專利名稱：鴨模擬小腸液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物模擬消化液的制備方法，尤指一種鴨模擬小腸液的制備方法。
背景技術(shù)：
我國的鴨飼養(yǎng)量占世界總量的70%以上。在鴨日糧的配制中，飼料原料的能量及氨基酸生物學(xué)效價一直是飼料配方首先需要了解的參數(shù)。然而，用生物學(xué)法測定飼料原料的代謝能及可消化氨基酸數(shù)據(jù)耗時、耗力、耗資，已成為生產(chǎn)中飼料原料基礎(chǔ)數(shù)據(jù)更新的主要技術(shù)瓶頸。長期以來，各國營養(yǎng)學(xué)家試圖通過模擬飼料在動物體內(nèi)的消化來建立一種快速定量測定飼料能量、氨基酸生物學(xué)效價的技術(shù)體系，以實現(xiàn)對飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價的實時監(jiān)測。但是這種技術(shù)體系始終沒有真正在產(chǎn)業(yè)上建立起來，一直處于實驗階段。上世紀(jì)90年代以來，歐美學(xué)者在家禽模擬小腸液的制備上是根據(jù)一定時間內(nèi)飼料的水解率達到最大時所需要的最低豬胰液素(酶)量來確定的(見參考文獻=Valdes, Ε. V. , S. Leeson. Measurement of metabolizable energy in poultry feeds by an in vitro system, Poultry Science，1992，71 :1493-1503)。由該方法制備的模擬小腸液，在消化活性上不僅難以完全重復(fù)，而且還脫離了動物體內(nèi)單位體積腸液中消化酶活性的生理水平。此外，這種方法在酶的來源上采用試劑級豬胰液素，從而導(dǎo)致消化酶的酶學(xué)特性可能與家禽體內(nèi)的相應(yīng)消化酶不同源。近年來，一些學(xué)者在動物模擬消化液的制備上又將突破點轉(zhuǎn)移到消化生理學(xué)的基礎(chǔ)理論上，以家禽小腸液的制備為研究對象，獲得了效果良好的模擬家禽小腸液。但是，這種模擬家禽小腸液的制備方法采用的是試劑級的單一消化酶，且消化酶多為豬源性或微生物來源，因此存在著酶學(xué)特性不同源的問題，而且實施成本很高，很難為畜牧企業(yè)進行飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價檢測的成本核算所接受。因此，開辟新的途徑來制備家禽模擬小腸液勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨模擬小腸液的制備方法，該方法實施成本低，生產(chǎn)工藝高效快速，可制備出與真實鴨子體內(nèi)小腸液α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4 種消化酶基本同源的鴨模擬小腸液。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案—種鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟一將從設(shè)定數(shù)量的制液用鴨子的鴨小腸中采集來的鴨小腸食糜放入一個試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入一個離心瓶中，在設(shè)定溫度下通過離心機進行離心處理，在離心處理結(jié)束后，收集該離心瓶中的上清液；步驟二 將步驟一得到的上清液過濾后，經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮成混合濃縮液；步驟三將步驟二得到的混合濃縮液經(jīng)透析袋透析去除雜質(zhì)后，冷凍干燥成凍干粉；步驟四分別測定步驟三得到的凍干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，以及測定試劑級α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性、試劑級脂肪酶中脂肪酶的活性、試劑級胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性、試劑級糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性；步驟五根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向設(shè)定重量的凍干粉中加入相應(yīng)容量的試劑級α -淀粉酶、相應(yīng)重量的試劑級脂肪酶、相應(yīng)重量的試劑級胰蛋白酶、相應(yīng)重量的試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的水溶液，以制備出鴨模擬小腸液，該制備出的鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與目標(biāo)鴨小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明制備出的鴨模擬小腸液中4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性(水解能力)與實際的鴨小腸液一樣，可做為一種模擬飼料在鴨小腸內(nèi)消化的消化液。本發(fā)明不是使用單一的試劑級消化酶(試劑級消化酶多為豬源性或微生物來源， 存在酶學(xué)特性不同源問題)來制備鴨模擬小腸液，而是主要使用真實鴨子的小腸液中的 4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)配以試劑級消化酶(試劑級 α -淀粉酶、試劑級脂肪酶、試劑級胰蛋白酶、試劑級糜蛋白酶，試劑級消化酶中所含消化酶的活性極小)來制備鴨模擬小腸液，這樣使得制備出的鴨模擬小腸液的酶學(xué)特性與實際鴨體內(nèi)小腸液基本同源。本發(fā)明采用提純的鴨小腸液凍干粉為主要原料，大大降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明可通過控制4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性來控制鴨模擬小腸液的消化能力，從而使得可對鴨模擬小腸液進行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本發(fā)明的實施成本低，生產(chǎn)工藝高效、快速，可進行鴨模擬小腸液的大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明的實現(xiàn)流程圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發(fā)明鴨模擬小腸液的制備方法包括如下步驟一至五步驟一將從設(shè)定數(shù)量的制液用鴨子的鴨小腸中采集來的鴨小腸食糜放入一個試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入一個離心瓶(如選用250毫升離心瓶)中，在設(shè)定溫度(如4°C)下通過離心機進行離心處理，在離心處理結(jié)束后，收集該離心瓶中的上清液；步驟二 將步驟一得到的上清液過濾后，經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮成混合濃縮液；步驟三將步驟二得到的混合濃縮液經(jīng)透析袋透析去除雜質(zhì)后，冷凍干燥成凍干粉；步驟四分別測定步驟三得到的凍干粉(又可稱為腸液粉劑)中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(單位重量的活性)，以及測定本次制備鴨模擬小腸液所使
4用的試劑級α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性(單位毫升的活性)、試劑級脂肪酶中脂肪酶的活性(單位重量的活性)、試劑級胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(單位重量的活性)、試劑級糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性(單位重量的活性)；步驟五根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向設(shè)定重量(一般為3 9克即可)的凍干粉中加入相應(yīng)容量的試劑級α-淀粉酶(視情況可為0，即不添加試劑級α-淀粉酶，分析見下述)、相應(yīng)重量的試劑級脂肪酶(視情況可為0， 即不添加試劑級脂肪酶，分析見下述)、相應(yīng)重量的試劑級胰蛋白酶(視情況可為0，即不添加試劑級胰蛋白酶，分析見下述)、相應(yīng)重量的試劑級糜蛋白酶(視情況可為0，即不添加試劑級糜蛋白酶，分析見下述)以及相應(yīng)容量的水溶液(可選用去離子水)，以制備出鴨模擬小腸液，且該制備出的鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。本發(fā)明中所涉及到的鴨子最好是年齡超過6周齡且體重在2公斤以上的鴨子。例如，步驟一中使用的鴨子優(yōu)選年齡超過6周齡且體重在2公斤以上的鴨子，如果鴨子太小， 就不好采集鴨小腸食糜。在步驟一中，從鴨小腸中采集鴨小腸食糜可通過如下方法實現(xiàn)對鴨子進行手術(shù)， 在鴨的小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管(參見專利號為ZL2010202574M.3的中國實用新型專利“家禽腸道食糜采集套管”)，待手術(shù)恢復(fù)十幾至幾十天(如20天)后，通過家禽腸道食糜采集套管將鴨小腸食糜收集到樣品瓶內(nèi)，樣品瓶優(yōu)選處于4 10°C的低溫條件下。 另外，對于步驟一，在實際實施中，可采用Sorvall RC-5C Plus離心機對搖勻后得到的混合物進行1250g離心，離心處理的時間控制在5 10分鐘。在步驟二中，上清液可經(jīng)由200目尼龍濾布進行過濾，冷凍干燥機對過濾后的上清液冷凍濃縮一定時間(一般為幾小時至幾十小時)，以使其冷凍濃縮1倍以上，變成混合濃縮液。在步驟三中，透析袋的截留分子量在20000道爾頓以下，混合濃縮液依次經(jīng)由pH 值在7. 0 8. 4之間的磷酸鹽緩沖液、去離子水進行透析(在磷酸鹽緩沖液、去離子水中分別透析一定時間)，或者，混合濃縮液依次經(jīng)由PH值在7. 0 8. 4之間的磷酸鹽緩沖液、蒸餾水進行透析(在磷酸鹽緩沖液、蒸餾水中分別透析一定時間)?；旌蠞饪s液經(jīng)透析后便會去除其內(nèi)的雜質(zhì)，如小分子蛋白等雜質(zhì)，然后，將透析去除雜質(zhì)的混合濃縮液冷凍干燥一定時間后，就可得到凍干粉。例如，透析袋的截留分子量可為20000道爾頓，磷酸鹽緩沖液的pH值可為7. 0。又例如，透析袋的截留分子量可為14400道爾頓，磷酸鹽緩沖液的pH值可為8. 4。又例如，透析袋的截留分子量可為100道爾頓，磷酸鹽緩沖液的pH值可為8.0。需要提及的是，透析袋的截留分子量控制在20000道爾頓以下即可達到去除雜質(zhì)的目的，若透析袋的截留分子量大于20000道爾頓，則在去除雜質(zhì)的同時會導(dǎo)致消化酶的大量損失，是不可取的。對于步驟五，鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則是指制備出的鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(每毫升溶液中) 應(yīng)分別與目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(每毫升溶液中) 相等，這樣才能用鴨模擬小腸液來模擬目標(biāo)鴨的消化情況。上述目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性可以以步驟一中用到的所有制液用鴨子為對象分別進行α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定得出(得出上述4種消化酶的活性平均值)，這樣，制備出的鴨模擬小腸液所模擬的目標(biāo)鴨就是指步驟一中用到的制液用鴨子。另外，上述目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性也可以以大量鴨子為對象分別進行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定得出 (通過大量實驗得出上述4種消化酶的活性平均值)，這樣，制備出的鴨模擬小腸液所模擬的目標(biāo)鴨就可指任意一只鴨子了。通過以大量鴨子為對象測定出的目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的平均活性分別為401. 56U/ml (活性單位/毫升)、 1. 10U/ml、108. 75U/ml、39. 01U/ml。不論是對鴨子小腸液、凍干粉進行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定，還是對試劑級α-淀粉酶中α-淀粉酶、試劑級脂肪酶中脂肪酶、試劑級胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶、試劑級糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶進行活性測定，總之，對α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定均為公知技術(shù)，其中 α -淀粉酶的活性測定可參考文獻“Dahlqvist A. A method for the determination of amylase in intestinal content[J].Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 1962，14 :145-151”中的相關(guān)描述；脂肪酶的活性測定可采用德國DiaSys公司的脂肪酶試劑盒測定方法；胰蛋白酶的活性測定可參考文獻 "ffirnt R. Trypsin, measurement with η α -p-toluenesulfonyl-l-arginine methyl ester as substrate[A]. In :Bergmeyer H U. Methods of enzymatic analysis[M]. Weinheinm =Verlag chemie. 1974”中的相關(guān)描述；糜蛋白酶的活性測定可參考文獻 "ffirnt R. Chymotrypsin, measurements with n-benzoyl-l-tyrosin ethyl ester as substrate[A]. In :Bergmeyer H U. Methods of enzymatic analysis[M]. Weinheinm Verlag chemie. 1974” 中的相關(guān)描述。在鴨模擬小腸液中，凍干粉提供的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性為主，試劑級α -淀粉酶、試劑級脂肪酶、試劑級胰蛋白酶和試劑級糜蛋白酶分別提供的相應(yīng)消化酶的活性很小，為輔。并且，對于凍干粉中活性符合要求的消化酶，就不用添加相應(yīng)的試劑級消化酶。例如，凍干粉中α-淀粉酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性分別與目標(biāo)鴨小腸液中的α-淀粉酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶的活性相等，只是脂肪酶的活性達不到目標(biāo)鴨小腸液中脂肪酶的活性的話，只需另外添加適量的試劑級脂肪酶，使配制出的鴨模擬小腸液中脂肪酶的活性等于目標(biāo)鴨小腸液中脂肪酶的活性即可。也就是說，本發(fā)明制備出的鴨模擬小腸液是在真實鴨子的小腸液中的4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、 脂肪酶)的基礎(chǔ)上補充適量的相應(yīng)試劑級消化酶(試劑級α-淀粉酶、試劑級脂肪酶、試劑級胰蛋白酶或試劑級糜蛋白酶中的任一種或任幾種，而補充的相應(yīng)試劑級消化酶中的消化酶活性值很小)來制備鴨模擬小腸液的。實施例一在20只8周齡、平均體重在3. 0公斤以上的制液用鴨子的鴨小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管，待手術(shù)恢復(fù)20天后，通過家禽腸道食糜采集套管采集鴨小腸食糜，3升的鴨小腸食糜被收集到處于4°C低溫條件下的樣品瓶內(nèi)。將收集到的3升鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入250毫升離心瓶中，在4°C條件下通過離心機進行10分鐘的1250g離心處理，離心處理結(jié)束后收集離心瓶中的上清液。將得到的上清液經(jīng)200目尼龍濾布過濾后，再經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮12小時，以使上清液冷凍濃縮1. 5倍，變?yōu)樗璧幕旌蠞饪s液。將得到的混合濃縮液轉(zhuǎn)移到截留分子量為14400道爾頓的透析袋中，先在pH7. 0 的磷酸鹽緩沖液中透析2小時，然后在去離子水中透析2小時，在進行透析去除小分子蛋白等雜質(zhì)后，再冷凍干燥48小時，得到凍干粉。根據(jù)上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4種消化酶的活性測定方法， 測定上述得到的凍干粉中4種主要消化酶的活性為α -淀粉酶，9. 93U/mg(活性單位/毫克)；脂肪酶，0.012U/mg;胰蛋白酶，3.51U/mg;糜蛋白酶，0.63U/mg。測定本次制備鴨模擬小腸液所使用的試劑級α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性為22947.41U/ml，試劑級脂肪酶中含有的脂肪酶的活性為3. 27U/mg，試劑級胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性為 170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性為0. 67U/mg，試劑級糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性為63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性為2. 34U/mg。將本次制備鴨模擬小腸液所用到的20只制液用鴨子作為目標(biāo)鴨小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定對象，測定這20只制液用鴨子體內(nèi)小腸液中的4種主要消化酶的活性平均值為α-淀粉酶，460. 92U/ml ；脂肪酶，0. 18U/ml ；胰蛋白酶，133. 44U/ml ；糜蛋白酶，35. 01U/ml。根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向3. 78克凍干粉中加入3. 39毫升的試劑級α-淀粉酶、0. 12克試劑級胰蛋白酶、0. 10克試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的去離子水，最終得到250毫升鴨模擬小腸液 (在該鴨模擬小腸液中，α -淀粉酶460. 92U/ml，脂肪酶0. 18U/ml，胰蛋白酶133. 44U/ml， 糜蛋白酶35.01U/ml。)，該鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與本次制備鴨模擬小腸液所用到的20只制液用鴨子體內(nèi)的α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用來模擬這20只制液用鴨子的消化能力。驗證在單胃動物仿生消化系統(tǒng)(參見專利申請?zhí)枮?00910078147. 1的中國發(fā)明專利申請“單胃動物仿生消化系統(tǒng)及基于該系統(tǒng)模擬單胃動物消化的方法”中的相關(guān)描述) 中，分別用100毫升制得的鴨模擬小腸液、本次制備該鴨模擬小腸液所用到的20只制液用鴨子體內(nèi)的100毫升小腸液對10克玉米進行15小時的消化，消化實驗結(jié)果為該鴨模擬小腸液與20只制液用鴨子體內(nèi)的小腸液對玉米的干物質(zhì)的消化率差異僅為0. 07%，這就證實了制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代這20只制液用鴨子來模擬這20只制液用鴨子的消化能力。實施例二在30只12周齡、平均體重在3. 2公斤以上的制液用鴨子的鴨小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管，待手術(shù)恢復(fù)25天后，通過家禽腸道食糜采集套管采集鴨小腸食糜，5升的鴨小腸食糜被收集到處于8°C低溫條件下的樣品瓶內(nèi)。將收集到的5升鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入250 毫升離心瓶中，在4°C條件下通過離心機進行8分鐘的1250g離心處理，離心處理結(jié)束后收集離心瓶中的上清液。將得到的上清液經(jīng)200目尼龍濾布過濾后，再經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮36小時，以使上清液冷凍濃縮10倍，變?yōu)樗璧幕旌蠞饪s液。將得到的混合濃縮液轉(zhuǎn)移到截留分子量為1M00道爾頓的透析袋中，先在pH7. 5 的磷酸鹽緩沖液中透析2小時，然后在去離子水中透析2小時，在進行透析去除小分子蛋白等雜質(zhì)后，再冷凍干燥48小時，得到凍干粉。根據(jù)上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4種消化酶的活性測定方法，測定上述得到的凍干粉中4種主要消化酶的活性為α -淀粉酶，10. 25U/mg ；脂肪酶，0. 015U/ mg ；胰蛋白酶，4. 12U/mg ；糜蛋白酶，0. 84U/mg。測定本次制備鴨模擬小腸液所使用的試劑級α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性為22947. 41U/ml，試劑級脂肪酶中含有的脂肪酶的活性為3. 27U/mg，試劑級胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性為170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性為0. 67U/mg，試劑級糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性為63.31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性為2. 34U/mg。將本次制備鴨模擬小腸液所用到的30只制液用鴨子作為目標(biāo)鴨小腸液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定對象，測定這30只制液用鴨子體內(nèi)小腸液中的4種主要消化酶的活性平均值為α -淀粉酶，420. 53U/ml ；脂肪酶，0. 20U/ml ；胰蛋白酶，130. 24U/ml ；糜蛋白酶，41. 50U/ml。根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向3. 33克凍干粉中加入3. 09毫升的試劑級α-淀粉酶、0. 11克試劑級胰蛋白酶、0. 12克試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的去離子水，最終得到250毫升鴨模擬小腸液 (在該鴨模擬小腸液中，α -淀粉酶420. 53U/ml，脂肪酶0. 20U/ml，胰蛋白酶130. 24U/ml, 糜蛋白酶41.50U/ml。)，該鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與本次制備鴨模擬小腸液所用到的30只制液用鴨子體內(nèi)的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用來模擬這30只制液用鴨子的消化能力。驗證在單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，分別用100毫升制得的鴨模擬小腸液、本次制備該鴨模擬小腸液所用到的30只制液用鴨子體內(nèi)的100毫升小腸液對5克豆粕進行15小時的消化，消化實驗結(jié)果為該鴨模擬小腸液與30只制液用鴨子體內(nèi)的小腸液對豆粕的干物質(zhì)的消化率差異僅為1. 02%，這就證實了制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代這30只制液用鴨子來模擬這30只制液用鴨子的消化能力。實施例三在60只18周齡、平均體重在3. 2公斤以上的制液用鴨子的鴨小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管，待手術(shù)恢復(fù)30天后，通過家禽腸道食糜采集套管采集鴨小腸食糜，5升的鴨小腸食糜被收集到處于5°C低溫條件下的樣品瓶內(nèi)。將收集到的5升鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入250 毫升離心瓶中，在4°C條件下通過離心機進行5分鐘的1250g離心處理，離心處理結(jié)束后收集離心瓶中的上清液。將得到的上清液經(jīng)200目尼龍濾布過濾后，再經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮48小時，以使上清液冷凍濃縮20倍，變?yōu)樗璧幕旌蠞饪s液。將得到的混合濃縮液轉(zhuǎn)移到截留分子量為14400道爾頓的透析袋中，先在pH7. 8 的磷酸鹽緩沖液中透析2小時，然后在蒸餾水中透析2小時，在進行透析去除小分子蛋白等雜質(zhì)后，再冷凍干燥48小時，得到凍干粉。根據(jù)上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4種消化酶的活性測定方法，測定上述得到的凍干粉中4種主要消化酶的活性為α -淀粉酶，12. 04U/mg ；脂肪酶，0. 015U/ mg ；胰蛋白酶，3. 85U/mg ；糜蛋白酶，0. 78U/mg。測定本次制備鴨模擬小腸液所使用的試劑級α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性為22947. 41U/ml，試劑級脂肪酶中含有的脂肪酶的活性為3. 27U/mg，試劑級胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性為170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性為0. 67U/mg，試劑級糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性為63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性為2. 34U/mg。將本次制備鴨模擬小腸液所用到的60只制液用鴨子作為目標(biāo)鴨小腸液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定對象，測定這60只制液用鴨子體內(nèi)小腸液中的4種主要消化酶的活性平均值為α-淀粉酶，410. 25U/ml ；脂肪酶，0. 19U/ml ；胰蛋白酶，125. 50U/ml ；糜蛋白酶，36. 47U/ml。根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向3. 15克凍干粉中加入2. 88毫升的試劑級α-淀粉酶、0. 13克試劑級胰蛋白酶、0. 08克試劑級脂肪酶以及相應(yīng)容量的去離子水，最終得到250毫升鴨模擬小腸液(在該鴨模擬小腸液中，α -淀粉酶410. 25U/ml，脂肪酶0. 19U/ml，胰蛋白酶125. 50U/ml，糜蛋白酶36. 47U/ml。)，該鴨模擬小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與本次制備鴨模擬小腸液所用到的60只制液用鴨子體內(nèi)的α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、 糜蛋白酶的活性平均值相等，可用來模擬這60只制液用鴨子的消化能力。驗證在單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，分別用100毫升制得的鴨模擬小腸液、本次制備該鴨模擬小腸液所用到的60只制液用鴨子體內(nèi)的100毫升小腸液對10克玉米-豆粕日糧進行15小時的消化，消化實驗結(jié)果為該鴨模擬小腸液與60只制液用鴨子體內(nèi)的小腸液對玉米-豆粕日糧的干物質(zhì)消化率差異僅為1. 07%，這就證實了制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代這60只制液用鴨子來模擬這60只制液用鴨子的消化能力。實施例四在25只15周齡、平均體重在3. 0公斤以上的制液用鴨子的鴨小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管，待手術(shù)恢復(fù)30天后，通過家禽腸道食糜采集套管采集鴨小腸食糜，4升的鴨小腸食糜被收集到處于4°C低溫條件下的樣品瓶內(nèi)。將收集到的4升鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入250 毫升離心瓶中，在4°C條件下通過離心機進行8分鐘的1250g離心處理，離心處理結(jié)束后收集離心瓶中的上清液。將得到的上清液經(jīng)200目尼龍濾布過濾后，再經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮30小時，以使上清液冷凍濃縮9倍，變?yōu)樗璧幕旌蠞饪s液。將得到的混合濃縮液轉(zhuǎn)移到截留分子量為14400道爾頓的透析袋中，先在pH7. 9 的磷酸鹽緩沖液中透析2小時，然后在去離子水中透析2小時，在進行透析去除小分子蛋白等雜質(zhì)后，再冷凍干燥48小時，得到凍干粉。根據(jù)上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4種消化酶的活性測定方法，測定上述得到的凍干粉中4種主要消化酶的活性為α -淀粉酶，11. 02U/mg ；脂肪酶，0. 016U/ mg ；胰蛋白酶，4. 23U/mg ；糜蛋白酶，0. 90U/mg。測定本次制備鴨模擬小腸液所使用的試劑級α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性為22947. 41U/ml，試劑級脂肪酶中含有的脂肪酶的活性為3. 27U/mg，試劑級胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性為170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性為0. 67U/mg，試劑級糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性為63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性為2. 34U/mg。將本次制備鴨模擬小腸液所用到的25只制液用鴨子作為目標(biāo)鴨小腸液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定對象，測定這25只制液用鴨子體內(nèi)小腸液中的4種主要消化酶的活性平均值為α -淀粉酶，440. 50U/ml ；脂肪酶，0. 205U/ml ；胰蛋白酶，130. 29U/ml ；糜蛋白酶，35. 08U/ml。根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向3. 20克凍干粉中加入3. 26毫升的試劑級α -淀粉酶、0. 11克試劑級胰蛋白酶、0. 09克試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的去離子水，最終得到250毫升鴨模擬小腸液(在該鴨模擬小腸液中，α -淀粉酶440. 50U/ml，脂肪酶0. 205U/ml，胰蛋白酶130. 29U/ ml，糜蛋白酶35.08U/ml。)，該鴨模擬小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與本次制備鴨模擬小腸液所用到的25只制液用鴨子體內(nèi)的α -淀粉酶、脂肪酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用來模擬這25只制液用鴨子的消化能力。驗證在單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，分別用100毫升制得的鴨模擬小腸液、本次制備該鴨模擬小腸液所用到的25只制液用鴨子體內(nèi)的100毫升小腸液對5克棉粕進行15小時的消化，消化實驗結(jié)果為該鴨模擬小腸液與25只制液用鴨子體內(nèi)的小腸液對棉粕的干物質(zhì)的消化率差異僅為0. 53%，這就證實了制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代這25只制液用鴨子來模擬這25只制液用鴨子的消化能力。實施例五在40只10周齡、平均體重在3. 0公斤以上的制液用鴨子的鴨小腸內(nèi)安裝家禽腸道食糜采集套管，待手術(shù)恢復(fù)40天后，通過家禽腸道食糜采集套管采集鴨小腸食糜，8升的鴨小腸食糜被收集到處于10°C低溫條件下的樣品瓶內(nèi)。將收集到的8升鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入250 毫升離心瓶中，在4°C條件下通過離心機進行10分鐘的1250g離心處理，離心處理結(jié)束后收集離心瓶中的上清液。將得到的上清液經(jīng)200目尼龍濾布過濾后，再經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮M小時，以使上清液冷凍濃縮4倍，變?yōu)樗璧幕旌蠞饪s液。將得到的混合濃縮液轉(zhuǎn)移到截留分子量為1M00道爾頓的透析袋中，先在pH8. 0 的磷酸鹽緩沖液中透析2小時，然后在蒸餾水中透析2小時，在進行透析去除小分子蛋白等雜質(zhì)后，再冷凍干燥48小時，得到凍干粉。根據(jù)上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4種消化酶的活性測定方法，測定上述得到的凍干粉中4種主要消化酶的活性為α -淀粉酶，15. 18U/mg ；脂肪酶，0. 012U/ mg ；胰蛋白酶，5. 14U/mg ；糜蛋白酶，0. 75U/mg。測定本次制備鴨模擬小腸液所使用的試劑級α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性為22947. 41U/ml，試劑級脂肪酶中含有的脂肪酶的活性為3. 27U/mg，試劑級胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性為170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性為0. 67U/mg，試劑級糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性為63.31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性為2. 34U/mg。將本次制備鴨模擬小腸液所用到的40只制液用鴨子作為目標(biāo)鴨小腸液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定對象，測定這40只制液用鴨子體內(nèi)小腸液中的4種主要消化酶的活性平均值為α -淀粉酶，455. 20U/ml ；脂肪酶，0. 204U/ml ；胰蛋白酶，148. 40U/ml ；糜蛋白酶，42. 52U/ml。根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向4. 25克凍干粉中加入2. 15毫升的試劑級α-淀粉酶、0. 09克試劑級胰蛋白酶、0. 12克試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的去離子水，最終得到250毫升鴨模擬小腸液 (在該鴨模擬小腸液中，α -淀粉酶，455. 20U/ml ；脂肪酶，0. 204U/ml ；胰蛋白酶，148. 40U/ ml ；糜蛋白酶，42. 52U/ml。)，該鴨模擬小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與本次制備鴨模擬小腸液所用到的40只制液用鴨子體內(nèi)的α -淀粉酶、脂肪酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用來模擬這40只制液用鴨子的消化能力。驗證在單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，分別用100毫升制得的鴨模擬小腸液、本次制備該鴨模擬小腸液所用到的40只制液用鴨子體內(nèi)的100毫升小腸液對10克玉米-豆粕日糧進行15小時的消化，消化實驗結(jié)果為該鴨模擬小腸液與40只制液用鴨子體內(nèi)的小腸液對玉米-豆粕日糧的干物質(zhì)消化率差異僅為0. 85%，這就證實了制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代這40只制液用鴨子來模擬這40只制液用鴨子的消化能力。目前，在家禽小腸中，可通過有效方法檢測并了解其酶學(xué)基本特性的消化酶約19 種，其中的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶所占比例就約占全部酶蛋白含量的60% (參見文獻"Pubols, M. H. Ratio of enzymes in the chick pancreas [J], Poultry Science, 1991,70 :337-342”中的描述)。而且，從分泌量和水解能力來看，鴨小腸液中α -淀粉酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的每小時分泌量分別為7235. 74UU780. 43U、811. 43U、20. 30U， 可水解140g淀粉、19.9g蛋白質(zhì)、0.3g脂肪。而日糧中淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪三者含量的總和占到有機物總量的80%以上。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以看到，鴨小腸內(nèi)的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶這四種消化酶的分泌及水解活性完全可以水解飼料中絕大多數(shù)的有機物，因此，制備的鴨模擬小腸液中只要有α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶這四種消化酶，并且令鴨模擬小腸液中的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶這四種消化酶的活性分別與實際的鴨小腸液(指設(shè)定數(shù)量的制液用鴨子或任意鴨子)中的α-淀粉酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的活性一樣，就可以用鴨模擬小腸液來模擬鴨子(指設(shè)定數(shù)量的制液用鴨子或任意鴨子)對各種日糧的消化能力。而且，從上述各個實施例可以看到，本發(fā)明制備出的鴨模擬小腸液對各種日糧的消化率非常接近實際的鴨小腸液，消化率差異極小，也就是說，本發(fā)明制備出的鴨模擬小腸液完全可以替代實際的鴨小腸液來對各種日糧的消化能力進行實驗。在本發(fā)明中，離心機、冷凍干燥機、透析袋等均為公知設(shè)備，且涉及到的離心、冷凍干燥、透析等處理以及固液轉(zhuǎn)換的計算方法均為公知技術(shù)。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明制備出的鴨模擬小腸液中4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性(水解能力)與實際的鴨小腸液一樣，可做為一種模擬飼料在鴨小腸內(nèi)消化的消化液。本發(fā)明不是使用單一的試劑級消化酶(試劑級消化酶多為豬源性或微生物來源， 存在酶學(xué)特性不同源問題)來制備鴨模擬小腸液，而是主要使用真實鴨子的小腸液中的 4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)配以試劑級消化酶(試劑級 α -淀粉酶、試劑級脂肪酶、試劑級胰蛋白酶、試劑級糜蛋白酶，試劑級消化酶中所含消化酶的活性極小)來制備鴨模擬小腸液，這樣使得制備出的鴨模擬小腸液的酶學(xué)特性與實際鴨體內(nèi)小腸液基本同源。
本發(fā)明采用提純的鴨小腸液凍干粉為主要原料，大大降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明可通過控制4種主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性來控制鴨模擬小腸液的消化能力，從而使得可對鴨模擬小腸液進行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本發(fā)明的實施成本低，生產(chǎn)工藝高效、快速，可進行鴨模擬小腸液的大規(guī)模生產(chǎn)。上述是本發(fā)明的較佳實施例及其所運用的技術(shù)原理，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，任何基于本發(fā)明技術(shù)方案基礎(chǔ)上的等效變換、 簡單替換等顯而易見的改變，均屬于本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟一將從設(shè)定數(shù)量的制液用鴨子的鴨小腸中采集來的鴨小腸食糜放入一個試劑瓶中搖勻，將搖勻后得到的混合物放入一個離心瓶中，在設(shè)定溫度下通過離心機進行離心處理，在離心處理結(jié)束后，收集該離心瓶中的上清液；步驟二 將步驟一得到的上清液過濾后，經(jīng)冷凍干燥機冷凍濃縮成混合濃縮液；步驟三將步驟二得到的混合濃縮液經(jīng)透析袋透析去除雜質(zhì)后，冷凍干燥成凍干粉；步驟四分別測定步驟三得到的凍干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，以及測定試劑級α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性、試劑級脂肪酶中脂肪酶的活性、試劑級胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性、試劑級糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性；步驟五根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向設(shè)定重量的凍干粉中加入相應(yīng)容量的試劑級α -淀粉酶、相應(yīng)重量的試劑級脂肪酶、相應(yīng)重量的試劑級胰蛋白酶、相應(yīng)重量的試劑級糜蛋白酶以及相應(yīng)容量的水溶液，以制備出鴨模擬小腸液，該制備出的鴨模擬小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分別與目標(biāo)鴨小腸液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。
2.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于在所述步驟二中，所述上清液經(jīng)由200目尼龍濾布進行過濾。
3.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于在所述步驟三中，所述透析袋的截留分子量在20000道爾頓以下，所述混合濃縮液依次經(jīng)由PH值在7. 0 8. 4之間的磷酸鹽緩沖液、去離子水進行透析。
4.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于在所述步驟三中，所述透析袋的截留分子量在20000道爾頓以下，所述混合濃縮液依次經(jīng)由PH值在7. 0 8. 4之間的磷酸鹽緩沖液、蒸餾水進行透析。
5.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于在所述步驟五中，所述目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性是以所述步驟一中用到的所有制液用鴨子為對象分別進行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定得出的平均值。
6.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于在所述步驟五中，所述目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性是以大量鴨子為對象分別進行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性測定得出的平均值，所述目標(biāo)鴨小腸液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的平均活性分別為 401. 56U/ml、l. 10U/ml、108. 75U/ml、39. 01U/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于所述步驟五中的所述水溶液為去離子水。
8.如權(quán)利要求1或5或6所述的鴨模擬小腸液的制備方法，其特征在于所述鴨子的年齡超過6周齡且體重在2公斤以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鴨模擬小腸液的制備方法，包括將采集的鴨小腸食糜放入試劑瓶中搖勻，放入離心瓶中進行離心處理，收集上清液；將上清液過濾，冷凍濃縮成混合濃縮液；將混合濃縮液透析去除雜質(zhì)后冷凍干燥成凍干粉；測定凍干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，測定試劑級α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相應(yīng)消化酶的活性；根據(jù)鴨模擬小腸液與目標(biāo)鴨小腸液中各消化酶總活性相等的原則，向設(shè)定重量凍干粉中加入相應(yīng)容量試劑級α-淀粉酶、相應(yīng)重量試劑級脂肪酶、相應(yīng)重量試劑級胰蛋白酶、相應(yīng)重量試劑級糜蛋白酶及相應(yīng)容量水溶液。本發(fā)明方法實施成本低，可制備出與真實鴨子體內(nèi)4種消化酶基本同源的鴨模擬小腸液。
文檔編號G01N33/02GK102313794SQ20111014004
公開日2012年1月11日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者侯水生, 張子儀, 張宏福, 趙峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所