專利名稱：一種猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法。
背景技術(shù)：
猴頭菌片是采用與猴頭菌(Hericium ermaceus (Bull. ) Pers)有效成分相一致的猴頭菌菌絲體提取物制成的制劑。猴頭菌片具有益氣補(bǔ)血、扶正培本、養(yǎng)胃護(hù)胃的作用，臨床上常用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍及慢性胃炎等，對(duì)多種消化道疾病均有較好的療效。猴頭菌片的藥效是各組成成分復(fù)雜的綜合作用，其所含的多糖、多肽類、氨基酸等物質(zhì)，具有免疫調(diào)理、抗腫瘤、保護(hù)胃腸道等作用。猴頭菌絲體中含有較高含量的腺苷。腺苷具有廣闊的生理活性，包括鎮(zhèn)靜、擴(kuò)血管、抗缺氧及較弱的抗炎、降膽固醇等作用?，F(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)主要是以多糖為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在猴頭菌片生產(chǎn)過(guò)程中由于輔料的加入干擾多糖含量的準(zhǔn)確性，所以研究腺苷含量指標(biāo)作為一個(gè)復(fù)合的分析指標(biāo)具有較大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種HPLC (高效液相色譜法)測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)—種猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，為采用高效液相色譜法HPLC定量檢測(cè)猴頭菌片中腺苷的含量，包括如下步驟(1)猴頭菌片樣品溶液的制備；(2)腺苷對(duì)照品溶液的制備；(3)采用HPLC分別對(duì)猴頭菌片樣品溶液和腺苷對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)試，其中，采用 HPLC進(jìn)行測(cè)試包括如下色譜條件a、流動(dòng)相采用體積比為(6 94)-(10 90)的甲醇和0. 01 %乙酸水溶液(體積
百分含量)；b、所用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm ；(4)根據(jù)步驟(3)中獲得的猴頭菌片HPLC色譜圖和腺苷對(duì)照品HPLC色譜圖中腺苷的峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算猴頭菌片中腺苷的含量。較佳的，步驟(3)的a中，所述流動(dòng)相為體積比為(8 92)-(9 91)的甲醇和 0.01%乙酸水溶液。較佳的，HPLC色譜柱采用C18色譜柱，所述色譜柱的規(guī)格為4. 6mmX 250mm，填料粒度為5 μ m。較佳的，所述流動(dòng)相的流速為1. OmL/min ；色譜柱的柱溫為25°C ；進(jìn)樣量?jī)?yōu)選為 10 μ Lo較佳的，步驟⑴中，所述猴頭菌片樣品溶液的制備，包括如下步驟精密稱取猴頭菌片樣品并溶于15%甲醇水溶液中，依次經(jīng)超聲提取、放冷后，稱定重量，并用15%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，再將獲得的溶液離心、過(guò)濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜濾過(guò)后得到所述猴頭菌片樣品溶液。較佳的，所述猴頭菌片樣品溶液的濃度為10-40mg/mL。優(yōu)選的，所述猴頭菌片樣品溶液的濃度為20mg/mL。較佳的，所述超聲提取時(shí)間如30min ；放冷至室溫；所述離心時(shí)，離心的轉(zhuǎn)數(shù)可以為3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間5min ；微孔濾膜的規(guī)格為0. 45 μ m。較佳的，步驟O)中，所述腺苷對(duì)照品溶液的制備，包括如下步驟精密稱取恒重的腺苷對(duì)照品，置于量瓶中，加15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到腺苷對(duì)照品溶液。較佳的，所述腺苷對(duì)照品溶液中腺苷的質(zhì)量濃度為3. 2_48μ g/ml。優(yōu)選的，所述腺苷對(duì)照品溶液中腺苷的質(zhì)量濃度為16μ g/ml。本發(fā)明用高效液相色譜法測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法，以Agilent Z0RBAXSB-C18 (5 μ m, 4. 6mmX 250mm)為色譜柱，流動(dòng)相采用體積比為(6 94)-(10 90) 的甲醇和0. 01 %乙酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV- λ 260nm,流速為1. OmL/min,柱溫為25°C，并采用外標(biāo)法定量測(cè)定。結(jié)果顯示腺苷在0. 032 0. 48 μ g范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系， 且r = 0. 99999 ；本測(cè)試方法的平均回收率為984% (n = 9)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1. 5%。 本發(fā)明的高效液相色譜法測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法簡(jiǎn)便、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 可用于猴頭菌片的輔助質(zhì)量控制。而現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道HPLC法測(cè)定腺苷含量方法很多，但用于本品測(cè)定，分離效果均不理想。


圖1實(shí)施例1中腺苷對(duì)照品的HPLC圖譜圖2實(shí)施例1中猴頭菌片樣品的HPLC圖譜圖3實(shí)施例1中陰性空白樣品的HPLC圖譜圖4實(shí)施例2中腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為6 % (甲醇)-94 % (0. 01乙酸水溶液)圖5實(shí)施例2中猴頭菌片樣品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為6% (甲醇)_94% (0. Ol 乙酸水溶液)圖6實(shí)施例2中腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為8 % (甲醇)-92 % (0. 01乙酸水溶液)圖7實(shí)施例2中猴頭菌片樣品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為8% (甲醇)_92% (0. Ol 乙酸水溶液)圖8實(shí)施例2中腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為9 % (甲醇)_91 % (0. 01乙酸水溶液)圖9實(shí)施例2中猴頭菌片樣品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為9% (甲醇)_91% (0. Ol 乙酸水溶液)圖10實(shí)施例2中腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為12% (甲醇)-88% (0. Ol 乙酸水溶液)圖11實(shí)施例2中猴頭菌片樣品的HPLC色譜圖，流動(dòng)相為12% (甲醇)_88% (0.01乙酸水溶液)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例11儀器與試藥Agilent-IlOO高效液相色譜儀系統(tǒng)，配全自動(dòng)進(jìn)樣器，CQ-6超聲波清洗器(上海滬超超聲波儀器有限公司)。甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；腺苷對(duì)照品(批號(hào) 110879-200202供含量測(cè)定用中國(guó)藥品生物制品檢定所)；猴頭菌片(由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格:0. 26g/ 片，批號(hào):08050102,08080101,08120101,09030701,09030701, 09100102，10040802,10050302，10030501)。2色譜條件色譜柱AgilentZORBAX SB-C18 (5 μ m, 4. 6mmX 250mm)；流動(dòng)相甲醇 _0· 01 % 乙酸(9 91)；檢測(cè)波長(zhǎng)為:260nm ；流速1. OmL/min ；柱溫:25°C ；進(jìn)樣量=IOyL ；外標(biāo)法定量。3方法與結(jié)果3. 1供試品溶液的制備3. 1. 1猴頭菌片樣品溶液的制備精密稱取猴頭菌片樣品0. 5g，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇水溶液(體積百分含量)25ml，稱定重量，置超聲波清洗器超聲提取30min，放冷，稱定重量，用15 %甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，3000轉(zhuǎn)離心5min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0. 45 μ m)濾過(guò)，即得。3. 1. 2陰性空白樣品溶液的制備稱取不含猴頭菌菌絲體的陰性空白樣品溶液，按照供試品溶液的制備方法制成陰性空白樣品溶液。3. 1. 3腺苷對(duì)照品溶液的制備精密稱取恒重的腺苷對(duì)照品10mg，置于25ml量瓶中，加15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取Iml置于25ml量瓶中，加15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度， 搖勻，即得16 μ g/ml的腺苷對(duì)照品溶液。3. 2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取腺苷對(duì)照品溶液、陰性空白溶液和猴頭菌片樣品溶液，分別在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μ L，測(cè)繪HPLC圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖1-圖3，其中圖1為腺苷對(duì)照品的HPLC圖譜，圖2為猴頭菌片樣品的HPLC圖譜，圖3為陰性空白樣品的HPLC圖譜。由圖1_3可知，在對(duì)照品溶液和供猴頭菌片樣品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性空白樣品在腺苷出峰時(shí)間區(qū)域沒(méi)有干擾峰出現(xiàn)，故對(duì)腺苷的測(cè)定無(wú)干擾作用。3. 3線性關(guān)系的考察精密稱取恒重的腺苷對(duì)照品10mg，置于25ml量瓶中，加15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取Iml置于25ml量瓶中，加15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得16 μ g/mL的對(duì)照品溶液。將質(zhì)量濃度為0. 016mg/ml的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用HPLC 分別進(jìn)樣2 μ L，5 μ L，8 μ L，10 μ L，15 μ L，30 μ L，以腺苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量(μ L)為橫坐標(biāo)(X)， 以測(cè)定的腺苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y= 10. 324x-l. 2447,r = 0. 999965。說(shuō)明腺苷在 0. 032 0. 48 μ g 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。3. 4精密度試驗(yàn)精密吸取腺苷對(duì)照品溶液5ul，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定腺苷峰面積積分值，結(jié)果腺苷的峰面積和保留時(shí)間(t)值基本不變，其標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.7%。說(shuō)明儀器性能良好。3. 5重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)猴頭菌片樣品6份，按上述“3. 1. 1猴頭菌片樣品溶液的制備”，制備成供試液，平行測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0. 85% (n = 6)，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。3. 6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)猴頭菌片供試樣品1份，按上述“3. 1. 1猴頭菌片樣品溶液的制備”，制備成供試液，在常溫下放置Mh，每間隔池測(cè)定1次，連續(xù)共測(cè)定7次，最后在24h時(shí)測(cè)定第8次，結(jié)果供試品平均峰面積變化不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1. 2%，表明樣品溶液中的腺苷，在Mh內(nèi)穩(wěn)定性良好。3. 7回收率試驗(yàn)取已知含量的供試樣品9份，分別加入一定量的腺苷對(duì)照品，混勻，按“3. 1. 1猴頭菌片樣品溶液的制備方法”，制備成供試液，在腺苷的線性范圍內(nèi)分別制成低、中、高3種不同濃度的溶液(每一種濃度3份)。分別進(jìn)樣，測(cè)定腺苷的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1回收率測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，為采用高效液相色譜法HPLC定量檢測(cè)猴頭菌片中腺苷的含量，包括如下步驟(1)猴頭菌片樣品溶液的制備；(2)腺苷對(duì)照品溶液的制備；(3)采用HPLC分別對(duì)猴頭菌片樣品溶液和腺苷對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)試，其中，采用HPLC 進(jìn)行測(cè)試包括如下色譜條件a、流動(dòng)相采用體積比為(6 94)-(10 90)的甲醇和0. 01 %乙酸水溶液；b、所用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm；(4)根據(jù)步驟(3)中獲得的猴頭菌片HPLC色譜圖和腺苷對(duì)照品HPLC色譜圖中腺苷的峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算猴頭菌片中腺苷的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)的a 中，所述流動(dòng)相為體積比為(8 92)-(9 91)的甲醇和0.01%乙酸水溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，HPLC色譜柱采用C18色譜柱，所述色譜柱的規(guī)格為4. 6mmX 250mm,填料粒度為5 μ m。
4.如權(quán)利要求1所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述流動(dòng)相的流速為1. OmL/min ；色譜柱的柱溫為25°C ；進(jìn)樣量為10 μ L。
5.如權(quán)利要求1所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑴中，所述猴頭菌片樣品溶液的制備，包括如下步驟精密稱取猴頭菌片樣品并溶于15%甲醇水溶液中，依次經(jīng)超聲提取、放冷后，稱定重量，并用15%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，再將獲得的溶液離心、過(guò)濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜濾過(guò)后得到所述猴頭菌片樣品溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述猴頭菌片樣品溶液的濃度為10-40mg/mL。
7.如權(quán)利要求5所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述微孔濾膜的規(guī)格為0. 45 μ m。
8.如權(quán)利要求1所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟O)中， 所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備，包括如下步驟精密稱取恒重的腺苷對(duì)照品，置于量瓶中，加 15%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到腺苷對(duì)照品溶液。
9.如權(quán)利要求8所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述腺苷對(duì)照品溶液中腺苷的質(zhì)量濃度為3. 2-48μ g/ml。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的猴頭菌片中腺苷含量的檢測(cè)方法用于猴頭菌片質(zhì)量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中或用于猴頭菌片的輔助質(zhì)量控制中。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及一種HPLC測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法。本發(fā)明用高效液相色譜法測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法，以安捷倫ZORBAXSB-C18(5 m，4.6×250mm)為色譜柱，流動(dòng)相為體積比(6:94)-(10:90)的甲醇和0.01%乙酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV-λ260nm，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃，且外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示腺苷在0.032~0.48 g范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系；本測(cè)試方法的平均回收率為98.4％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.5％。本發(fā)明的高效液相色譜法測(cè)定猴頭菌片中腺苷含量的方法簡(jiǎn)便、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于猴頭菌片的輔助質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102269749SQ20111016528
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者莊意麗, 張夢(mèng)玲, 顧慧芬 申請(qǐng)人:上海市中藥研究所, 上海雷允上科技發(fā)展有限公司