專利名稱：牛奶過敏原檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫法檢測技術(shù)，具體是一種牛奶過敏酶聯(lián)免疫法檢測模式，尤其是運(yùn)用雙抗原夾心法的原理，將別牛奶過敏原包被于反應(yīng)板和標(biāo)記辣根過氧化物酶，對牛奶過敏患者血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測的牛奶過敏原檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
食物過敏是當(dāng)今重大的衛(wèi)生學(xué)問題，對人們的身體健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，對食物過敏的致病機(jī)理、檢測、防治的研究日益受到重視。牛奶過敏是食物過敏中的主要類型之一，在嬰幼兒中高發(fā)，嚴(yán)重威脅患兒的健康和生長發(fā)育。在牛奶中含有一種叫β-乳球蛋白質(zhì)的物質(zhì)是強(qiáng)過敏原，某些過敏體質(zhì)的人，飲用牛奶后就會出現(xiàn)過敏表現(xiàn)。及早檢測和確診食物過敏，是該疾病防控的關(guān)鍵。食物過敏的致病機(jī)理主要為I 型超敏反應(yīng)，機(jī)體對某種食物過敏時(shí)，會在體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體(主要為IgE型)，能特異性結(jié)合食物中導(dǎo)致過敏的成份——過敏原。目前，臨床上常采用檢測食物過敏特異性抗體來確定患者食物過敏的類型，而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)是最為常用的體外檢測方法，該方法中用于標(biāo)記的酶通常是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶，國內(nèi)應(yīng)用以后者居多。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)根據(jù)原理分為雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法等類型。目前，國內(nèi)外食物過敏ELISA檢測方法普遍采用間接法，即將過敏原成份包被于固相載體，用其識別和捕獲患者血清中的特異性抗體，再通過特異性抗體進(jìn)一步結(jié)合酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行顯色反應(yīng)來判斷結(jié)果，從而確定患者是否對該成份過敏。首先，此類間接法食物過敏檢測模式，只能在一定程度上保證結(jié)果的特異性，由于使用的酶標(biāo)抗體能識別食物過敏特異性抗體所屬的一類抗體，比如IgE型抗體，而血清中的IgE型抗體種類很多，與食物過敏有關(guān)的只是其中一部分，一旦無關(guān)的IgE抗體由于種種原因非特異地結(jié)合在固相載體上，就會同特異性抗體一道被抗IgE的酶標(biāo)抗體所識別和結(jié)合，造成顯色結(jié)果偏高，使檢測本底偏高并產(chǎn)生假陽性結(jié)果。另一方面，由于間接法檢測模式需要用到酶標(biāo)抗體，其制備過程需要飼養(yǎng)、免疫動物、并采血收集抗體，這一過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，消耗大量的試劑和實(shí)驗(yàn)動物，提高了成本和工作量。雙抗原夾心法是ELISA的檢測模式之一，其原理是通過包被抗原和酶標(biāo)記的抗原構(gòu)成雙抗原夾心結(jié)構(gòu)，識別和捕獲待測標(biāo)本中能結(jié)合該抗原的特異性抗體。與間接法相比， 雙抗原夾心法不需要酶標(biāo)記的抗體，而是換成了酶標(biāo)記的抗原，因而省去了抗體制備的過程。同時(shí)，由于酶標(biāo)抗原只識別特異性抗體而不與該抗體同一類型的其他抗體結(jié)合，從而提高了檢測的特異性。但是，目前雙抗原夾心法只見于人類免疫缺陷病毒(HIV)等生物活性分子的檢測中，還未見有將其用于食物過敏檢測的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了克服食物過敏檢測間接法的不足，而提供一種雙抗原夾心法檢測牛奶過敏的牛奶過敏原檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明旨在建立一種雙抗原夾心法ELISA檢測牛奶過敏的模式，通過購買或自行提取獲得高純度的牛奶過敏原，用于包被微孔反應(yīng)板和標(biāo)記辣根過氧化物酶，制成包被抗原和酶標(biāo)抗原，檢測時(shí)用這兩種抗原識別和捕獲患者血清中的牛奶過敏的特異性抗體，形成“微孔板-包被抗原-特異性抗體-酶標(biāo)抗原”的雙抗原“夾心”，再通過酶催化底物的顯色反應(yīng)來判斷結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對血清中過敏特異性抗體的檢測。檢測過程中不需要酶標(biāo)抗體而使用酶標(biāo)記的過敏原(抗原)，且用于標(biāo)記酶的抗原和用于包被的抗原相同，大大簡化了試劑的制備過程。本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過敏的陰性和陽性質(zhì)控血清；其特點(diǎn)是還包括
a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖液，將β-乳球蛋稀釋為50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室溫包被過夜；加入封閉液ISOul/孔4°C過夜，封閉微孔板中的未結(jié)合位點(diǎn)，拍干后通風(fēng)晾干備用；
b.辣根過氧化物酶標(biāo)記乳球蛋白抗原采用改良的過碘酸鈉法，具體為將乳球蛋白0.3 mol/L碳酸鹽緩沖液中于4°C透析過夜，取出所得抗原加入已活化的β -乳球蛋白標(biāo)記辣根過氧化物酶，反應(yīng)1 h后用NaBH4溶液終止，將所得酶結(jié)合物粗品于平衡液4°C 透析過夜，取出已透析酶結(jié)合物，上樣于已平衡好的kphadex G-200凝膠柱，用平衡液洗脫，收集，用0.45 μ m的濾膜過濾除菌，分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩Ｋ雠Ｄ踢^敏原檢測試劑盒的制備方法，其封閉液是含洲牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸鹽緩沖液。所述牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，其平衡液是0. 01 mol/L磷酸鹽緩沖液。所述牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，將牛奶過敏原進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記。一種如權(quán)利要求1所述方法制備的牛奶過敏原檢測試劑盒，包括顯色液A、顯色液 B，終止液，以及牛奶過敏的陰性和陽性質(zhì)控血清；而該試劑盒還包括包被β -乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根過氧化物酶標(biāo)記的β -乳球蛋白抗原。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，采用雙抗原夾心法檢測牛奶過敏血清中的特異性抗體，與間接法相比，由于使用了酶標(biāo)抗原而非酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗原不再識別和結(jié)合與特異性抗體同屬一型的其他無關(guān)抗體，從而使檢測的特異度進(jìn)一步提高有利于降低假陽性結(jié)果和檢測本底；另一方面，由于不需要酶標(biāo)抗體，省去了飼養(yǎng)、免疫、采血、處死動物等制備抗體的過程， 從而降低了成本和工作量；由于檢測時(shí)患者血清不需要預(yù)先稀釋，簡化了檢測步驟。


圖1為雙抗原夾心法牛奶過敏ELISA體外診斷方法的原理示意圖； 圖2為雙抗原夾心法檢測牛奶過敏的操作方法示意圖。其中1.聚苯乙烯微孔板
2.固相于微孔板的牛奶過敏原(包被抗原)
3.待檢者血清中的牛奶過敏特異性抗體4.標(biāo)記了辣根過氧化物酶的牛奶過敏原(酶標(biāo)抗原)
5.辣根過氧化物酶
6.顯色底物
I過敏原包被
II加入待測血清
III加入酶標(biāo)記過敏原
IV加入底物顯色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。1.高純度牛奶過敏原的獲得
牛奶中的乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等成分是引起過敏反應(yīng)的主要過敏原， 目前這些組分都有市售的高純度的標(biāo)注品，可進(jìn)行訂購獲得，也可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的純化方法通過自行提取的方法獲得，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)摸索出成熟的提取乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等高純度單一過敏原的純化工藝?，F(xiàn)以乳球蛋白為例對提取工藝進(jìn)行介紹。1.1材料和試劑 1. 1. 1所需材料
新鮮未加工牛奶；低溫高速離心機(jī)；水浴鍋；真空泵；葡聚糖凝膠(S印hadex-G200， kphadex-DEAE-A50，美國DPC生物公司)；Mini p-4垂直凝膠電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司);電泳儀及轉(zhuǎn)膜電泳槽(美國BIO-RAD公司);全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；蛋白純化設(shè)備(紫外檢測儀、蛋白收集器、恒流蠕動泵上海滬西分析儀器廠)；蛋白超濾裝置(Stirred Ultrafiltration Cells 8010 Millipore)酶標(biāo)分析儀(DNM - 9602，北京普朗新技術(shù)有限公司) 1. 1. 2相關(guān)試劑配方 1. 1. 2. 1 磷酸緩沖液(PB 0. 01mol/L) PB 0.lmol/L
權(quán)利要求
1.一種牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過敏的陰性和陽性質(zhì)控血清；其特征在于a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖液，將β-乳球蛋稀釋為50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室溫包被過夜；加入封閉液ISOul/孔4°C過夜，封閉微孔板中的未結(jié)合位點(diǎn)，拍干后通風(fēng)晾干備用；b.辣根過氧化物酶標(biāo)記的β-乳球蛋白抗原，是將β-乳球蛋白0.3mol/L碳酸鹽緩沖液中于4°C透析過夜，取出所得抗原加入已活化的β -乳球蛋白標(biāo)記辣根過氧化物酶，反應(yīng)1 h后用NaBH4溶液終止，將所得酶結(jié)合物粗品于平衡液4°C透析過夜，取出已透析酶結(jié)合物，上樣于已平衡好的kphadex G-200凝膠柱，用平衡液洗脫，收集，用0.45 μ m的濾膜過濾除菌，分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，其特征在于封閉液是含 2%牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶過敏原檢測試劑盒的制備方法，其特征在于平衡液是 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液。
4.一種如權(quán)利要求1所述的牛奶過敏原檢測試劑盒，包括顯色液A、顯色液B，終止液， 牛奶過敏的陰性和陽性質(zhì)控血清，其特征在于該試劑盒還包括包被乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根過氧化物酶標(biāo)記的β -乳球蛋白抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛奶過敏原檢測試劑盒及其制備方法，屬于酶聯(lián)免疫法檢測技術(shù)。本發(fā)明包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過敏的陰性和陽性質(zhì)控血清；另將牛奶過敏原分別包被微孔板制成包被抗原和標(biāo)記辣根過氧化物酶制成酶標(biāo)抗原。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明改變傳統(tǒng)的間接法ELISA檢測模式，采用雙抗原夾心法ELISA構(gòu)建牛奶過敏原檢測試劑盒。用于識別和捕獲患者血清中的牛乳過敏特異性抗體，再通過催化底物顯色來判斷結(jié)果?？朔藗鹘y(tǒng)的間接法檢測模式諸多不足，能降低檢測本底、減少假陽性結(jié)果，檢測操作時(shí)血清不需要預(yù)先稀釋，因不需使用檢測抗體，簡化了制備方法。提高了檢測特異度，同時(shí)節(jié)省了試劑和操作成本。
文檔編號G01N33/559GK102331497SQ201110160488
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者任杰, 常艷敏, 李會強(qiáng), 李嬋, 許順連, 陳寅 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)