專利名稱：時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)試紙條及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測(cè)的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前的免疫層析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速檢測(cè)試紙條多以膠體金、彩色乳膠微球或者熒光素作為標(biāo)記物。基于膠體金標(biāo)記技術(shù)開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)產(chǎn)品，存在靈敏度低，只能定性或者半定量，批間差異較大等問(wèn)題；彩色乳膠微球雖然批間差有所改進(jìn)，但靈敏度依然較低，也只能定性或半定量；基于熒光素標(biāo)記技術(shù)的免疫層析靈敏度有了較大提高，也能進(jìn)行定量檢測(cè)，但是由于樣本中含有較高的熒光本底信號(hào)，且Stock位移較小，會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生較大的影響。時(shí)間分辨熒光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一種非同位素?zé)晒鈽?biāo)記物， 與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，可以有效的避免樣品中的本底熒光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。本發(fā)明將時(shí)間分辨熒光乳膠微球標(biāo)記和免疫層析兩大技術(shù)結(jié)合，得到時(shí)間分辨熒光免疫層析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay，TRF-LFIA)，幵發(fā)出能夠精確定量的快速免疫層析檢測(cè)試紙條。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)于傳統(tǒng)的免疫層析膜組合方式進(jìn)行了改進(jìn)，將原有的四層甚至五層膜系統(tǒng)改變成三層膜系統(tǒng)。傳統(tǒng)的免疫層析膜組合方式包括樣品墊、濾血膜、結(jié)合墊、分離膜(硝酸纖維素膜)、吸水墊等四到五層(四層則沒(méi)有濾血功能或者將濾血功能與樣品墊功能組合)。GE 公司旗下Whatman開(kāi)發(fā)了具有五合一功能的膜Fusi0n5，集合了上述五種膜的功能，但 Fusion5由于孔徑較大，抗體難以固定，需要制備特殊的Stone用于固定抗體，生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，儀器設(shè)備要求較高，開(kāi)發(fā)的免疫層析試劑只能用于定性檢測(cè)。本發(fā)明利用FUsi0n5替代傳統(tǒng)的樣品墊、濾血膜、結(jié)合墊，將原有的四層甚至五層膜系統(tǒng)簡(jiǎn)化，開(kāi)發(fā)出只需要三層膜結(jié)構(gòu)的快速定量免疫層析檢測(cè)試紙，不僅使生產(chǎn)工藝得到了簡(jiǎn)化，而且有效的降低了產(chǎn)品的批內(nèi)差和批間差，提高了檢測(cè)靈敏度，極具實(shí)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種新型的、能快速定量檢測(cè)的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明一方面公開(kāi)了一種時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)試紙條，該試紙條包括 Fusi0n5膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙三部分。硝酸纖維素膜位于中間，F(xiàn)usi0n5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端。其中，F(xiàn)usi0n5膜上設(shè)有加樣區(qū)和微球區(qū)，微球區(qū)上載有時(shí)間分辨熒光微球；硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，T線接上包被抗體或抗原，C線包被親和素或鏈霉親和素。所述時(shí)間分辨熒光微球，包括檢測(cè)微球和質(zhì)控微球，檢測(cè)微球?yàn)楸砻姘挥嗅槍?duì)待測(cè)抗原的單抗或者多抗的熒光微球，或者檢測(cè)微球?yàn)楸砻姘挥嗅槍?duì)待測(cè)抗體的抗原的熒光微球；質(zhì)控微球?yàn)楸砻姘挥猩锼貥?biāo)記蛋白的熒光微球。所述熒光微球中填充了鑭系元素化合物；較優(yōu)的，該鑭系元素螯合物為銪螯合物； 最優(yōu)的，該銪螯合物可為Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Wien。所述生物素標(biāo)記蛋白可以是任何一種不影響生物素/鏈霉生物素與親和素的結(jié)合，并可被生物素標(biāo)記的蛋白。較優(yōu)的，所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。優(yōu)選的，所述時(shí)間分辨熒光微球粒徑范圍為100 lOOOnm。硝酸纖維素膜上，T線上包被的抗體為針對(duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗，或者為針對(duì)待測(cè)抗體的抗原的單抗或多抗；T線上包被的抗原為待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)性抗原。優(yōu)選的，所述時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試紙條底部設(shè)有塑料底板。本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)試紙條的制備方法， 包括以下步驟(1)質(zhì)控微球制備1)用生物素標(biāo)記蛋白；幻采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球。(2)檢測(cè)微球制備采用針對(duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗、或者采用針對(duì)待測(cè)抗體的抗原，包被醛基修飾的熒光微球。(3)空白大卡粘貼在帶有背膠的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘貼硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素膜左右兩端分別粘貼吸水紙和Fusi0n5膜。(4)噴膜將質(zhì)控微球和檢測(cè)微球采用釋放緩沖液混合稀釋到一定濃度，噴到Fusion膜的微球區(qū)；T線溶液和C線溶液稀釋，分別噴到硝酸纖維素膜的T線和C線。(5)干燥及切條將上述噴好試劑的大卡烘干、切條。較優(yōu)的，步驟中用到的釋放緩沖液含有10 40%蔗糖、3 10%海藻糖、 0. 5 N，O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)、0. 2 0. 5%慶大霉素。較優(yōu)的，步驟中檢測(cè)微球終濃度0. 5 2mg/ml，質(zhì)控微球終濃度0. 05 0. 2mg/ml ；T線抗原或則抗體終濃度0. 5 2mg/ml，親和素或鏈霉親和終濃度0. 5 ^iig/ ml ；C、T線噴膜液量為0. 5 2 μ 1/cm,微球噴膜量為2 8 μ 1/cm。較優(yōu)的，步驟(5)中所述的烘干可在恒溫烘箱或者烘房中，37°C烘干6 M小時(shí)。本發(fā)明第三方面公開(kāi)了一種時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)試紙條的應(yīng)用。本發(fā)明的試紙條可通過(guò)雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法原理測(cè)定生物分子，適用于所有的采用雙抗體夾心法模式或競(jìng)爭(zhēng)法模式的免疫層析檢測(cè)。雙抗體夾心法待測(cè)樣品通過(guò)層析作用與包被有抗體的時(shí)間分辨熒光納米微球(檢測(cè)微球)結(jié)合，在毛細(xì)作用下，依次通過(guò)Fusion、硝酸纖維素膜，并與硝酸纖維素膜T 線上固定的另一抗體結(jié)合，形成雙抗體免疫夾心復(fù)合物。在層析過(guò)程中，質(zhì)控微球(表面包被有生物素，混合在檢測(cè)微球中)也隨著樣品的移動(dòng)而前進(jìn)，并在硝酸纖維素膜C線位置被固定的親和素捕獲，在緩沖液沖洗下，未反應(yīng)的微球繼續(xù)移動(dòng)到吸水墊位置。T線位置捕獲的微球量與待測(cè)樣品中的抗原濃度成正相關(guān)，而C線位置捕獲的質(zhì)控微球通常是固定的。 通過(guò)時(shí)間分辨熒光讀條儀對(duì)T、C線信號(hào)進(jìn)行掃描，根據(jù)T線信號(hào)與待測(cè)抗原濃度成正相關(guān)， 獲得待測(cè)樣品中待測(cè)抗原濃度。競(jìng)爭(zhēng)法待測(cè)樣品中的抗原分子通過(guò)層析作用與過(guò)量的標(biāo)記有抗體的時(shí)間分辨熒光納米微球(檢測(cè)微球)結(jié)合，在毛細(xì)作用下，依次通過(guò)Fusion、硝酸纖維素膜，未結(jié)合抗原的檢測(cè)微球與硝酸纖維素膜T線上固定的競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。在層析過(guò)程中，質(zhì)控微球(表面包被有生物素，混合在檢測(cè)微球中)也隨著樣品的移動(dòng)而前進(jìn)，并在硝酸纖維素膜C線位置被固定的親和素捕獲，在緩沖液沖洗下，未反應(yīng)的微球繼續(xù)移動(dòng)到吸水墊位置。T線位置捕獲的微球量與待測(cè)樣品中的抗原濃度成負(fù)相關(guān)，而C線位置捕獲的質(zhì)控微球通常是固定的。通過(guò)時(shí)間分辨熒光讀條儀對(duì)T、C線信號(hào)進(jìn)行掃描，根據(jù)T線信號(hào)與待測(cè)抗原濃度成負(fù)相關(guān)，獲得待測(cè)樣品中待測(cè)抗原濃度。本發(fā)明的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條靈敏度高，批內(nèi)精密度可達(dá)10%左右，批間精密度可達(dá)15 %，可同時(shí)檢測(cè)全血、血清、血漿、尿液樣本，250mg/dL血紅蛋白、500mg/dL 甘油三酯、10mg/dL膽紅素對(duì)本試紙條的檢測(cè)無(wú)影響，遠(yuǎn)超過(guò)市場(chǎng)上大多數(shù)免疫層析快速診斷產(chǎn)品。


圖1 本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖(1.塑料底板2.Fusi0n5膜3.硝酸纖維素膜 4.吸水紙5.加樣區(qū)6.微球區(qū)7. T線區(qū)8. C線區(qū))圖2 :CRP試紙條檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3 新喋呤試紙條檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明，而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1生物素標(biāo)記Y-球蛋白(BGG)包被的質(zhì)控微球的制備(1)生物素標(biāo)記的BGG的制備用0. IM NaCNBH3 將 BGG (購(gòu)自 Pel-Freez Biological)配制成 10mg/ml 溶液，采用DMSO( 二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS (N-羥基琥珀酰亞胺修飾生物素，生產(chǎn)商 SIGMA，產(chǎn)品號(hào):B3295)溶液至 16. 17ang/ml，按照 Img 抗體加入 5. 4ul Biotin-X-X-NHS 的量將Biotin-X-X-NHS液加入到BGG溶液中，混合均勻并在4°C下放置過(guò)夜。采用透析法除去游離未反應(yīng)的生物素，透析液為生物素標(biāo)記抗體透析緩沖液(0. IM Tris,0. 3MNaCl, 0. 005MEDTA-Na-2H20, pH8. 0)。透析完畢，BCA法測(cè)定蛋白濃度。(2)采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的發(fā)光微球向IOmg醛基修飾的熒光微球[博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司]中加入6.4μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg上述(1)中透析得到的生物素標(biāo)記蛋白以及16 μ 1的 NaCNBH3(25mg/ml,0. 05M pH6. 0 的 MES 緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，補(bǔ)加 0. IM pH6. OMES 至總體積為400 μ 1，37°避光孵育48h。加入40μ 1的Gly溶液(75mg/ml，0. 05M pH6. 0的 MES緩沖液配制)，37°避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h。加250 μ 1 N, 0-雙三甲硅基乙酰胺QOOmg/ml， 0. 05M pH6. O的MES緩沖液配制)溶液。37°避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16h。4°C 13000g離心30分鐘。棄上清，用Iml pH6. O的MES緩沖液再洗兩次。用Iml 0. 05M pH8. O的HEPES緩沖液 (50mM HEPES,300mM NaCl, 25mMEDTA-Na-2H20,1.6% N, O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA), 0. 1% Dextran,0. 1% Tween-20,0. 3745% TritonX-405,0. 01%慶大霉素，0· 05% Proclin)懸浮 (其終濃度為10mg/ml)。(3)質(zhì)控微球工作液配制根據(jù)工作需要，采用0. 05M pH8. O的HEPES緩沖液將(2)中懸液稀釋到相應(yīng)濃度， 分裝保存。實(shí)施例2生物素標(biāo)記小牛血清白蛋白(BSA)包被的質(zhì)控微球的制備(1)生物素標(biāo)記小牛血清白蛋白(BSA)的制備用0. IM NaCNBH3將小牛血清白蛋白(購(gòu)自EQUITECH-BIO INC)配制成10mg/ml溶液，采用DMSO ( 二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS (N-羥基琥珀酰亞胺修飾生物素，生產(chǎn)商SIGMA，產(chǎn)品號(hào):B3295)溶液至 16. 17ang/ml，按照 Img 抗體加入 13. 5ulBiotin-X-X_NHS 的量將Biotin-X-X-NHS液加入到小牛血清白蛋白溶液中，混合均勻并在4°C下放置過(guò)夜。 采用透析法除去游離未反應(yīng)的生物素，透析液為生物素標(biāo)記抗體透析緩沖液(0. IM Tris, 0. 3M NaCl,0. 005M EDTA-Na_2H20，pH 8. 0)。透析完畢，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 (2)采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球包被方法與實(shí)例1中O)同。(3)質(zhì)控微球工作液配制配制方法與實(shí)例1中(3)同。同理，還可以采用生物素標(biāo)記的其他蛋白包被熒光微球來(lái)制備質(zhì)控微球。實(shí)施例3 C反應(yīng)蛋白(CRP)時(shí)間分辨熒光免疫試紙條1.試紙條成分的制備(1)質(zhì)控微球的制備質(zhì)控微球的制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。(2)檢測(cè)微球的制備向IOmg醛基修飾的熒光微球(博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司)中加入6. 4 μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司) 以及16 μ 1的NaCNBH3(25mg/ml,0. 05M ρΗ6· O的MES緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，補(bǔ)加0. IM pH6. OMES至總體積為400 μ 1，37°避光孵育48h。加入40 μ 1的Gly溶液(75mg/ml,0. 05M PH6.0的MES緩沖液配制)，37°避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)濁。加250 μ 1 N，O-雙三甲硅基乙酰胺 (200mg/ml，0. 05Μ pH6. O的MES緩沖液配制)溶液。37°避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16h。4°C 13000g離心30分鐘。棄上清，用Iml pH6. O的MES緩沖液再洗兩次。用Iml 0. 05M pH8. O的HEPES 緩沖液(5OmM HEPES,300mMNaCl,25mM EDTA-Na-2H20,1. 6% N，O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)， 0. 1% Dextran,0. 1 % Tween-20,0. 3745% TritonX-405,0. 01%慶大霉素，O. 05% Proclin)懸浮(其終濃度為10mg/ml)。(3)微球溶液的配制用釋放緩沖液(含有20%蔗糖、5%海藻糖、0.5% N，O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)、 0. 3%慶大霉素)將質(zhì)控微球和檢測(cè)微球配制成微球混合液，質(zhì)控微球終濃度為0. 2mg/ml, 檢測(cè)微球終濃度為lmg/ml。(4)檢測(cè)線(T線)溶液的配制用IOmM PB溶液將CRP單克隆抗體稀釋成lmg/ml。(5)質(zhì)控線(C線)溶液的配制用IOmM PB溶液將親和素稀釋成0. 5mg/ml。2.試紙條的制備(1)空白大卡粘貼按照附圖1的膜組合方式，在帶有背膠的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘貼硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素膜左右兩端分別粘貼吸水紙和Fusi0n5膜。⑵噴膜分別在圖1中T線7、C線8位置噴上T、C線溶液，T、C線噴膜液量為Ιμ /cm;在圖1中6位置噴上微球溶液，微球溶液噴膜量為4 μ 1/cm。(3)烘干將步驟O)中噴好試劑的大卡在恒溫烘箱中37°C烘干M小時(shí)。(4)切條及裝卡將烘干的CRP大卡切割成4mm寬度的紙條，裝配到塑料殼中，形成C反應(yīng)蛋白檢測(cè)板。3.試紙條的定量檢測(cè)(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制在制備好的CRP試紙條(批號(hào)2009032 加樣區(qū)中加入不同濃度的CRP抗原標(biāo)準(zhǔn)品(取六個(gè)不同的濃度，分別為O、1、10、20、100、200mg/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù))，滴加上樣緩沖液(PBS，含有1.6% N, O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)，O. 1 % Tween20，防腐劑)，膜層析10分鐘以后，儀器讀取C、T線信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表1 表1 CRP標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，包括Fusi0n5膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙三部分，硝酸纖維素膜位于中間，F(xiàn)usi0n5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端，F(xiàn)usion5膜上有加樣區(qū)和微球區(qū)，微球區(qū)上載有時(shí)間分辨熒光微球；硝酸纖維素膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線上包被抗體或抗原，質(zhì)控線上包被親和素或鏈霉親和素。
2.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述時(shí)間分辨熒光微球包括檢測(cè)微球和質(zhì)控微球，檢測(cè)微球?yàn)楸砻姘挥嗅槍?duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗的熒光微球，或者檢測(cè)微球?yàn)楸砻姘挥嗅槍?duì)待測(cè)抗體的抗原的熒光微球；質(zhì)控微球?yàn)楸砻姘挥猩锼貥?biāo)記蛋白的熒光微球。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征在于，所述時(shí)間分辨熒光微球的粒徑范圍為 100 lOOOnm。
4.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述檢測(cè)線上包被抗體為針對(duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗，或者為針對(duì)待測(cè)抗體的抗原的單抗或多抗；檢測(cè)線上包被抗原為待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)性抗原。
5.一種如權(quán)利要求1所述的試紙條的制備方法，其制備步驟如下(1)質(zhì)控微球制備a)用生物素標(biāo)記蛋白；b)采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球；(2)檢測(cè)微球制備采用針對(duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗，或者采用針對(duì)待測(cè)抗體的抗原， 包被醛基修飾的熒光微球；(3)空白大卡粘貼將硝酸纖維素膜粘貼在塑料底板中間，F(xiàn)usion膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端；(4)噴膜將質(zhì)控微球和檢測(cè)微球采用釋放緩沖液混合稀釋到一定濃度，噴到Fusion 膜的微球區(qū)；T線溶液和C線溶液稀釋，分別噴到硝酸纖維素膜的T線和C線；(5)干燥及切條。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟中釋放緩沖液組成為10 40%蔗糖、3 10%海藻糖、0. 5 N，0-雙三甲硅基乙酰胺、0. 2 0. 5%慶大霉素。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)稀釋后檢測(cè)微球終濃度為 0. 5 2mg/ml，質(zhì)控微球終濃度0. 05 0. 2mg/ml ；T線抗原或抗體終濃度0. 5 2mg/ml， 親和素或鏈霉親和素終濃度0. 5 2mg/ml ；C、T線噴膜液量為0. 5 2 μ 1/cm,微球噴膜量為 2 8μ 1/cm。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中烘干條件為37°C烘干6 24小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述的試紙條的應(yīng)用，其特征在于，該試紙條用于采用雙抗體夾心法模式或競(jìng)爭(zhēng)法模式的免疫層析的定量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)試紙條及其制備方法和應(yīng)用。該試紙條由Fusion5膜、硝酸纖維素膜和吸水紙三部分組成，通過(guò)雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法原理，利用時(shí)間分辨熒光微球作為免疫標(biāo)記物，對(duì)待測(cè)抗原或抗體進(jìn)行準(zhǔn)確快速的定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102192983SQ20111013014
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者吳茜, 王海蛟, 石曉強(qiáng), 趙衛(wèi)國(guó), 馬順華 申請(qǐng)人:博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司