專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的檢測技術(shù)，特別涉及一種基于雙標記自淬滅探針的探針熔解曲線分析技術(shù)用于檢測結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變。
背景技術(shù)：
20世紀80年代以來，結(jié)核病疫情重新上升，成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴重的傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年新增 800萬病人，死亡200 300萬人，是目前死亡率最高的傳染性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的評估，我國是世界上22個結(jié)核病高負擔國家之一，患者人數(shù)僅次于印度，居全球第二位。今年召開的第二屆全球遏制結(jié)核病伙伴論壇大會上，將我國列在需要特別引起警示的國家和地區(qū)的第一位。喹諾酮類藥物是一類人工化學合成抗菌藥，由于該類藥物均具有4-喹諾酮母核的基本結(jié)構(gòu)，故由此命名。氟諾喹酮類在喹諾酮母核的第六6位上引入氟，第7位上引入哌嗪基或吡咯啉基的衍生物，為第3代喹諾酮產(chǎn)品。已用于臨床抗分枝桿菌的氟喹諾酮類藥物有環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，氧氟沙星(Ofloxacin，0FL)，左氧氟沙星 (Levof loxacin，LEV)，斯帕沙星(Sparf loxacin，SPX)，加替沙星(Gatif loxacin，GAT)，莫西沙星(Moxifloxacin，Μ0Χ)等。隨著喹諾酮類抗菌藥物在結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染中使用的增多，結(jié)核分枝桿菌對該類抗菌藥物的耐藥率逐漸上升。因此，對氟喹諾酮耐藥突變的檢測已成為必要。目前，臨床上采用的耐藥檢測方法可分為表型檢測和基因檢測兩類，并以表型檢測為主。表型檢測中的常規(guī)藥敏試驗方法、BACTEC TB-460液體培養(yǎng)基藥敏試驗方法以及噬菌體生物擴增法已應(yīng)用于臨床，然而這些方法都有明顯的局限性。常規(guī)藥敏試驗方法受結(jié)核桿菌生長緩慢影響，需要6 8周甚至更長時間才能得到結(jié)果。BACTEC TB-460液體培養(yǎng)基藥敏試驗方法雖較靈敏，速度較快，但需昂貴設(shè)備，且易受雜菌污染，并有放射性危害。噬菌體生物擴增法則受干擾因素多，且操作復雜。由于目前的表型檢測難以形成高效準確的檢測手段，常常造成病情延誤，更難以實現(xiàn)追蹤治療。已有的基因型檢測方法 W DNA IlJ^5 (1、Dauendorffer, JN, Guillemin I， Aubry A et al, Identification of mycobacterial species by PCR sequencing of quinolone resistance-determining regions of DNA gyrAse genes. J Clin Microbiol. 2003,41 :1311-1315.)，線性雜交法 (2、Giannoni F, Iona Ε, Sementilli F et al. Evaluation of a new line probe assay for rapid identification of gyrA mutations in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2005,49 :2928-2933.), PCR-SSCP Tj 法(3、 Cheng AF, Yew WW, Chan Eff et al.Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2004,48 :596-601), DHPLC 方法(4、Shi R, Otomo K, Yamada H et al. Temperature-mediated heteroduplexanalysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC, SURVEYOR nuclease. Microbes Infect. 2006，8 :128-135)，生物芯片法(5、Antonova 0V, Gryadunov DA, Lapa SA et al. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchips. Bull Exp Biol Med. 2008，145 :108-113)，實時 PCR 方法(6、van Doorn H R，An DD, de Jong MD et al. Fluoroquinolone resistance detection in Mycobacterium tuberculosis with locked nucleic acid probe real-time PCR. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008,12 :736-742) 等，德國HAIN公司已有可檢測gyrA基因突變的GenoType MTBDRs 1試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、靈敏、特異的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，即一種基于雙標記自淬滅探針的探針熔解曲線分析技術(shù)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速、靈敏、特異的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒。所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法包括以下步驟1)提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA ；2)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥決定區(qū)OiRDR)，利用引物設(shè)計軟件ft~imer 5 設(shè)計引物和探針；在步驟2、中，所述設(shè)計引物和探針的具體方法如下a，引物設(shè)計在所檢測的突變兩端，探針覆蓋突變位點；b，探針的熒光基團可選擇FAM、R0X,HEX, CY5、ΤΕΤ、CAL-Fluor等中的任意一種，淬滅基團可選擇BHQ或Dabcyl等，探針可以進行各種類型的修飾(如LNA標記)等。所述引物和探針的具體序列為Primer-F 5' -CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3，Primer-R 5’ -GACCAGGGCTGGGCCATG-3’Probe-A 5‘ -FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3‘3)構(gòu)建單管單色實時PCR體系，進行結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的PCR檢測， 比較所檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線的熔點0 值)的差異，判斷樣品是否發(fā)生突變， 樣品的熔點與陽性對照的熔點一致(誤差不超過rc)時判定為野生型，試驗菌株對氟喹諾酮敏感；樣品的熔點低于陽性對照至少2°C時判定為突變型，試驗菌株對氟喹諾酮耐藥。在步驟3)中，所述單管單色實時PCR體系可為含有IXPCR buffer (IOmM Tris-HCl, pH8. 6,50mM KC1，5% 甘油)，2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM,2U Taq,0. OlU UNG,0. 8 μ M Primer-R,0. 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe-A。有經(jīng)驗的人也可選擇其它類型的buffer，或者通過優(yōu)化找到更為合適的buffer 類型。取結(jié)核分枝桿菌樣本5μ 1 DNA作為模板，并取濃度為IO4Copies/μ 1的陽性質(zhì)粒作為陽性對照，雙蒸水做為陰性對照；
所述PCR的反應(yīng)程序為第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，65°C 20s (每個循環(huán)降低 1°C )，78°C 25s，10 個循環(huán)；第三步95°C10s, 55°C 20s, 78°C 25s, 40 個循環(huán)，65°C 20s 處收集熒光信號；第四步95°Canin ；第五步40°C2min ；第六步45 85 °C，每1°C收集熒光信號，選用FAM熒光通道。本發(fā)明檢測了 279個臨床樣本，包括270份敏感菌株和9份耐藥菌株。關(guān)于雜合結(jié)果的判讀，分3種情況①當樣本出現(xiàn)雙峰時，即為雜合樣本；②樣本為一個熔合峰，與陽性對照的熔點一致，但峰型跟陽性對照的峰型有較大差異，在有可能出現(xiàn)突變峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣本；③樣本為一個熔合峰，為突變?nèi)埸c，但在野生峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣本。雜合樣本對氟喹諾酮耐藥，建議出現(xiàn)雜合樣本時將樣本重復檢測，以確定樣本耐藥性。所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒設(shè)有盒體、擴增試劑、 TB酶混合液、FQ陽性對照、TB陰性對照和TB DNA提取液；擴增試劑、TB酶混合液、FQ陽性對照、TB陰性對照和TB DNA提取液放置在盒體內(nèi)；所述擴增試劑為FQ PCR Mix，其成分為 IXPCR buffer(IOmM Tris-HCl，pH8. 6， 50mM KCl，5 % 甘油)，2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM，dUTP 0. 4mM,0. 8μΜ Primer-R,0. 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe_A。所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG。所述FQ陽性對照為FQ野生型標準質(zhì)粒，TB陰性對照可選自TB DNA提取液、H2O, Tris或生理鹽水等。所述TB DNA提取液的成分為乙二胺四乙酸二鈉、Tris和TritonX_100。采用所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒對標本的檢驗方法包括以下步驟1)試劑準備——配液區(qū)①首先將所有的試劑從冰箱取出并平衡至室溫。PCR反應(yīng)液配液標準為取 nX 19. 6 μ LFQ PCR Mix和nX0.4yL TB酶混合液a加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在_20°C并在4h內(nèi)使用。②PCR反應(yīng)液的分裝，將PCR反應(yīng)液以每管20 μ L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管。③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至提取間。貯存在-20°C直至樣品提取處理完畢。2)樣品提取及加樣——提取區(qū)①固體培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標準接種環(huán)收集細菌1環(huán)，并懸在 250 μ L TB DNA提取液中。液體培養(yǎng)基中生長的結(jié)核分枝桿菌取lmL，IOOOOrpm離心15min， 丟棄上清并在250 μ L TB DNA提取液中重懸細菌。②封口膜封口，99°C加熱20min。14000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新1. 5mL離心
管。上清即為PCR擴增模板。(模板可保存于-20°C，并于1個月內(nèi)完成試驗。注意不要反復凍融樣品。)
③用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰/陽性對照品 5uL0立即蓋嚴管蓋。④將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴增區(qū)。3) PCR擴增-擴增區(qū)①儀器的程序設(shè)定如下第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，65°C 20s (每個循環(huán)降低 1°C )，78°C 25s，10 個循環(huán)；第三步95°C10s, 55°C 20s, 78°C 25s, 40 個循環(huán)；第四步95°Canin ；第五步40°Canin ；第六步45 85 °C，每1°C收集熒光信號，選用FAM熒光通道。②程序運行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管(閉管)取出放入凹凸袋，將封口封嚴，按污染源處理。(3)試劑盒的參考值(參考范圍)陽性對照，即野生型的Tm值范圍反應(yīng)體系中FAM通道野生型對照峰的Tm值為 71°C 士 1°C。其中Tm值是在特定Bio-Rad CFX96儀器上所得的常見值，作為參考。當使用其它儀器時，Tffl值可能略有變動，以當次試驗陽性對照(野生型)所得的Tm值為準。Tm值以儀器自動判讀所得為準，當儀器給出一個以上Tm值時，請參考陽性對照和陰性對照的峰型選擇有效Tm值。當出現(xiàn)儀器無法自動給出Tm值的情況時，可通過調(diào)整基線或直接人工判讀的方法獲得Tm值。(4)結(jié)果判讀通過比較所檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線的熔點(Tm值)的差異判斷樣品是否發(fā)生突變。樣品的熔點與陽性對照的熔點一致(誤差不超過rc)時判定為野生型，試驗菌株對氟喹諾酮敏感；樣品的熔點低于陽性對照2°C及以上時(ΔΤω > 2°C )判定為突變型，試驗菌株對氟喹諾酮耐藥。關(guān)于雜合樣品結(jié)果的判讀當熔解曲線出現(xiàn)雙峰或融合峰時即為雜合樣品，分3 種情況①當樣品出現(xiàn)雙峰時，即為雜合樣品；②樣品為一個融合峰，與陽性對照的熔點一致，但峰型跟陽性對照的峰型有較大差異，在有可能出現(xiàn)突變峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣品；③樣品為一個融合峰，為突變?nèi)埸c，但在野生峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣品。雜合樣品對氟喹諾酮耐藥，建議出現(xiàn)雜合樣品時將樣品重復檢測，以確定樣品耐藥性。實驗室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運輸、保存不當或試劑配制不準確會引起試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或檢測不準確的結(jié)果。與現(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥檢測方法相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)占.
^ \\\ ·1)引物是設(shè)計在gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)的兩端，具有高度的特異性。2)探針的設(shè)計，充分考慮了主要突變位點的重點檢測和其它突變類型的有效覆蓋，從而達到提高突變檢出率的目的。另外，探針可選擇多種類型的熒光基團和淬滅基團，并可進行各種修飾。3)通過對熔點的分析區(qū)分野生型和突變類型。野生型完全與探針序列匹配，因此熔點較高；突變型不能完全與探針序列匹配，因此熔點較野生型低，單堿基導致的突變會導致熔點2 6°C左右的下降。本發(fā)明大大提高了結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變檢測的靈敏度、特異性，大大縮短了檢測所需要的時間。


圖1為探針檢測結(jié)核分枝桿菌單堿基突變的典型結(jié)果圖。在圖1中，橫坐標為反應(yīng)溫度，縱坐標為熒光強度與溫度的負導數(shù)(-dF/dT)。曲線1，2，3，4，5分別表示突變94GAC > GCC,突變94GAC > GGC,突變90GCG > GTG,野生型，陰性對照。圖2為本發(fā)明所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒實施例結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明采用的儀器設(shè)備參見表1表權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA；2)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥決定區(qū)，利用引物設(shè)計軟件I^rimer5設(shè)計引物和探針；3)構(gòu)建單管單色實時PCR體系，進行結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的PCR檢測，比較所檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線的熔點的差異，判斷樣品是否發(fā)生突變。樣品的熔點與陽性對照的熔點一致時判定為野生型，試驗菌株對氟喹諾酮敏感；樣品的熔點低于陽性對照2°C或2°C以上時判定為突變型，試驗菌株對氟喹諾酮耐藥。
2.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，其特征在于在步驟幻中，所述設(shè)計引物和探針的具體方法如下a，引物設(shè)計在所檢測的突變兩端，探針覆蓋突變位點；b，探針的熒光基團可選擇FAM、ROX、HEX、CY5、ΤΕΤ、CAL-Fluor任意一種， 淬滅基團可選擇BHQ、Dabcyl。
3.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，其特征在于在步驟幻中，所述引物和探針的具體序列為Primer-F :5’ -CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3，Primer-R :5’ -GACCAGGGCTGGGCCATG-3’Probe-A 5' -FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3‘。
4.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，其特征在于在步驟3)中，所述單管單色實時PCR體系為含有 IXPCR buffer, 2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 2U Taq, 0. 01UUNG,0. 8μΜ of Primer-R,0. 08 μ M of Primer-F,0. 08 μ M of Probe-A ；取結(jié)核分枝桿菌樣本5μ 1 DNA作為模板，并取濃度為IO4Copies/μ 1的陽性質(zhì)粒作為陽性對照，雙蒸水做為陰性對照。
5.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法，其特征在于在步驟幻中，所述PCR的反應(yīng)程序為第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，65°C 20s (每個循環(huán)降低 1°C )，78°C 25s，10 個循環(huán)； 第三步95°C 10s，55°C 20s, 78°C 25s, 40個循環(huán)，65°C 20s處收集熒光信號； 第四步:95°C 30s ； 第五步:40°C 2min ；第六步40 85 °C，每1°C收集熒光信號，選用FAM熒光通道。
6.如權(quán)利要求1所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、擴增試劑、TB酶混合液、FQ陽性對照、TB陰性對照和TB DNA提取液；擴增試劑、TB酶混合液、FQ陽性對照、TB陰性對照和TB DNA提取液放置在盒體內(nèi)；所述擴增試劑為 FQ PCR Mix，其成分為 IXPCR buffer (IOmM Tris-HCl，pH8. 6，50mM 1((1，5%甘油)，2.01111 MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM，dUTP 0. 4mM,0. 8μΜ Primer-R, 0· 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe-A ；所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG ；所述FQ陽性對照為FQ野生型標準質(zhì)粒，TB陰性對照選自TB DNA提取液、H20、Tris或生理鹽水；所述TB DNA提取液的成分為乙二胺四乙酸二鈉、Tris和TritonX-100。
7.如權(quán)利要求6所述結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法的試劑盒對標本的檢驗方法，其特征在于包括以下步驟1)試劑準備——配液區(qū)①首先將所有的試劑從冰箱取出并平衡至室溫。PCR反應(yīng)液配液標準為取 nX 19. 6 μ LFQ PCR Mix禾PnX0· 4μ L TB酶混合液a加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒，配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在_20°C并在4h內(nèi)使用；②PCR反應(yīng)液的分裝，將PCR反應(yīng)液以每管20μ L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管；③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至提取間。貯存在-20°C直至樣品提取處理完畢；2)樣品提取及加樣——提取區(qū)①固體培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標準接種環(huán)收集細菌1環(huán)，并懸在 250 μ L TB DNA提取液中，液體培養(yǎng)基中生長的結(jié)核分枝桿菌取lmL，IOOOOrpm離心15min， 丟棄上清并在250 μ L TB DNA提取液中重懸細菌；②封口膜封口，99°C加熱20min，14000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新1.5mL離心管，上清即為PCR擴增模板；③用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰/陽性對照品 5 μ L，立即蓋嚴管蓋；④將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴增區(qū)；3)PCR擴增-擴增區(qū)①儀器的程序設(shè)定如下第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，65°C 20s，每個循環(huán)降低1°C，78°C 25s，10個循環(huán)；第三步95°C 10s，55°C 20s, 78°C 25s, 40 個循環(huán)；第四步95°C 2min ；第五步:40°C 2min ；第六步45 85 °C，每1°C收集熒光信號，選用FAM熒光通道；②程序運行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管(閉管)取出放入凹凸袋，將封口封嚴，按污染源處理；(3)試劑盒的參考值陽性對照，即野生型的Tm值范圍反應(yīng)體系中FAM通道野生型對照峰的Tm值為 71°C 士 1°C ；其中Tm值是在特定Bio-Rad CFX96儀器上所得的常見值，作為參考，當使用其它儀器時，Tffl值可能略有變動，以當次試驗陽性對照所得的Tm值為準；Tm值以儀器自動判讀所得為準，當儀器給出一個以上Tm值時，參考陽性對照和陰性對照的峰型選擇有效1值；當出現(xiàn)儀器無法自動給出Tm值的情況時，通過調(diào)整基線或直接人工判讀的方法獲得Tm值；(4)結(jié)果判讀通過比較所檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線的熔點Tm值的差異判斷樣品是否發(fā)生突變，樣品的熔點與陽性對照的熔點一致，即誤差不超過rc時判定為野生型，試驗菌株對氟喹諾酮敏感；樣品的熔點低于陽性對照至少2°c時，即ΔΤω > 2°C，判定為突變型，試驗菌株對氟喹諾酮耐藥。
全文摘要
一種結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法及試劑盒。涉及結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的檢測技術(shù)，提供一種快速、靈敏、特異的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的檢測方法及試劑盒。提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA；根據(jù)結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥決定區(qū)，設(shè)計引物和探針；構(gòu)建單管單色實時PCR體系，進行結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變的PCR檢測，比較所檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線熔點的差異，判斷樣品是否發(fā)生突變。樣品的熔點與陽性對照的熔點一致時判定為野生型，試驗菌株對氟喹諾酮敏感；樣品的熔點低于陽性對照至少2℃時判定為突變型，試驗菌株對氟喹諾酮耐藥。提高結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥突變檢測靈敏度、特異性，縮短檢測所需時間。
文檔編號G01N21/64GK102229990SQ20111013783
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者劉歆, 張軼, 李慶閣, 胡思玉 申請人:廈門大學, 廈門致善生物科技有限公司