專利名稱：一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
茶堿為甲基黃嘌呤類的衍生物，臨床上常用于治療支氣管哮喘、哮喘型慢性支氣管炎和心源性哮喘等。但茶堿也具有很多毒副作用，包括惡心，頭痛，腹瀉，嘔吐，腸胃出血，癲癇以及心律失常等。由于茶堿的有效濃度治療窗窄(治療血清濃度參考范圍為 10-20 μ g/mL)，且毒副反應(yīng)發(fā)生率與其血藥濃度密切相關(guān)，因此在治療期間對(duì)病人的茶堿血清濃度水平進(jìn)行檢測(cè)非常重要。目前測(cè)定茶堿血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和熒光偏振免疫分析法(FPIA)。高度自動(dòng)化的FPIA法因其簡(jiǎn)便快速成為臨床茶堿血藥濃度監(jiān)測(cè)最常用的方法，但其試劑盒依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴和有效期較短是其不可回避的缺點(diǎn)。而HPLC法常因操作繁瑣，效率低，測(cè)定周期長(zhǎng)及分析成本高的缺點(diǎn)限制了其在臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)中的廣泛應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、周期短、成本低、靈敏度高的檢測(cè)方法成為急待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高和全自動(dòng)化的茶堿藥物濃度檢測(cè)試劑盒和制備方法，。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒，包括以下組分試劑Rl 茶堿衍生物特異的多克隆抗體；試劑R2 葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物；試劑R3:定標(biāo)液；所述定標(biāo)液為茶堿校準(zhǔn)品溶于空白血清中制得；所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物為茶堿衍生物與葡萄糖六磷酸脫氫酶偶聯(lián)產(chǎn)物，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物能與茶堿衍生物特異抗體特異性結(jié)合；所述茶堿衍生物特異的多克隆抗體是以茶堿衍生物與牛血清白蛋白偶聯(lián)的產(chǎn)物為免疫抗原制得。優(yōu)選的，所述定標(biāo)液為6種不同茶堿質(zhì)量濃度的溶液，所述定標(biāo)液茶堿質(zhì)量濃度分別為 ο. ο μ g/mL>2. 5 μ g/mL>5. 0 μ g/mL、10. 0 μ g/mL、20. 0 μ g/mL>40. 0 μ g/mL。優(yōu)選的，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物稀釋度為 1 1000-1 6000，茶堿衍生物特異的多克隆抗體稀釋度為1 400-1 3000。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，所述方法包括以下步驟茶堿衍生物特異的單克隆或多克隆抗體的制備，葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物的制備，定標(biāo)液的制備。優(yōu)選的，所述茶堿衍生物特異的多克隆抗體的制備包括以下步驟步驟a:將牛血清白蛋白溶解于0. 2mol/L的pH為8. 5的磷酸緩沖液中；茶堿衍生物的活化將特異的茶堿衍生物IOOmg置于容器中，并依次加入3. 5mL 二甲基酰胺、3.5mL乙醇、7mL磷酸鉀緩沖液、400mg 1_乙基_3_(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和 50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述磷酸鉀緩沖液濃度為lOmmol/L，pH值為5. 0 ；步驟b 茶堿衍生物免疫抗原的偶聯(lián)和純化將步驟a活化的茶堿衍生物滴加到步驟a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2 8°C條件下攪拌12-16小時(shí)，將偶聯(lián)的抗原進(jìn)行孔徑為8KD的透析袋透析純化；步驟c 采用步驟b得到的茶堿衍生物免疫抗原制備茶堿衍生物抗體。優(yōu)選的，所述步驟c為將步驟b合成的茶堿免疫抗原用10mmol/L，pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋至1. Omg/mL, 然后用茶堿免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對(duì)兔子進(jìn)行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)兔子注射一次，之后每隔觀天注射一次，從兔子進(jìn)行初次注射開(kāi)始，經(jīng)過(guò)4個(gè)月后獲得的抗體。優(yōu)選的，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物的制備包括以下步驟a、將15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶溶解于12mLTris緩沖液中，然后依次加入225mg 還原型輔酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0. 75mL卡必醇和2. 25mL 二甲基亞砜；所述1Tr i s緩沖液PH為9. 0，各組分濃度為0. 05mol/LTris、3. 3mmol/L氯化鎂，145. 4mmol/L氯化鈉；b、茶堿衍生物的活化將特異的茶堿衍生物8. 64mg溶解于420 μ L 二甲基亞砜和 180 μ L 二甲基酰胺組成的混合溶液中，所述混合溶液加入6 μ L三丁胺和3 μ L氯甲酸異丁酯，在2 8°C條件下攪拌30分鐘；C、將所述步驟b所得溶液逐滴加入到步驟a所得溶液中，在2 8°C條件下用磁力攪拌器攪拌60分鐘，將所得酶標(biāo)抗原進(jìn)行透析純化，得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的茶堿藥物濃度均相酶免疫檢測(cè)試劑盒靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，平均批內(nèi)和批間精密度< 2.0%，樣本回收率為103. 4士 1.55%。1、本發(fā)明特異性強(qiáng)，如咖啡因，與茶堿的結(jié)果非常相似，本發(fā)明對(duì)測(cè)試的31種常見(jiàn)藥物和化合物幾乎無(wú)任何交叉反應(yīng)，適合臨床檢驗(yàn)茶堿的血藥濃度。2、本發(fā)明靈敏度能達(dá)到0. 1 μ gg/mL， 遠(yuǎn)低于茶堿的臨床用藥范圍10-20yg/mL。3、本發(fā)明在全自動(dòng)生化分析儀上應(yīng)用，操作簡(jiǎn)便，只需將樣品加入到檢測(cè)試劑中，通過(guò)0D340nm吸光值的變化即可計(jì)算出樣品的含量，能夠在全自動(dòng)生化分析儀上實(shí)現(xiàn)臨床樣本的高通量、快速化檢測(cè)；同時(shí)，檢測(cè)試劑國(guó)產(chǎn)化能解決國(guó)內(nèi)臨床藥物濃度檢測(cè)試劑依賴進(jìn)口、成本昂貴的問(wèn)題，適合常規(guī)治療藥物濃度的臨床檢測(cè)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明圖1是茶堿均相酶免疫測(cè)定的定標(biāo)曲線。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說(shuō)明。本發(fā)明的均相酶免疫檢測(cè)試劑Rl中含有抗茶堿的特異性抗體，加入含有茶堿的液體樣本后，再加入含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)標(biāo)記茶堿衍生物的R2試劑，組成均相酶免疫反應(yīng)體系。反應(yīng)體系中，抗體與酶標(biāo)記的茶堿衍生物結(jié)合可導(dǎo)致酶的失活，而樣本中的茶堿能競(jìng)爭(zhēng)性的取代與抗體結(jié)合的酶標(biāo)茶堿衍生物，并使其從抗體的結(jié)合位點(diǎn)上釋放出來(lái)，從而使酶恢復(fù)活性?；钚缘腉6PDH酶可將試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH在340nm有吸收峰，可通過(guò)測(cè)定吸光值的改變來(lái)測(cè)定茶堿的濃度。因此，反應(yīng)液中的標(biāo)記酶活性與樣本中茶堿濃度相關(guān)，液體樣本中茶堿的含量越多，游離的G6PDH酶標(biāo)茶堿生物就越多，從而能得到更強(qiáng)的信號(hào)。本發(fā)明的內(nèi)容包括茶堿免疫原的合成，抗茶堿特異性抗體的制備，酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備以及樣本的測(cè)定。分別通過(guò)化學(xué)合成的方法制備出G6PDH-茶堿偶聯(lián)物和BSA-茶堿免疫原，并由此免疫原免疫動(dòng)物，制備出特異性的抗茶堿多克隆抗體。將制備好的抗體和酶標(biāo)偶聯(lián)物配制成均相酶免疫試劑Rl和R2，在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行茶堿樣本的測(cè)定。本發(fā)明的核心技術(shù)為均相酶免疫檢測(cè)方法，其中試劑和待測(cè)樣品均為液相，測(cè)定過(guò)程中不存在分離步驟，樣品與抗體反應(yīng)后再加入標(biāo)記的抗原進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)施例11.茶堿免疫原的合成a、將牛血清白蛋白(BSA) 200mg溶解于50mL 0. 2mol/L，ρΗ8· 5的磷酸緩沖液中；b、將如下組分加入到燒杯中攪拌溶解1 OOmg茶堿衍生物、3. 5mL 二甲基酰胺 (DMF)、3. 5mL 乙醇、7. OmL(10mmol/L, pH5. 0)磷酸鉀緩沖液、400mgl-乙基-3-(-3- 二甲氨丙基)碳二亞胺、50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌溶解反應(yīng)30min;將上述b中溶解好的溶液滴加至上述a中的BSA溶液中，并在2_8°C下攪拌過(guò)夜， 得到抗原；將合成好的抗原經(jīng)過(guò)透析進(jìn)行純化，得到茶堿免疫原。2.抗茶堿特異性抗體的制備用PBS磷酸緩沖液將合成的茶堿免疫原稀釋至1. Omg/mL,然后用1. OmL的抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對(duì)家兔進(jìn)行注射；14-21天后，再用LOmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)家兔注射一次，之后每隔四周一次，經(jīng)過(guò)4個(gè)月后，獲得的抗體效價(jià)約為 1 10000。3.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)標(biāo)記茶堿衍生物的制備1)G6PDH 酶溶液制備將 15mgG6PDH(IOOku)溶解于 UmL Tris 緩沖液(0. 05M Tris, 3. 3mmol/L MgCl2,145. 4mmol/LNaCl,pH 9.0)中。然后依次加入 225mgNADH、135mg 葡萄糖-6-磷酸(G6P)及0. 75mL卡必醇。接著逐滴加入2. 25mL 二甲亞砜(DMSO)。2)茶堿衍生物的活化將8. 64mg茶堿衍生物溶解于420 μ LDMSO與180 μ LDMF的混合溶液中。然后將溶液冷卻至2 8°C后，加入6 μ L三丁胺和3 μ L氯甲酸異丁酯，在2 8°C下攪拌30min。3)G6PDH與茶堿衍生物的偶聯(lián)將步驟2)中的溶液逐滴加入至步驟1)制備的溶液中，在2 8°C下攪拌60分鐘，得到偶聯(lián)物。4)將偶聯(lián)物經(jīng)過(guò)透析進(jìn)行純化，得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶標(biāo)記的茶堿衍生物。4.均相酶免疫試劑的制備1) Rl試劑的制備在ILTris 緩沖液(55mmol/LTris, 0. 1 % BSA, 145. 4mmol/LNaCl, 3mmol/LMgCl2, pH8. 0)中依次加入2. 02gNAD和0. 86gG6P，在室溫下攪拌lOmin。然后將抗體制備中得到的抗體加入溶液中，稀釋比例為1 1000-1 6000。2) R2試劑的制備在ILTris 緩沖液(120mmol/LTris，0. 1% BSA, 145. 4mmol/LNaCl, 3mmol/L MgCl2, pH8. 2)中加入G6PDH酶標(biāo)記茶堿衍生物，稀釋比例為1 400-1 3000?？烧{(diào)節(jié)抗體和酶標(biāo)偶聯(lián)物在緩沖液中的濃度，以便優(yōu)化測(cè)定工作曲線范圍。實(shí)施例2利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行樣本測(cè)試(1)血清標(biāo)本的收集，按照常規(guī)方法收集血清標(biāo)本；(2)根據(jù)日立7180型全自動(dòng)生化儀的操作說(shuō)明，打開(kāi)儀器，進(jìn)行儀器光密度檢測(cè)和探針的清洗，檢測(cè)儀器是否運(yùn)行正常；(3)儀器檢測(cè)運(yùn)行正常后，將試劑R1、R2依次放入R1、R2試劑倉(cāng)，血清標(biāo)本放入樣品盤 1 (Si)，0. O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5. O μ g/mL、10. O μ g/mL、20. O μ g/mL、40. O μ g/mL 的茶堿定標(biāo)液放入樣品盤2 (S》的指定位置；(4)儀器在Mand by狀態(tài)時(shí)，設(shè)定茶堿的操作程序和檢驗(yàn)參數(shù)，具體檢驗(yàn)參數(shù)如
表一表一血清中茶堿藥物濃度檢測(cè)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下組分 試劑Rl 茶堿衍生物特異的多克隆抗體；試劑R2 葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物； 試劑R3 定標(biāo)液；所述定標(biāo)液為茶堿校準(zhǔn)品溶于空白血清中制得；所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物為茶堿衍生物與葡萄糖六磷酸脫氫酶偶聯(lián)產(chǎn)物，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物能與茶堿衍生物特異抗體特異性結(jié)合；所述茶堿衍生物特異的多克隆抗體是以茶堿衍生物與牛血清白蛋白偶聯(lián)的產(chǎn)物為免疫抗原制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述定標(biāo)液為 6種不同茶堿質(zhì)量濃度的溶液，所述定標(biāo)液茶堿質(zhì)量濃度分別為0. 0μ g/mL、2. 5μ g/mL、 5. 0μ g/mL、10. 0 μ g/mL、20. 0 μ g/mL>40. 0 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物稀釋度為1 1000-1 6000，茶堿衍生物特異的多克隆抗體稀釋度為 ι 400-1 3000。
4.一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 茶堿衍生物特異的單克隆或多克隆抗體的制備，葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物的制備，定標(biāo)液的制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述茶堿衍生物特異的多克隆抗體的制備包括以下步驟步驟a:將牛血清白蛋白溶解于0. 2mol/L的pH為8. 5的磷酸緩沖液中； 茶堿衍生物的活化將特異的茶堿衍生物IOOmg置于容器中，并依次加入3. 5mL 二甲基酰胺、3. 5mL乙醇、7mL磷酸鉀緩沖液、400mgl_乙基-3-(-3- 二甲氨丙基)碳二亞胺和 50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述磷酸鉀緩沖液濃度為lOmmol/L，pH值為5. 0 ；步驟b 茶堿衍生物免疫抗原的偶聯(lián)和純化將步驟a活化的茶堿衍生物滴加到步驟a 所得的牛血清白蛋白溶液中，在2 8°C條件下攪拌12-16小時(shí)，將偶聯(lián)的抗原進(jìn)行孔徑為 8KD的透析袋透析純化；步驟c 采用步驟b得到的茶堿衍生物免疫抗原制備茶堿衍生物抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述步驟c為將步驟b合成的茶堿免疫抗原用lOmmol/L，pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋至1. 0mg/mL，然后用茶堿免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對(duì)兔子進(jìn)行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)兔子注射一次，之后每隔觀天注射一次，從兔子進(jìn)行初次注射開(kāi)始，經(jīng)過(guò)4個(gè)月后獲得的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物的制備包括以下步驟a、將15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶溶解于12mLTris緩沖液中，然后依次加入225mg還原型輔酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0. 75mL卡必醇和2. 25mL 二甲基亞砜；所述1Tris緩沖液 pH 為 9. 0，各組分濃度為0. 05mol/LTris、3. 3mmol/L 氯化鎂，145. 4mmol/L 氯化鈉；b、茶堿衍生物的活化將特異的茶堿衍生物8.64mg溶解于420 μ L 二甲基亞砜和 180 μ L 二甲基酰胺組成的混合溶液中，所述混合溶液加入6 μ L三丁胺和3 μ L氯甲酸異丁酯，在2 8°C條件下攪拌30分鐘；c、將所述步驟b所得溶液逐滴加入到步驟a所得溶液中，在2 8°C條件下用磁力攪拌器攪拌60分鐘，將所得酶標(biāo)抗原進(jìn)行透析純化，得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的茶堿衍生物。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高和全自動(dòng)化的茶堿藥物濃度檢測(cè)設(shè)備及其制備方法，為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種茶堿均相酶免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法，包括茶堿免疫原的合成，抗茶堿特異性抗體的制備，酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備以及樣本的測(cè)定。本發(fā)明靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，靈敏度能達(dá)到0.1μg/mL，遠(yuǎn)低于茶堿的臨床用藥范圍10-20μg/mL；平均批內(nèi)和批間精密度＜2.0％，樣本回收率為103.4±1.55％。本發(fā)明在全自動(dòng)生化分析儀上應(yīng)用，操作簡(jiǎn)便，能進(jìn)行高通量快速化的樣品檢測(cè)，適合常規(guī)治療藥物濃度的臨床檢測(cè)。該發(fā)明中提供的茶堿抗體的特異性強(qiáng)，藥物交叉反應(yīng)試驗(yàn)中，對(duì)測(cè)試的31種常見(jiàn)藥物和化合物幾乎無(wú)任何交叉反應(yīng)，適合臨床檢驗(yàn)茶堿的血藥濃度。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102253215SQ201110150998
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者梁曉翠, 梁耀銘, 蔡江麗, 虞留明, 陳瑞東 申請(qǐng)人:濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司