專利名稱：用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞肝癌(h印atocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。肝癌惡性程度高，發(fā)展迅速，其平均患病年齡為44歲，若治療不及時(shí)或治療方案選擇不當(dāng)，平均生存時(shí)間為半年。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%，但隨著AFP及其他檢測方法的廣泛應(yīng)用，肝癌的發(fā)病率和檢出率逐漸增高。這表明，未來我國對(duì)于高質(zhì)量的肝癌診斷產(chǎn)品，尤其是AFP診斷產(chǎn)品的需求將越來越大。對(duì)于肝癌來說，一般自身如果出現(xiàn)明顯癥狀，再去檢查的話就已經(jīng)到了晚期，而且錯(cuò)過了最好的治療時(shí)間。肝癌病人早期基本上無癥狀，一旦出現(xiàn)諸如肝區(qū)疼痛、腹脹、腹部包塊、黃疸、腹水等癥狀時(shí)，多已屬晚期。肝癌患者很難早期發(fā)現(xiàn)，目前接受治療的肝癌病人約3/4就屬于晚期，給治療帶來極大的困難。，患者會(huì)感到肝區(qū)脹痛，尤其飯后為甚，厭食， 肝大，右上腹有腫塊，不明原因的消瘦、腹脹、腹瀉、間斷性發(fā)熱、乏力、食欲減退等。因此，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)就診成為提高肝癌治愈率的焦點(diǎn)問題，而目前，對(duì)于肝癌的早期檢測集中于甲胎蛋白AFP這一特異性蛋白。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一種由胎兒肝細(xì)胞產(chǎn)生的分子量70kDa左右的胚胎性糖蛋白，出生后其含量在20ng/mL以下，一旦肝細(xì)胞發(fā)生癌變，則恢復(fù)了產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的功能，血液中AFP含量明顯增高，所以可作為診斷原發(fā)性肝癌的指標(biāo)之一。一般認(rèn)為AFP含量低于20ng/mL時(shí)，沒有臨床意義，大于20ng/mL而小于400ng/mL時(shí)，可視為肝細(xì)胞異常，在400ng/mL以上時(shí)，作為原發(fā)性肝癌的確診指標(biāo)。因此，檢測血清中AFP含量的異常增高，作為早期發(fā)現(xiàn)和診斷原發(fā)性肝癌，在臨床上是非常有效的判定依據(jù)。血清中AFP 含量不僅可作為HCC的早期診斷指標(biāo)，也可作為療效觀察和預(yù)后判斷的指標(biāo)。目前，臨床上常用的AFP檢測的方法為ELISA，CLIA等方法。上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。開發(fā)簡單、快速的肝癌早期診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)q域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。目前，已經(jīng)有很多公司開發(fā)出檢測甲胎蛋白的試劑盒，例如藍(lán)十字生物藥業(yè)(北京)有限公司的甲胎蛋白(AFP)檢測試紙(膠體金法)，重慶泰科華誼醫(yī)藥有限公司的甲胎蛋白AFP膠體金診斷試劑等。侯惠仁等人通過實(shí)驗(yàn)研制AFP免疫層析測試條，只需將少量血清滴于測試條上，大約IOmin后，經(jīng)目測即能得知AFP的陰陽性。但是對(duì)于臨床上肝細(xì)胞的異常及肝癌不能區(qū)分，單獨(dú)使用20ng/mL這一標(biāo)準(zhǔn)不能直接、快速確診肝癌，所以開發(fā)能夠檢測AFP 20 400ng/mL這一 AFP診斷灰區(qū)的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內(nèi)外均無相關(guān)的試紙條出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的開發(fā)簡單、快速的甲胎蛋白診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測AFP的方法。并且能夠半定量檢測20ng/mL 400ng/mL這一 AFP灰區(qū)范圍。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗AFP單克隆抗體1并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的AFP單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即 C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。本發(fā)明方法包括如下步驟一、膠體金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%檸檬酸三鈉溶液；3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；4.溶液由淺藍(lán)色，深藍(lán)，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。二、膠體金標(biāo)記物的制備1.取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為8. 8 ；3.加入20 μ g/mL AFP單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；7.重復(fù)5.步操作；8.重復(fù)6.步操作；9.重復(fù)5.步操作；10.用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；11.玻璃纖維素膜點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。三、在硝酸纖維素膜上劃線1. Tl線用濃度為0. 2mg/mL的AFP單克隆抗體2劃線，用于檢出20ng/mL的AFP ；
2. T2線用濃度為0. lmg/mL的AFP單克隆抗體2劃線，用于檢出400ng/mL的AFP ；3. C線用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、膠體金試紙條的組裝1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見附圖1)；2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進(jìn)行檢測。五、檢測試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前， 與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測帶出現(xiàn)紅色為樣本中AFP水平大于20ng/mL(見附圖2)，C線與兩條檢測帶都出現(xiàn)紅色為樣本中AFP水平大于400ng/mL (見附圖3)，只有C 線出現(xiàn)紅色的為陰性(見附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無效。本發(fā)明檢測對(duì)象單一且針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高。檢測速度快，所需時(shí)間短，只需5min， 不需經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足醫(yī)院、門診等部門快速、準(zhǔn)確地診斷肝癌的要求，并且便于基層推廣和運(yùn)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的圖示圖2為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽性結(jié)果(AFP水平大于20ng/mL)圖3為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽性結(jié)果(AFP水平大于400ng/mL)圖4為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陰性結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下面實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本實(shí)例先用2%的檸檬酸三鈉溶液制備20nm的金水，并標(biāo)記AFP單克隆抗體1，按金標(biāo)單克隆抗體、AFP單克隆抗體2、羊抗鼠多克隆抗體噴金標(biāo)墊、檢測線(T線)、質(zhì)控線(C 線)，然后組裝成試紙條，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/條，室溫干燥保存?zhèn)溆?。?shí)施例1.準(zhǔn)備AFP單克隆抗體1和2。并清洗實(shí)驗(yàn)所需的玻璃器皿。2.膠體金的制備先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。這樣就制備了 20nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢， 確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。3.膠體金標(biāo)記物的制備
取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH 調(diào)整為8. 8 ；加入20μ g/mLAFP單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20yL的10%BSA，混勻，振蕩30min ；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min， 輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm， 離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為 0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；在玻璃纖維素膜上點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。4.膠體金試紙條的組裝分別將0. 2mg/mL和0. lmg/mL的AFP單克隆抗體2劃在硝酸纖維素膜的檢測線(T 線)上，將3.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質(zhì)控線(C線)上。然后將硝酸纖維素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后將各個(gè)部分按附圖1組裝成試紙條。5.膠體金試紙條的使用及結(jié)果判讀檢測前，先提取被檢者的血清樣本。然后把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C 線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測帶出現(xiàn)紅色為樣本中AFP水平大于 20ng/mL(見附圖2)，C線與兩條檢測帶都出現(xiàn)紅色為樣本中AFP水平大于400ng/mL (見附圖3)，只有C線出現(xiàn)紅色的為陰性(見附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無效。實(shí)施例可直接檢測樣品中的AFP，使用方法不需要專業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速，5min 即可獲得結(jié)果，可達(dá)到快速、簡便、及時(shí)地檢測AFP的目的。
權(quán)利要求
1.一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗AFP單克隆抗體1并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的AFP單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測線(即T線)， 羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法，其特征在于，抗體劃線濃度為Tl線用濃度為0. 2mg/mL的AFP單克隆抗體2劃線，用于檢出20ng/mL的AFP ； T2線用濃度為0. lmg/mL的AFP單克隆抗體2劃線，用于檢出400ng/mL的AFP ； C線用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法，其特征在于，運(yùn)用不同濃度的抗體溶液在相同的基質(zhì)上劃線，以膠體金方法檢測多個(gè)不同濃度水平物質(zhì)的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法。甲胎蛋白是一種由胚胎細(xì)胞和卵黃囊產(chǎn)生的胎兒所特有的蛋白質(zhì)。正常成人血清中AFP含量極微(＜20ng/ml)，當(dāng)肝細(xì)胞惡變時(shí)，含量可大大升高(＞400ng/ml)。因此檢測血清中AFP含量的異常增高，作為早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷原發(fā)性肝癌在臨床上是非常有效的判定依據(jù)。目前，臨床上常用的AFP檢測的方法為ELISA，CLIA等方法。上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。免疫膠體金技術(shù)近年來發(fā)展迅速，得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測AFP的方法，并且能夠半定量檢測20ng/mL～400ng/mL這一AFP灰區(qū)范圍。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102323425SQ20111014872
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司