專利名稱：一種高效提取土壤樣品中磷脂脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸(PLFA)的方法。
背景技術(shù)：
磷脂脂肪酸(PLFA)提取技術(shù)的發(fā)展，首先是脂類物質(zhì)提取技術(shù)的發(fā)展。早在20世紀(jì)60年代以前，科學(xué)家們就在嘗試著建立測(cè)定食品中脂類物質(zhì)的方法，但是，當(dāng)時(shí)的方法并不十分令人滿意，存在著提取時(shí)間長(zhǎng)、提取劑消耗大和只能提取部分脂類等缺點(diǎn)。1956年，Bligh和Dyer首次提出了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速地提取魚類中脂類物質(zhì)的方法,但是，Blight和Dyer的方法在當(dāng)時(shí)僅限于食品，特別是魚類的磷脂提取中，并未被應(yīng)用于土壤。并且，這 個(gè)方法只能確定總脂類的含量，而如果只知道總脂類的含量，不能達(dá)到對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的目的。White和Tunlid等在20世紀(jì)70年代末和80年代初發(fā)展了磷脂脂肪酸分析技術(shù)。White等分析了河口和海底沉積物中磷脂的含量，并與ATP和DNA合成等表沉積物微生物量的方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為磷脂可以作為表征微生物生物量的一個(gè)指標(biāo)。同時(shí)，還提出了該方法可以根據(jù)脂類物質(zhì)的組成，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。但是，他們并未對(duì)具體的脂肪酸進(jìn)行測(cè)定。Tunlid等在《加拿大微生物學(xué)雜志》上發(fā)表的文章具有現(xiàn)代PLFA分析技術(shù)的雛形。他們利用磷脂脂肪酸技術(shù)對(duì)油菜根際微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定量分析，促進(jìn)了 PLFA在土壤環(huán)境學(xué)中的應(yīng)用。但上述磷脂脂肪酸分析技術(shù)存在諸多的不足，在以往的方法中采用購(gòu)買SPE柱(Supelco公司)，消耗的溶劑雖少，然而，商業(yè)SPE柱相對(duì)較貴，購(gòu)買過程復(fù)雜，對(duì)飽和脂肪酸收集效率較低，因此本發(fā)明中的自制柱可以在降低試驗(yàn)成本的基礎(chǔ)上提高收集效率，適用于大批量土壤樣品的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案(I)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh. Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液；
(2)在上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮?dú)獯蹈?，冷凍保存?br> (3)將所述氯仿溶液加入到硅膠柱，進(jìn)行柱層析，得到磷脂脂肪酸。其中，柱層析采用的硅膠柱的制備方法為，(I)稱取200-300目硅膠，加入氯仿并充分?jǐn)嚢?，所述硅膠與氯仿的重量比為I : 2; (2)裝柱；(3)待沉降完成后，加入氯仿，并用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定，柱床被壓縮至9/10體積。進(jìn)一步地，在柱層析分離步驟中，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇，進(jìn)行磷脂脂肪酸的提取。進(jìn)一步地，鹽堿地土壤加入Bligh. Dyer提取液后，可以避光震蕩3個(gè)小時(shí)，然后以3600rpm的速度離心25分鐘。
進(jìn)一步地，上清液中加入的檸檬酸體積為4. 8ml，加入的氯仿體積為4. 8ml。通過本發(fā)明提供的提取方法，可以提高磷脂脂肪酸的收集效率，降低試驗(yàn)成本。通過本發(fā)明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效濾除脂性醇、糖脂和中性脂等雜質(zhì)，經(jīng)過壓實(shí)后的柱子可以更充分地與硅烷醇中的活性位點(diǎn)接觸而被吸附，從而得到相對(duì)較高的含量。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及到一種提取磷脂脂肪酸的方法。本發(fā)明利用自制硅膠柱來提取土壤總磷脂脂肪酸，其收集效率高、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉。具體地說，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下I.稱取6g鹽堿地土壤，放入50ml離心管。加入20ml Bligh. Dyer提取液，避光震 蕩3小時(shí)左右，然后3600rpm離心25分鐘，取上清液。同樣方法加18ml Bligh. Dyer提取液，震蕩后，再次離心，合并兩次提取液，過濾至150ml三角瓶中，加入4. 8ml檸檬酸和4. 8ml氯仿，室溫避光過夜。用甲醇或乙醇潤(rùn)洗氮吹儀針頭，第二天收集下層氯仿相于IOml試管中，N2吹干。-20°C保存。2.先用丙酮清洗玻璃管柱，然后用氯仿潤(rùn)洗。將氯仿浸泡的硅膠加入柱中(氯仿壓柱，使硅膠柱長(zhǎng)8cm左右)，三角瓶收集廢液，依次加入5cm左右的氯仿(濾出中性磷脂)，IOcm左右的丙酮(濾出醣酯類)，待丙酮消失后，加入IOcm甲醇(磷脂)，20ml試管收集甲醇液，N2吹干。-20°C保存。硅膠柱制作過程(I)稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠。(2)攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的氯仿用玻璃棒充分?jǐn)嚢琛?3)裝柱。將柱底用玻璃纖維塞緊(或玻璃柱自帶過濾纖維也可)，加入約1/3體積氯仿，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入玻璃柱內(nèi)。隨著沉降，會(huì)有一些硅膠沾在玻璃管壁內(nèi)，用氯仿將其沖入柱中。(4)壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的氯仿，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。進(jìn)行這一步可使分離度提高很多，且可以避免過柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂，這一步驟可使總的分離效率提高7.8%，其中表征細(xì)菌的16:0、il6:0、18:00飽和脂肪酸產(chǎn)量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9、18:2w6，9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不飽和脂肪酸產(chǎn)量提高了 5. 3%，放線菌沒有顯著變化。(5)上樣。濕法上樣。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一玻璃纖維塞至接近硅膠表面。然后加入大量洗脫劑，也不會(huì)沖壞硅膠表面。(6)過柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子IOmg上樣量，Ig硅膠(200-300目)，0. 5ml收一餾分；l-2g上樣量，50g硅膠(200-300目),20-50ml收一餾分。采用這種方法得到的自制柱，分離到更多的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。硅烷醇(硅膠活化后產(chǎn)生的活性部位)包含有-0H，與硅原子可以直接綁定。硅烷醇與脂質(zhì)的極性基團(tuán)相結(jié)合，從而綁定滯留了脂質(zhì)分子，脂質(zhì)的非極性基團(tuán)在分離純化過程中幾乎不起什么作用。當(dāng)磷脂經(jīng)過硅膠時(shí)，極性較小的不飽和脂肪酸在松散的自制柱中與活性位點(diǎn)接觸的可能性就減小，從而更容易被淋洗出，相反的，當(dāng)它們經(jīng)過壓實(shí)后的自制柱時(shí)，有更多機(jī)會(huì)與活性點(diǎn)接觸而被吸附，從而得到相對(duì)較高的含量。3.吹干樣加入Iml甲醇甲苯(I I)液和Iml 0. 5% KOH無水甲醇，37°C水浴30分鐘，冷卻至室溫，每個(gè)樣品中加入IOml乙酸中和，再加入2ml氯仿正己烷(I 4)和2ml超純水，靜置30分鐘分層，取上清液于IOml試管中，N2吹干。-20°C保存。4.每個(gè)樣品中加入I. 5ml內(nèi)標(biāo)，溶解后，注射器吸入，微孔過濾器過濾至GC/MS自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，上機(jī)待測(cè)。
通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過本發(fā)明提供的提取方法，磷脂脂肪酸的分離效率提高了7.8%，其中表征細(xì)菌的16:0、il6:0、18:00飽和脂肪酸產(chǎn)量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9U8:2w6,9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不飽和脂肪酸產(chǎn)量提高了 5.3%。
權(quán)利要求
1.一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液； (2)在所述上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮?dú)獯蹈桑鋬霰４妫? (3)將所述收集物溶解于氯仿后加入到硅膠柱，進(jìn)行柱層析分離，得到磷脂脂肪酸，其特征在于，所述硅膠柱的制備方法為a.稱取200-300目硅膠，加入氯仿并充分?jǐn)嚢瑁龉枘z與氯仿的重量比為I: 2; b.裝柱； c.待沉降完成后，加入氯仿，并用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定，柱床被壓縮至9/10體積。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的取上清液，其特征在于，避光震蕩3個(gè)小時(shí)，以3600rpm的速度離心25分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中加入的檸檬酸的體積為4.8ml,加入的氯仿體積為4. 8ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柱層析分離，其特征在于，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，包括以下步驟(1)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液；(2)在上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮?dú)獯蹈珊罄鋬霰４?；以?3)將收集物溶解于氯仿后加入到自制硅膠柱，進(jìn)行柱層析分離，得到磷脂脂肪酸。通過本發(fā)明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效濾除脂性醇、糖脂和中性脂，經(jīng)過壓實(shí)后的柱子可以更充分的與硅烷醇中的活性位點(diǎn)接觸而被吸附，從而得到相對(duì)較高的含量，通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)磷脂脂肪酸總量的分離效率提高了7.8％。
文檔編號(hào)G01N1/40GK102798566SQ201110133719
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者李明, 孫兆軍, 王金枝, 姜麗麗, 王艷芬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院研究生院