4hrs)，SDS-PAGE 為 12. 5% 的膠(15mA/膠30min，30mA/膠至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5cm)，然后銀染。用于判斷樣品2D可行性。結(jié)果表明這些樣品是可以用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的(圖1)。隨后，取用每個(gè)組的樣品50 μ g，標(biāo)記400pmol的染料分子(cy2、cy3和cy5)，在 12. 5% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行梯度上樣(1 2 4)，測(cè)試樣品的標(biāo)記可行性。(標(biāo)記3個(gè)樣品，每個(gè)組隨機(jī)選1個(gè)樣品)，結(jié)果表明隨機(jī)選的這3個(gè)樣品是可以用染料進(jìn)行標(biāo)記的(圖 2)。以上的預(yù)實(shí)驗(yàn)部分說(shuō)明豬卵巢的蛋白抽提是成功的，能夠用于后面的2D-DIGE 分析。然后按照表1標(biāo)記樣品(每50yg樣品標(biāo)記400pmol的染料分子，pH值3-10NL， 12. 5% SDS-PAGE分析，內(nèi)標(biāo)為三個(gè)組等量混合物，每塊凝膠上樣也是50 μ g)，隨后進(jìn)行雙向電泳(電泳條件30v 12hrs,500v lhr, IOOOv lhr,8000v 8hrs,500v 4hrs), SDS-PAGE 為12. 5%的膠(15mA/膠30min，30mA/膠至溴酚藍(lán)離膠下沿0. 5cm)。注意始終要避光。表1 :DIGE上樣表格
最后，使用Typhoon掃描儀，分別用三種不同的波長(zhǎng)488nm (Cy2), 532nm (Cy3)， 633nm(Cy5)掃描，獲得圖譜。圖3為掃描得出的一個(gè)典型的2D-DIGE圖像。最后，利用Decyder 2D軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，進(jìn)行兩兩之間的比較，得到符合統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。利用1.5倍作為閥值，得到了 109個(gè)差異點(diǎn)。其中60個(gè)蛋白點(diǎn)在雜交豬中表達(dá)量最高，這其中包括26個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量在梅山豬中比野豬表達(dá)量高；34個(gè)蛋白點(diǎn)在家豬中表達(dá)量最高；15個(gè)蛋白點(diǎn)在野豬中表達(dá)量最高。圖4顯示了差異蛋白在不同豬種中表達(dá)量的總體趨勢(shì)。 二、差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定考慮到梅山豬和野豬的產(chǎn)仔數(shù)上的巨大差異，本發(fā)明主要選取了在梅山豬和野豬卵巢中的表達(dá)上有差異或者在雜交豬中存在非常明顯差異的60個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析。取各組樣品Img左右，隨后進(jìn)行雙向電泳(電泳條件pH值3-10NL，30v 12hrs,500v lhr, 1000vlhr,8000v 8hrs,500v 4hrs), SDS-PAGE 為 12. 5% 的膠(15mA/膠 30min，30mA/ 膠至溴酚藍(lán)離膠下沿0. 5cm)，考馬斯亮藍(lán)染色法，切下差異點(diǎn)，做膠內(nèi)酶解，MALDI-T0F-MS 分析結(jié)果。通過(guò)質(zhì)譜鑒定，本發(fā)明得到了 38個(gè)單一的蛋白。其中19個(gè)在家豬卵巢中表達(dá)量高于野豬。表2列出了這詳細(xì)的19個(gè)蛋白的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列號(hào)、名稱、等電點(diǎn)、以及其
分子量。在本發(fā)明鑒定的蛋白中，有許多調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的蛋白在梅山豬和野豬卵巢中差異表達(dá)，例如Vimentin和CapZ beta。細(xì)胞骨架在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期上具有很重要的功能[9]。細(xì)胞骨架在卵子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。細(xì)胞骨架一系列高度協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)對(duì)于產(chǎn)生成熟卵泡是必不可少的[10]。此外，在卵子發(fā)生的過(guò)程中，細(xì)胞骨架發(fā)生著劇烈的變化[11]。本研究鑒定Vimentin及Vimentin的異構(gòu)體在梅山豬卵巢中是高表達(dá)的。Vimentin是一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)卵巢功能的蛋白，在卵子發(fā)生過(guò)程中，由 Vimentin構(gòu)成的中間纖維能夠重新分布線粒體，線粒體在卵泡的優(yōu)勢(shì)化過(guò)程中具有非常重要的作用[12]。因此，Vimentin在卵子發(fā)生過(guò)程中具有非常重要的作用，其表達(dá)量也與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。表2 :19個(gè)在家豬卵巢中表達(dá)高于野豬卵巢的蛋白質(zhì)。
7序列號(hào)蛋A名稱生物學(xué)功能等電點(diǎn)分子量(Da)gi|47523308Heat shock 70 kDa protein IB (HSP70.2)protein refolding5.670098熱休克蛋 70蛋0質(zhì)折Sgi|156120803hypothetical protein T,OC5233229.7872548假設(shè)蛋白LOC523322gi|54873401heat shock 60 kDa protein 1'de novo' protein folding8.2160924熱休克蛋白60新合成蛋白質(zhì)折疊gi|149692011protein disulfide isomerase family A, memberprotein disulfide isomerase activity5.97568603, isofoim 2蚩白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3gi|76097691Vnnentinintermediate filament-based process4.7753670波形蛋白中間纖維細(xì)胞骨架的功能gl|46I74420prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursorprotein metabolic process4.4957102腦4-羥化酶，β亞基蛋0質(zhì)的代謝過(guò)程gi|73948960similar to Vimcntin isoform 3intermediate filamcnt-bascd proccss4.7753670波形蛋白異構(gòu)體3中間纖維細(xì)胞骨架的功能gi|32967591Phosducin (PHD) (33 kDa phototraiisducingphospholipase inhibitor activity4.7528115protein)瞵脂酶抑制活性光傳感因子gi|45269029cytoskeletal beta actinstructural constituent of5.2941736肌動(dòng)蚩白c ν Io skeleton細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成gi|73964667PREDICTED hypothetical protein5.2942053XP533132假設(shè)蛋白ΧΡ_533 Π2gi|8097150440S ribosomal protein SA (37 kDa laminintranslational elongation4.832928rcccptor)翻譯延伸40S核糖體蛋白SAgi|l 16175259heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AlRNA binding9.2734196核不均一性核糖核蛋白AlRNA結(jié)合gi|89574151mitochondrial malate dehydrogenase 2, NADoxidoreductase activity8.3833000蘋(píng)果酸脫氫酶氧化還原酶活性gi|134035396F-aclin-capping protein subunit beta (CapZaclin cytoskeleton organization5.4731315beta)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織絲狀I(lǐng)動(dòng)蛋白成帽蛋白Pgi|75050405Voltage-dependent anion-selective channelanion transport7.531592protein 2陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)電壓依賴性陰離子通道蛋0 2
gi|47116966Translationally-controlled tumor proteinregulation of apoptosis4.8419595(TCTP)受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化gi| 119888643PREDICTED: hypothetical protein10.0313942假設(shè)蛋白伊|_1198路643gi|73954721similar to transgelin isoform 2actin binding8.8722609轉(zhuǎn)凝蛋白異構(gòu)體2肌動(dòng)蛋Η細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)gi|47716872galectin-1signal transducer activity5.0714932半乳糖凝集素1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
三、差異表達(dá)蛋白的GO分類質(zhì)譜鑒定的差異蛋白相對(duì)應(yīng)于人的基因編號(hào)在NCBI中找出用于GO分析。利用 MANGO-GO注釋工具進(jìn)行功能分類。圖5顯示這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有許多功能，如蛋白結(jié)合， 催化功能以及細(xì)胞骨架等。并且有些蛋白可以劃分到多個(gè)功能域中。四、差異表達(dá)蛋白的RT-PCR和Wfestern Blot驗(yàn)證為了初步驗(yàn)證2D-DIGE-MS篩選出的差異蛋白的可靠性，本發(fā)明進(jìn)行了初步的半定量PCR驗(yàn)證，其結(jié)果如圖6，基本上與質(zhì)譜的結(jié)果相符合。隨后本發(fā)明選取了幾個(gè)蛋白進(jìn)行了 Western Blot驗(yàn)證，其結(jié)果如圖7，說(shuō)明2D-DIGE-MS篩選家豬與野豬以及雜交豬卵巢的差異表達(dá)蛋白是可行的。其結(jié)果是可信的。參考文獻(xiàn)[1] R. Aebersold, M. Mann, Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422(2003) 198-207.[2]A. Gorg, C. Obermaier, G. Boguth, A. Harder, B. Scheibe, R. Wildgruber, W. Weiss, The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.Electrophoresis 21(2000)1037-1053.[3]A. Gorg, W. Postel, S. Gunther, The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.Electrophoresis 9 (1988)531-546.[4]A. Gorg, W. Weiss, M. J. Dunn, Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics 4(2004)3665-3685.[5] J. S. Minden, S. R. Dowd, H. E. Meyer, K. Stuhler, Difference gel electrophoresis. Electrophoresis 30 Suppl 1 (2009)S156-161.[6]M. Unlu, Μ. E Morgan, J. S. Minden, Difference gel electrophoresis :a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18(1997)2071-2077.[7]T. C. ffalther, M. Mann, Mass spectrome try-based proteomics in cell biology. J Cell Biol 190(2010)491-500.[8]K.Gevaert, J.Vandekerckhove, Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis 21 (2000) 1145-1154.[9]W. Zou, J. Ke, A. Zhang, M. Zhou, Y. Liao, J. Zhu, H. Zhou, J. Tu, H. Chen, M. Jin, Proteomics analysis of differential expression of chicken brain tissue proteins in response to the neurovirulent H5Nlavian influenza virus infection. J Proteome Res 9(2010)3789-3798.[ 10] C. C. Wy 1 i e , D. Brown, S. F. Godsave , J. Quarmby, J. Heas man, The cytoskeleton of Xenopus oocytes and its role in development. JEmbryol Exp Morphol 89 Suppl(1985) 1-15.[11]S. M.McPherson, H. E, Dynamics of the oocyte cortical cytoskeleton during oogenesis in Rhodnius prolixus.Tissue Cell 25 (1993)399-421.[12]L. Cooley, W. E. Theurkauf, Cytoskeletal functions during Drosophila oogenesis. Science 266(1994)590-596.
權(quán)利要求
1.篩選與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法，該方法是通過(guò)差顯技術(shù)比較梅山豬與野豬 (.Sus Scrofa)卵巢之間蛋白表達(dá)的差異，并由此確定候選基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述差顯技術(shù)為雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)利用2D-DIGE尋找差異蛋白a、分別將梅山豬卵巢組織和野豬卵巢組織用PBS清洗后，加入DIGE裂解液并勻漿，超聲破碎細(xì)胞，離心取上清，得到蛋白樣品；b、用不同熒光染料分子分別標(biāo)記梅山豬卵巢蛋白樣品和野豬卵巢蛋白樣品，進(jìn)行雙向電泳，用熒光掃描儀獲得2D-DIGE圖像，并基于此獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；2)差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定將步驟1) a得到的蛋白樣品分別進(jìn)行雙向電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，并切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)利用2D-DIGE尋找差異蛋白a、分別將梅山豬卵巢組織和野豬卵巢組織300mg在冰上剪切成3mm見(jiàn)方的小塊，用PBS 洗3遍，加入Iml含酶抑制劑的DIGE裂解液，勻漿；轉(zhuǎn)入離心管中，超聲破碎細(xì)胞，12，OOOg 離心45分鐘，得上清蛋白樣品；b、取各蛋白樣品50μ g，分別標(biāo)記400pmol的不同染料分子，并進(jìn)行雙向電泳，電泳條件為PH值3-10 NL, 12. 5%SDS_PAGE，用熒光掃描儀獲得2D-DIGE圖像，并基于此獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；2)取步驟1)a得到的蛋白樣品Img分別進(jìn)行雙向電泳，電泳條件為pH值3-10 NL, 12. 5%SDS-PAGE，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，膠內(nèi)酶解，MALDI-T0F-MS 分析結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于分析的樣本還包括梅山豬與野豬的雜交后代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的方法，該方法利用中國(guó)特有的高產(chǎn)豬種梅山豬以及產(chǎn)仔數(shù)低的中國(guó)野豬，通過(guò)差顯技術(shù)從它們卵巢中尋找差異蛋白，特別是在梅山豬卵巢中高表達(dá)的基因，以期快速而大規(guī)模的鑒定與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)聯(lián)的基因。這種方法與以往的篩選候選基因具有快速，準(zhǔn)確，并且可以與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)相結(jié)合為我國(guó)轉(zhuǎn)基因新品種培育和產(chǎn)業(yè)化提供原動(dòng)力。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102229977SQ20111011897
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者周榮家, 程漢華, 陳科 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)