專利名稱：一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)及植物檢疫領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的方法。
背景技術(shù)：
ELISA和多種PCR是目前病毒檢測(cè)的主要方法。然而，目前國(guó)內(nèi)缺乏大多數(shù)檢疫性病毒的抗體(實(shí)際檢測(cè)中多從國(guó)外高價(jià)購(gòu)買)。同時(shí)，基于抗體的ELISA檢測(cè)方法靈敏度有限。另一方面，PCR檢測(cè)技術(shù)受RNA提取質(zhì)量、模本DNA含量、引物和PCR條件等多因素影響，在實(shí)際檢測(cè)過程中可能存在較高的假陽(yáng)性或假陰性風(fēng)險(xiǎn)。此外，通常的ELISA和PCR方法都僅針對(duì)一種病毒的檢測(cè)，盡管有報(bào)道利用多重PCR同時(shí)檢測(cè)多重病毒，但本申請(qǐng)人在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)三重以上PCR檢測(cè)方法受待檢病毒種類、檢測(cè)樣品、引物和PCR條件等多重因素的影響，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性很差、難以推廣應(yīng)用。液相芯片(Liquid chip)是在液態(tài)懸浮體系中進(jìn)行生物分子互作反應(yīng)的一類新型生物芯片技術(shù)，又稱為多功能懸浮點(diǎn)陣(Multi-analyte suspension array，MASA)、 Flexible multi-analyte profiling(xMAP)或流式熒光技術(shù)等。液相芯片體系是由許多大小均一的圓形微球?yàn)橹饕|(zhì)所構(gòu)成，通常微球由聚苯乙烯制成。目前開發(fā)的液相芯片技術(shù)和檢測(cè)裝置如 Luminex 100/200, Bio-Rad VersArray ChipRe ader)。液相芯片技術(shù)已被應(yīng)用于病原體、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物和激素等的診斷檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外還未見利用液相芯片技術(shù)對(duì)植物病毒進(jìn)行高通量檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)和南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的方法，該方法包括(1)提供已包被抗體的微球，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄環(huán)斑病毒的捕獲抗體，微球2上固定有抗南芥菜花葉病毒的捕獲抗體；將待測(cè)樣品與已包被抗體的微球混合，從而使待測(cè)樣品中的番茄環(huán)斑病毒和/或南芥菜花葉病毒與捕獲抗體及微球形成“病毒-捕獲抗體-微球”復(fù)合物；所述的微球1和微球2具有不同的微球識(shí)別信號(hào)；(2)將步驟(1)形成的復(fù)合物與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體和抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體混合，從而形成“檢測(cè)抗體-病毒-捕獲抗體-微球”復(fù)合物；(3)檢測(cè)( 形成的復(fù)合物中不同微球的微球識(shí)別信號(hào)以及可檢測(cè)標(biāo)記物，從而確定待測(cè)樣品中番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的存在與否以及存在的量；附加條件是待測(cè)樣品、已包被抗體的微球、檢測(cè)抗體的混合，可依次進(jìn)行，也可同時(shí)進(jìn)行。
在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲抗體是多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲抗體的包被濃度是40士20 (較佳地，40士 10) μ g/
mLo在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)抗體是單克隆抗體；并且，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10士5 μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是 6 + 3 μ g/mL0在另一優(yōu)選例中，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10 士 3yg/mL;或者所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是6 士 2 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10 士 2μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是6士 1 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10士 1 μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是6 士0. 5 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物是生物素，步驟O)中還包括加入鏈親和素-藻紅蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0.3-0. 4) 1 ；或所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0. 2-0. 3) 1。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是0.35 1 ；或所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是 0. 25 1。在另一優(yōu)選例中，所述已包被抗體的微球中，每種微球的量為(6-10) X IO4個(gè)/mL。在另一優(yōu)選例中，所述已包被抗體的微球中，每種微球的數(shù)量為(7-9)父104個(gè)/ mL ；更佳地為8 X IO4個(gè)/mL。在另一優(yōu)選例中，兩種微球是等量混合的。在另一優(yōu)選例中，所述的微球1與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的體積比是1 3;所述的微球2與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的體積比是 1 2。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)和南芥菜花葉病毒(ArMV)的液相芯片，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄環(huán)斑病毒的捕獲抗體，微球2上固定有抗南芥菜花葉病毒的捕獲抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲抗體是多克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)和南芥菜花葉病毒(ArMV)的試劑盒，其包括(a)所述的已包被抗體的微球；(b)帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是10士5μ g/mL(較佳地是10 士 3 μ g/mL ；更佳地是10 士 2 μ g/mL ；進(jìn)一步更佳地是10 士 1 μ g/mL)；以及(c)帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是6士3 μ g/ mL (較佳地是6 士 2 μ g/mL ；更佳地是6 士 1 μ g/mL ；進(jìn)一步更佳地是6 士 0. 5 μ g/mL)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物是生物素，且該試劑盒還包括鏈親和素-藻紅蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰Ｔ诹硪粌?yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括雜交液，洗滌液等。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，將針對(duì)兩種植物病毒的捕獲抗體分別固定在不同微球 (Beads)上，并且本發(fā)明人還根據(jù)病毒自身因素以及混合體系的特點(diǎn)，優(yōu)化了檢測(cè)抗體、微球以及標(biāo)志物(標(biāo)記物)等的用量、比例，建立了液相芯片檢測(cè)方法，從而大大提高了病毒檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確率，最大限度降低了背景信號(hào)的產(chǎn)生?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。術(shù)語(yǔ)如本文所用，“捕獲抗體”、“包被抗體”、“第一抗體”、與“一抗”可互換使用，都是指用于固定于微球上的、特異性抗一種病毒或病毒蛋白的抗體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的捕獲抗體是抗病毒的多克隆抗體。如本文所用，“檢測(cè)抗體”、“第二抗體”、與“二抗”可互換使用，都是指特異性抗一種病毒或病毒蛋白的抗體。對(duì)于同一種病毒而言，相應(yīng)的捕獲抗體和檢測(cè)抗體是不同的，并且可同時(shí)結(jié)合于所述的病毒或病毒蛋白上的不同表位。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測(cè)抗體是抗病毒的單克隆抗體。如本文所用，所述的“微球識(shí)別信號(hào)”是指位于微球上的，用于區(qū)別不同的捕獲抗體的識(shí)別信號(hào)。為了方便起見，對(duì)于固定有同一種捕獲抗體的微球，微球識(shí)別信號(hào)優(yōu)選是相同的。優(yōu)選的，所述的微球識(shí)別信號(hào)是熒光信號(hào)，并且，對(duì)于固定有不同種捕獲抗體的微球， 熒光的色彩是不同的，對(duì)于固定有同種捕獲抗體的微球，熒光的色彩優(yōu)選是相同的。如本文所用，所述的“可檢測(cè)標(biāo)記物”是指與檢測(cè)抗體結(jié)合或耦聯(lián)的、用于顯示 (或作為顯示標(biāo)志的)檢測(cè)抗體與相應(yīng)的病毒或病毒蛋白發(fā)生結(jié)合的信號(hào)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物是生物素，該生物素作為顯示標(biāo)志， 當(dāng)與鏈霉菌親和素偶聯(lián)的藻紅蛋白(鏈親和素-藻紅蛋白，又稱為PE標(biāo)記的鏈親和素， SA-R-PE)結(jié)合后，通過激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)?；驹肀景l(fā)明的基本原理是雙抗夾心法結(jié)合液相芯片技術(shù)。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將一抗固定于載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。對(duì)上述雙抗夾心法進(jìn)行改進(jìn)的是將所述的一抗固定于攜帶特定可檢測(cè)信號(hào)的微球上，制備液相蛋白芯片，通過采用液相蛋白芯片進(jìn)行檢測(cè)的原理是使單個(gè)微球通過檢測(cè)通道，并使用兩種激光同時(shí)對(duì)微球上的微球識(shí)別信號(hào)和可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。一種激光激發(fā)的是微球上的微球識(shí)別信號(hào)，根據(jù)微球上的不同種識(shí)別信號(hào)，可以將微球分類，從而將各個(gè)不同的結(jié)合反應(yīng)區(qū)分開來。另一種激光激發(fā)的是可檢測(cè)信號(hào)，目的是確定微球上結(jié)合的可檢測(cè)信號(hào)的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量。因此，通過兩種激光的同時(shí)檢測(cè)，可以確定被結(jié)合的檢測(cè)物的種類和數(shù)量。
本發(fā)明優(yōu)化了各試劑用量和條件參數(shù)，以在檢測(cè)多于一種病毒時(shí)提交效率和準(zhǔn)確性?？贵w包被微球所述的液相芯片包括2種不同的微球，所述的微球上固定有不同的捕獲抗體，其中，所述的捕獲抗體為抗番茄環(huán)斑病毒的抗體和抗南芥菜花葉病毒的抗體。本發(fā)明中，將捕獲抗體固定在微球上的詳細(xì)操作程序可用常規(guī)方法，例如按照 Luminex公司的產(chǎn)品說明書或網(wǎng)站www. luminexcorp. com中所述的方法進(jìn)行偶連，從而得到不同微球與相應(yīng)捕獲抗體形成的耦連物。所述的不同的微球是具有不同微球識(shí)別信號(hào)的微球，由于帶有不同的微球識(shí)別信號(hào)，使不同微球之間可被區(qū)分。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的微球識(shí)別信號(hào)為熒光信號(hào)， 并且，微球上的熒光信號(hào)因固定于微球上的相應(yīng)的捕獲抗體的不同而不同。本發(fā)明所述的微球可以采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。并且，所述的微球的平均直徑為1-100 μ m ；更優(yōu)選的，所述的微球的平均直徑為2-50 μ m，更優(yōu)選的，所述的微球的平均直徑為2-10μπι。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明所用的微球是一種直徑 5. 5-5. 6 μ m，以不同熒光標(biāo)記的微球。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，在一個(gè)反應(yīng)體系中(如約20 μ L體系)，每一種固定有不同的捕獲抗體的微球的用量為(6-10) X IO4個(gè)/mL;更優(yōu)選的為(7_9) X IO4個(gè)/mL ；最優(yōu)選地是8 X IO4個(gè)/mL。檢測(cè)方法為了同時(shí)地檢測(cè)所述的病毒，本發(fā)明人對(duì)采用所述液相芯片的檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，以保證能夠從樣品中精確地檢出病毒的存在情況以及存在量，提高檢出率。本發(fā)明人在深入研究后發(fā)現(xiàn)，針對(duì)同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)和南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的情況，在利用液相芯片進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，最為關(guān)鍵的影響因素是檢測(cè)抗體的工作濃度，微球和檢測(cè)抗體的比例。本發(fā)明中，每一種檢測(cè)抗體分別抗一種相應(yīng)的植物病毒，且對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的捕獲抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在利用檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10士5μ g/mL ；較佳地是10士3μ g/mL ；更佳地是10士2 μ g/mL ；最佳地是10士 1 μ g/mL。所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是6士3 μ g/mL;較佳地是 6 士 2 μ g/mL ；更佳地是 6 士 1 μ g/mL ；最佳地是 6 士0. 5 μ g/mL。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在利用檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述的微球1與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的體積比是1 3;所述的微球2與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的體積比是1 2?？蛇x用多種可檢測(cè)信號(hào)來標(biāo)記所述的檢測(cè)抗體。比如，所述的可檢測(cè)信號(hào)選自 FITC、CY3、CY5、藻藍(lán)蛋白、Alexa Fluor Dyes、BODIPY Dyes、俄勒岡綠染料(Oregon Green Dyes)、得克薩斯紅染料(Texas Red Dye)，或若丹明(Rhodamine)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，采用生物素作為可檢測(cè)標(biāo)記物。生物素的標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。對(duì)應(yīng)于可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)物質(zhì)為能夠與可檢測(cè)標(biāo)記物相結(jié)合并能夠報(bào)告所述結(jié)合的分子(報(bào)告分子)。當(dāng)采用生物素來標(biāo)記檢測(cè)抗體時(shí)，可采用鏈親和素-藻紅蛋白作為報(bào)告分子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0.3-0.4) 1;較佳地為是0.35 1。所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0.2-0.3) 1;較佳地為0.25 1。本發(fā)明中，可用所述的液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的樣品包括任何提取自植物的提取物 (可以是液態(tài)或固態(tài))，或由植物加工成的各類物質(zhì)。為了消除假陽(yáng)性和假陰性，宜在檢測(cè)過程中設(shè)置陽(yáng)性病毒對(duì)照和陰性對(duì)照。此外， 為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測(cè)過程中設(shè)置含已知濃度的病毒的標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法采用常規(guī)的方法。在本發(fā)明的實(shí)施例中，運(yùn)用優(yōu)化的試驗(yàn)條件，得出同時(shí)檢測(cè)ArMV和ToRSV的最佳工作條件。ArMV單抗工作濃度為6 μ g/mL，單抗與藻紅蛋白的質(zhì)量比為1 0. 25，單抗與微球的體積比為2 1 ;ToRSV最優(yōu)反應(yīng)條件為二抗工作濃度為10yg/mL，二抗與藻紅蛋白的質(zhì)量比為1 0.35，二抗與微球的體積比為3 1，液相芯片每次使用的樣本量為10yL，檢測(cè)過程為一個(gè)半小時(shí)。而ELISA檢測(cè)至少需要50yL，檢測(cè)時(shí)間為數(shù)小時(shí)以上。并且，多次試驗(yàn)得出結(jié)論液相芯片的檢測(cè)靈敏度普遍高于ELISA 5-10倍。試劑盒本發(fā)明的液相(蛋白)芯片檢測(cè)試劑盒可以將液相芯片技術(shù)與免疫學(xué)方法相結(jié)合，對(duì)兩種植物病毒進(jìn)行同時(shí)進(jìn)行精準(zhǔn)、快速地定量分析。本發(fā)明的用于檢測(cè)兩種植物病毒的試劑盒包括以下組分第一容器，以及裝于該容器中的本發(fā)明所述的已包被捕獲抗體的微球。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的試劑盒還包括第二容器，以及裝于該容器中的帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是10士5 μ g/mL ；較佳地是 10士3 μ g/mL ；更佳地是 10士2 μ g/mL ；最佳地是 10士 1 μ g/mL。。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的試劑盒還包括第三容器，以及裝于該容器中的帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是6士3 μ g/mL;較佳地是 6 士 2 μ g/mL ；更佳地是 6 士 1 μ g/mL ；最佳地是 6 士0. 5 μ g/mL。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括標(biāo)準(zhǔn)品、或?qū)φ掌贰Ｆ渌糜谶M(jìn)行雜交或酶聯(lián)檢測(cè)所需的試劑也可被包含在本發(fā)明的試劑盒中。本發(fā)明的試劑盒中還可包含使用說明書，以指導(dǎo)人們按照正確的流程、條件、劑量來實(shí)施檢測(cè)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于第一，本發(fā)明建立了雙重液相芯片方法，可以同時(shí)對(duì)某一個(gè)體樣品中的番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)和南芥菜花葉病毒(ArMV)進(jìn)行定性和定量分析，所需的樣本量低，準(zhǔn)確率高。第二，由于對(duì)微球帶有的捕獲抗體、相應(yīng)的檢測(cè)抗體、標(biāo)記物的量進(jìn)行配比設(shè)計(jì)， 從而使得兩種植物病毒均可靈敏地被檢測(cè)。并且，最大限度降低了不同分析物在雜交時(shí)存在的非特異性的結(jié)合，從而大大降低了背景信號(hào)的產(chǎn)生。同時(shí)也節(jié)省了大量時(shí)間與資金。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法聚苯乙烯熒光微球(ArMV編號(hào)為37，ToRSV編號(hào)為19，每種均帶有獨(dú)特的熒光光譜)購(gòu)自Luminex。鏈霉菌親和素(鏈親和素)_藻紅蛋白(SA-R-PE)購(gòu)自hvitrogen公司?？笰rMV、 ToRSV的單抗和多抗均購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所。以多抗作為捕獲抗體，以單抗作為檢測(cè)抗體。番茄環(huán)斑病毒(I10RSV)、南芥菜花葉病毒(ArMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot irus，TRSV)、番茄黑環(huán)病毒(Tomato black ring virus, TBRV)和草莓潛隱環(huán)斑病毒(Strawberry latent ringspot virus, SLRSV)陽(yáng)性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)阿格迪(Agdia)公司。樣本狀態(tài)為帶毒煙草葉片凍干粉，于4°C冰箱保存。陰性對(duì)照池(pool)的制備方法確定為陰性的植物葉片，包括豌豆、莧菜、西瓜、大豆、辣椒、黃瓜、芹菜、番茄等共8 份，每份取IOOmg,按照1 (葉片)10(緩沖液)加入0. OlM PB緩沖液(0. 94g Na2HPO4,0. 45g KH2PO4定容至1L)研磨混勻?yàn)閜ool，然后分裝，備用。微球的準(zhǔn)備微球直徑為5. 6 μ m，表面帶有羧基，以共價(jià)結(jié)合生物分子。首先，將4°C保存的微球放置于室溫20 30min，渦旋微球O !Min為宜)，按需要量(如包被的微球量可做 200次檢測(cè)，每次檢測(cè)需要2000個(gè)微球，則需要4X IO5個(gè)微球。微球的商品包裝規(guī)格為 1. 25 XlOVmL,則這次包被需要微球?yàn)?2 μ L)吸取熒光微球加入到1. 5毫升的離心管中， 130001~/1^11離心細(xì)^1去除保護(hù)液，用三蒸水洗滌后，用40(^1^ 0. IM ρΗ 6. 2磷酸緩沖液重懸微球。加入 10 μ L 50mg/mLSulfo-NHS 和 10μ L 50mg/mL EDC，混勻后 37°C作用 20min。 離心去上清，待用。微球的包被將待包被的微球GX IO5個(gè)微球)用900 μ L 0. 05Μ MES重新懸浮，離心去上清， 洗滌微球兩次。用400 μ L 0. 05Μ MES重懸微球，加入提純的抗ToRSV多抗和(或)抗ArMV 多抗(各自濃度均是40 μ g/mL)，混勻后37°C作用2 3h (期間，每隔15min渦旋混勻一次)。離心去上清，加入 900 μ L PBS-TBN (含有 0.05% Tween-20、0. 1 % BSA、0. 05%疊氮鈉的0.01M PBS)重懸微球，混勻后離心去上清，洗滌微球兩次。加入200 μ L PBS-TBN重懸微球。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。微球上單位面積的量是KT9IgG/微球。液相蛋白芯片單一病毒檢測(cè)程序取10 μ L樣本，向其中加入對(duì)應(yīng)的包被好多抗的微球20 μ L(工作濃度為8Χ IO4個(gè) /mL,渦旋微球數(shù)秒)，37°C避光振蕩作用30min。加入20μ L生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體(初定8μ g/mL)與鏈親和素-藻紅蛋白 (SA-R-PE, lmg/mL)的混合物，質(zhì)量比初定為檢測(cè)抗體鏈親和素-藻紅蛋白=1 0. 3， 37°C避光震蕩作用45min。
加入100 μ L終止液，將懸液轉(zhuǎn)移至96孔可拆卸酶標(biāo)反應(yīng)板，通過 Bio-plexTM200system儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度值(median fluorescence intensity，MFI)，并用 Bio-Plex Manager5. O 軟件分析數(shù)據(jù)。檢測(cè)2種病毒的Plex檢測(cè)體系建立優(yōu)化得出同時(shí)檢測(cè)ArMV和I10RSV最佳的反應(yīng)體系，兩種微球分別包被上抗ArMV 病毒和抗ToRSV病毒的多克隆抗體，等量混合(每種4X IO4個(gè)/mL)，不同工作濃度、不同體積的兩種檢測(cè)抗體(均為生物素標(biāo)記的)同時(shí)加入到一個(gè)反應(yīng)體系中，再向其中加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-R-PE)，進(jìn)行測(cè)定。其它條件同前述方法。最佳試驗(yàn)條件的確定反復(fù)試驗(yàn)后，本發(fā)明人篩選出3個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較顯著的因素，每個(gè)因素分為三個(gè)等級(jí)(表1)，檢測(cè)的抗原濃度一定(抗原按1 100倍稀釋)。按照表1的實(shí)驗(yàn)交叉反應(yīng)， 分別測(cè)出不同的熒光強(qiáng)度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表1、因素變化表
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus)和南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus)的方法，其特征在于，該方法包括(1)提供已包被抗體的微球，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄環(huán)斑病毒的捕獲抗體，微球2上固定有抗南芥菜花葉病毒的捕獲抗體；將待測(cè)樣品與已包被抗體的微球混合，從而使待測(cè)樣品中的番茄環(huán)斑病毒和/或南芥菜花葉病毒與捕獲抗體及微球形成“病毒-捕獲抗體-微球”復(fù)合物；所述的微球1和微球2具有不同的微球識(shí)別信號(hào)；(2)將步驟(1)形成的復(fù)合物與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體和抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體混合，從而形成“檢測(cè)抗體-病毒-捕獲抗體-微球”復(fù)合物；(3)檢測(cè)( 形成的復(fù)合物中不同微球的微球識(shí)別信號(hào)以及可檢測(cè)標(biāo)記物，從而確定待測(cè)樣品中番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的存在與否以及存在的量；附加條件是待測(cè)樣品、已包被抗體的微球、檢測(cè)抗體的混合，可依次進(jìn)行，也可同時(shí)進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕獲抗體是多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)抗體是單克隆抗體；并且，所述的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的濃度是10士5μ g/mL ；或者所述的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的濃度是6 士 3yg/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物是生物素，步驟O)中還包括加入鏈親和素-藻紅蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0.3-0.4) 1 ；或所述的鏈親和素-藻紅蛋白與抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體的質(zhì)量比是(0.2-0.3) 1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述已包被抗體的微球中，每種微球的量為 (6-10) X IO4 個(gè) /mL。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微球1與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體的體積比是1 3;所述的微球2與帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的體積比是1 2。
8.一種用于同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的液相芯片，其特征在于，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄環(huán)斑病毒的捕獲抗體，微球2上固定有抗南芥菜花葉病毒的捕獲抗體。
9.一種用于檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的試劑盒，其特征在于，其包括(a)權(quán)利要求7所述的已包被抗體的微球；(b)帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗番茄環(huán)斑病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是10士 5μ g/mL ；以及(c)帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗南芥菜花葉病毒的檢測(cè)抗體，其濃度是6士3μ g/mL。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物是生物素，且該試劑盒還包括鏈親和素-藻紅蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和南芥菜花葉病毒的方法。本發(fā)明人將針對(duì)兩種植物病毒的捕獲抗體分別固定在不同微球上，并且還根據(jù)病毒自身因素以及混合體系的特點(diǎn)，優(yōu)化了檢測(cè)抗體、微球以及標(biāo)記物等的用量、比例，建立了液相芯片檢測(cè)方法，從而大大提高了病毒檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確率，最大限度降低了背景信號(hào)的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102253212SQ201110168930
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者于翠, 代歡歡, 張舒亞, 楊翠云 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心