專利名稱：一種檢測卵巢skov-3癌細胞的三明治型電化學(xué)傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料領(lǐng)域、醫(yī)療診斷和傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種測定卵巢癌SK0V-3 細胞的電化學(xué)傳感器。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是人類健康的巨大威脅，卵巢癌則是發(fā)生于卵巢組織的惡性腫瘤。由此可見檢測卵巢癌細胞的水平有十分重要的意義。電分析化學(xué)由于具有靈敏度高、選擇性好、 響應(yīng)時間短、所需儀器設(shè)備價格低廉等優(yōu)點而廣泛用于生命物質(zhì)的電化學(xué)檢測。以往的一些腫瘤檢測以免疫方法為主，成本高、操作步驟復(fù)雜，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果是該方法的致命缺點。因此開發(fā)出高靈敏度(用于體內(nèi)痕量SK0V-3癌細胞的檢測)、高選擇性(防止體內(nèi)共存物質(zhì)的干擾)、價錢低廉、制備簡單測定SK0V-3方法引起了人們的研究興趣。石墨烯，作為碳的一種新的形態(tài)，是Sp2雜化碳原子組成的單層材料，是碳的二維結(jié)構(gòu)。由于其具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和電催化性能，因此可以作為制備電化學(xué)傳感器和生物傳感器的一種理想材料。它具有碳納米管的大部分優(yōu)越性能，而且不像碳納米管那樣負載金屬雜質(zhì)。由于石墨烯的生物兼容性，將其應(yīng)用于化學(xué)/生物傳感器有著非常好的發(fā)展前景。目標(biāo)放大檢測蛋白質(zhì)的方法促進了醫(yī)學(xué)的診斷和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。DNA標(biāo)記通過共價或鏈親合素-生物素的方法連接到抗體上，利用多聚酶鏈反應(yīng)放大后，用DNA檢測的方法來識別目標(biāo)待測物。至今為止，在所有的免疫多聚酶鏈反應(yīng)方法中，目標(biāo)分析物的檢測均涉及在抗體表面對目標(biāo)分析物的固定和對DNA標(biāo)記物的檢測。而相比于免疫多聚酶鏈反應(yīng)，很少有報道關(guān)于DNA標(biāo)記抗體檢測癌細胞的免疫傳感器。在此，我們設(shè)計制備了一種新型的電化學(xué)檢測卵巢癌SK0V-3細胞的免疫傳感器， 這種傳感器集中了石墨烯生物傳感器和DNA標(biāo)記物的優(yōu)點。通過這種方法，避免了抗體標(biāo)記的需要。在雜交目標(biāo)DNA之后，柔紅霉素活化了示差脈沖伏安信號，能測出鳥嘌呤氧化還原所產(chǎn)生的電流，借此實現(xiàn)人類卵巢癌SK0V-3細胞的檢測。在此基礎(chǔ)上，只要改變抗體種類，即可檢測出對該抗體有特異性吸附的腫瘤細胞。這種方法在臨床應(yīng)用上有著很大的潛力和光明前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高靈敏度、高選擇性測定卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器。本發(fā)明還將上述傳感器用于測定卵巢癌SK0V-3細胞。一種檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器，其制備方法包括如下步驟(1)制備用石墨烯修飾電極電極清洗打磨后，在電極表面滴加氧化態(tài)的石墨烯溶液，干燥，得到石墨烯修飾的電極；氧化態(tài)的石墨烯溶液濃度優(yōu)選為0. 5 ％ig/ml ；電極為玻碳電極；(2)石墨烯修飾的電極用偶聯(lián)劑混合溶液活化后，在抗體1溶液中放置20分鐘 2小時，使抗體1共價連接到石墨烯修飾的電極表面；所述抗體1為anti-HER2抗體(卵巢癌SK0V-3表面相應(yīng)抗原的抗體)；偶聯(lián)劑混合液為含有200 800mmol/L 1_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和80 200mmol/L N-羥基硫代琥珀酰亞的溶液；抗體1溶液濃度為2 50 μ g/mL ；再將連接了抗體1的電極在卵巢癌SK0V-3細胞懸浮液中浸0. 5 3小時；使抗原卵巢癌SK0V-3細胞與抗體1連接；(3)通過特異性吸附將探針DNA寡核苷酸-anti-HER2生物結(jié)合體吸附到步驟(2) 處理后的電極表面；再雜交互補DNA，得到雜交后的修飾電極；所述探針DNA寡核苷酸-anti-HER2生物結(jié)合體的制備包括以下步驟將 anti-HER2抗體加入到含有探針DNA寡核苷酸和偶聯(lián)劑的磷酸緩沖液中，反應(yīng)2 5小時；偶聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺， 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽濃度為，N-羥基硫代琥珀酰亞胺濃度為；磷酸緩沖液的PH值為7 7.5 ；(4)將步驟C3)雜交后的修飾電極在電化學(xué)指示劑溶液中浸泡2 10分鐘后清洗；電化學(xué)指示劑為柔紅霉素，濃度為5X10_6 5X10_5mol/L。用電化學(xué)檢測方法檢測電極表面上吸附的電化學(xué)指示劑的電量，通過計算雜交前后電極表面電化學(xué)數(shù)值變化指示雜交反應(yīng)的發(fā)生。步驟(1)中，氧化態(tài)的石墨烯制備方法為將石墨烯在硝酸和鹽酸的混合液中， 50 80°C條件下超聲2 6小時，洗滌至中性。用上述傳感器檢測卵巢癌SK0V-3細胞的方法為，以這種電化學(xué)傳感器作為工作電極，用電化學(xué)方法檢測所產(chǎn)生的電流，電解液為PH7 7. 5的磷酸緩沖液?？刹捎醚h(huán)伏安法、阻抗法或脈沖伏安法。本發(fā)明所說的ssDNA(探針DNA寡核苷酸)-anti-HER2生物結(jié)合體是利用帶有磷酸基功能團的探針DNA，與帶有氨基的抗體(Abl)在中間物的作用下能相互結(jié)合的特性，可通過將5’端帶有磷酸基修飾的探針DNA與抗體溶液混合后制得該復(fù)合物。本發(fā)明中探針DNA的磷酸基修飾可采用現(xiàn)有技術(shù)或商業(yè)途徑獲得。通過上述方法，利用抗原抗體特異性吸附、羧基氨基和磷酸基氨基共價結(jié)合的相互作用，在電極(尤其是玻碳電極)表面依次逐層修飾石墨烯修飾層、抗體l(anti-HER2抗體)、抗原(人類卵巢癌SK0V-3細胞)層、探針DNA寡核苷酸-anti-HER2(ssDNA-anti-HER2) 生物結(jié)合體，以此達到探針DNA固定在玻碳電極表面的目的。再捕獲互補DNA，雜交與探針 DNA互補的DNA，雜交后的雙鏈DNA作為電化學(xué)指示劑載體。通過這種“三明治型”的雜交方法，在電化學(xué)指示劑(柔紅霉素)的作用下，用電化學(xué)信號間接檢測卵巢癌SK0V-3細胞的存在。其中ssDNA-anti-HER2生物結(jié)合體避免了抗體標(biāo)記的高成本費用，且在常溫下 DNA非常穩(wěn)定，不易失活。由于石墨烯較好的導(dǎo)電性，此傳感器在卵巢癌SK0V-3細胞濃度較低時也有明顯信號，檢測限可達到2. 9cellS/mL。此方法測定的SK0V-3癌細胞含量濃度范圍在ecells/mL—1 eOOOcells/mL—1，有良好的線性關(guān)系，檢測限在2. gcells/mL—1。


圖1 玻碳電極上每修飾一層修飾物后，通過電化學(xué)方法測得的循環(huán)伏安圖。(a)裸玻碳電極；(b)石墨烯/裸玻碳電極；(C)抗體1/石墨烯/裸玻碳電極；(d)SK0V-3細胞 /抗體1/石墨烯/裸玻碳電極；(e) ssDNA-抗體2/SK0V-3細胞/抗體1/石墨烯/裸玻碳電極。圖2 采用本發(fā)明的傳感器檢測不同濃度的卵巢癌SK0V-3細胞，此方法測定的 SK0V-3癌細胞含量濃度范圍在ecells/mL—1 eOOOcells/mL—1，有良好的線性關(guān)系，檢測限在 2. 9cells/mlA
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。實施例1如圖1所示A、B步驟，制備本發(fā)明的免疫電化學(xué)傳感器。(1) ssDNA-anti-HER2生物結(jié)合體(探針DNA寡核苷酸-anti_HER2生物結(jié)合體) 的制備首先將0. 5 μ g/ μ L anti_HER2抗體加入到含有2. 12X l(T6mol/L探針DNA寡核苷酸(ssDNA)、0. lmol/L 1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸(EDC)和0. lmol/L N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS)的lOmmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.3)中，在室溫下振蕩反應(yīng)3個小時。用高效液相色譜儀來提純該復(fù)合物。流動相是標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖溶液(0. 2mol/L, PH 7. 3)，流速為lml/min，首先出峰的物質(zhì)就是ssDNA-anti-HER2生物結(jié)合體。最后，再用分光光度計來定性檢測流出高效液相的ssDNA-anti-HER2生物結(jié)合體。(2)電極預(yù)處理及組裝通過化學(xué)法合成的石墨烯在體積比為3 1的硝酸/硫酸混合液(硝酸和硫酸濃度分別為22. 33mol/L和17. 66mol/L)中，70°C超聲4個小時，過濾或離心、洗滌重復(fù)幾次直至溶液的PH為中性后，放入真空干燥箱中干燥。干燥后的氧化態(tài)石墨烯分散在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，濃度為ang/mL，待用。玻碳電極在麂皮上分別用1. 0 μ m，0. 3 μ m和0. 05 μ m α-氧化鋁粉末懸液打磨
后，再分別在乙醇和超純水中超聲清洗，氮氣吹干后，在電極上滴加6 μ 1的氧化石墨烯溶液，放置在干燥器中待干。干燥后的石墨烯修飾玻碳電極先在400mmol/L EDC和100mmol/L NHSS的溶液中活化半小時，再浸置在6 μ g/mL的抗體1溶液中1小時(37°C )，通過EDC/NHSS的作用使抗體l(anti-HER2抗體，簡寫為Abl)共價連接到修飾電極表面。然后，將該修飾電極于37°C 浸置在含有20yL 2%牛血清蛋白和0.05%吐溫-20的磷酸緩沖溶液中。1小時后，用含有 0. 05%吐溫-20的磷酸緩沖溶液沖洗3分鐘。然后將此電極浸置在含不同濃度的SK0V-3癌細胞懸浮液中(濃度分別為6、60、 600,6000cells/ml)該懸浮液含有2 %牛血清蛋白和0. 05 %吐溫-20)，1小時后，用含有 0. 05%吐溫-20的磷酸緩沖溶液沖洗3分鐘。待抗體抗原連接好后，將該修飾電極浸置在含有2%牛血清蛋白和0.05%吐溫-20的2. 25X 10_6mol/L的ssDNA-anti_HER2生物結(jié)合體磷酸緩沖溶液中，1小時后，用含有0. 05%吐溫-20的磷酸緩沖溶液沖洗3分鐘。通過特異性吸附使ssDNA-anti-HER2生物結(jié)合體吸附到SK0V-3的細胞表面。
最后通過雜交反應(yīng)雜交上互補DNA，該修飾電極的雜交反應(yīng)是在40°C含有 2. 25X 10_8mOl/L目標(biāo)DNA的磷酸緩沖溶液中進行的，30分鐘后，用含有0. 05%吐溫-20的磷酸緩沖溶液沖洗去除未雜交的目標(biāo)DNA。將上述所得的雜交后的三明治型電極浸置于10_5mol/L電化學(xué)指示劑(柔紅霉素溶液)中，5分鐘后拿出，用磷酸緩沖溶液洗凈，置入pH為7. 3的0. lmol/L磷酸緩沖液，得到電化學(xué)傳感器。(3) SK0V-3癌細胞的電化學(xué)檢測使用時，將所制備的電化學(xué)傳感器置入電解液(0. lmol/L磷酸緩沖液)中作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極，鉬絲電極作為輔助電極，采用示差脈沖伏安法檢測該修飾電極產(chǎn)生的電流。通過雜交反應(yīng)，互補DNA連接到電極上，同時吸附柔紅霉素到電極表面， 雜交后的電流值遠遠大于未經(jīng)互補DNA雜交的電極所產(chǎn)生的電流信號。如圖1所示，玻碳電極上每修飾一層修飾物后，通過電化學(xué)方法測得的循環(huán)伏安圖均有變化。圖1中，(a)裸玻碳電極；(b)石墨烯/裸玻碳電極；(c)抗體1/石墨烯/裸玻碳電極；(d) SK0V-3細胞/抗體1/石墨烯/裸玻碳電極；(e) ssDNA-抗體2/SK0V-3細胞 /抗體1/石墨烯/裸玻碳電極。如圖2所示，以前述卵巢癌SK0V-3細胞濃度分別為(a) Ocells/mL、(b) 6cells/mL, (c)60cells/mL、(d)600cells/mL、(e)6000cells/ml的懸浮液為標(biāo)準(zhǔn)曲線，可檢測不同濃度的卵巢癌SK0V-3細胞懸浮液。用此方法測定SK0V-3癌細胞含量濃度范圍在6cellS/mL 6000Cells/mL，檢測限可達到2. 9cells/mL0檢測結(jié)果如圖2。
權(quán)利要求
1.一種檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備用石墨烯修飾電極電極清洗打磨后，在電極表面滴加氧化態(tài)的石墨烯溶液， 干燥，得到石墨烯修飾的電極；(2)石墨烯修飾的電極用偶聯(lián)劑混合溶液活化后，在抗體1溶液中放置20分鐘 2小時，使抗體1共價連接到石墨烯修飾的電極表面；所述抗體1為anti-HER2抗體；再將連接了抗體1的電極在卵巢癌SK0V-3細胞懸浮液中浸0. 5 3小時；使抗原卵巢癌SK0V-3細胞與抗體1連接；(3)通過特異性吸附將探針DNA寡核苷酸-anti-HER2生物結(jié)合體吸附到步驟(2)處理后的電極表面；再雜交互補DNA，得到雜交后的修飾電極；所述探針DNA寡核苷酸-anti-HER2生物結(jié)合體的制備包括以下步驟將anti-HER2的抗體加入到含有探針DNA寡核苷酸和偶聯(lián)劑的磷酸緩沖液中，反應(yīng)2 5小時；(4)將步驟( 雜交后的修飾電極在電化學(xué)指示劑溶液中浸泡2 10分鐘后清洗。
2.權(quán)利要求1所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟(1)所述氧化態(tài)的石墨烯溶液濃度為0. 5 ％ig/ml ；氧化態(tài)的石墨烯制備方法為將石墨烯在硝酸和鹽酸的混合液中超聲2 6小時，洗滌至中性。
3.權(quán)利要求1所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟(1)所述的電極為玻碳電極。
4.權(quán)利要求1所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟( 所述偶聯(lián)劑混合液為含有200 800mmol/L 1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和80 200mmol/L N-羥基硫代琥珀酰亞的溶液；所述抗體1溶液濃度為2 50 μ g/mL0
5.權(quán)利要求1所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟C3)所述的偶聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽濃度為，N-羥基硫代琥珀酰亞胺濃度為；磷酸緩沖液的PH值為7 7. 5。
6.權(quán)利要求1所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟⑷所述的電化學(xué)指示劑為柔紅霉素，濃度為5X 10_6 5X 10_5mol/L。
7.一種檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器，其特征在于，通過權(quán)利要求1 6任一項所述的方法制備。
8.一種檢測卵巢癌SK0V-3細胞的方法，其特征在于，以權(quán)利要求5所述的電化學(xué)傳感器作為工作電極，用電化學(xué)方法檢測所產(chǎn)生的電流，電解液為PH7 7. 5的磷酸緩沖液。
9.權(quán)利要求8所述檢測卵巢癌SK0V-3細胞的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟(5)所述的電化學(xué)方法為循環(huán)伏安法、阻抗法或脈沖伏安法。
全文摘要
本發(fā)明屬于分析化學(xué)和化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于診斷卵巢癌SKOV-3細胞的電化學(xué)傳感器。涉及基于石墨烯和DNA標(biāo)記抗體的三明治型免疫傳感器的制法和醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用。利用石墨烯/抗體/抗原/DNA標(biāo)記抗體/互補DNA的修飾玻碳電極，基于鳥嘌呤堿基和腺嘌呤堿基的催化氧化反應(yīng)間接測定抗原(人類卵巢癌)。此傳感器不僅利用了石墨烯的電子高傳導(dǎo)性，而且降低了抗體標(biāo)記物的高成本。在此基礎(chǔ)上制備的免疫傳感器還能用于其它種類細胞的檢測，用途廣泛。該傳感器靈敏度高、制備簡單，可用于任意種類癌細胞的檢測，在醫(yī)學(xué)診斷中有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/574GK102288656SQ20111012752
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者卜揚, 黃杉生 申請人:上海師范大學(xué)