專利名稱：從生物體液樣本中富集與檢測稀有細胞的整合方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及從生物體液樣本中富集與檢測稀有細胞的整合方法。
背景技術：
自從美國國家食品藥品管理局于2004年審批通過美國Immimicon/ Veridex (Philadelphia, USA)公司的直接捕獲人外周血中循環(huán)腫瘤細胞的技術后，有關獲取及檢測循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，腫瘤干細胞，以及某些免疫細胞的重要的科研及臨床意義已不斷的被廣泛報道(Cristofanilli et al，2004 New Eng J. Med. 351 :781 ；Braun and Marth，2004 New Eng. J. Med. 351 :824).然而這種利用抗體偶聯(lián)磁珠直接捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法有著盡人皆知的缺點 (Mocellin et al，2006 Trends in Molecular Medicinel2 :130)鑒于腫瘤細胞表面標志表達的異質性，所以許多腫瘤細胞不能被此種方法所捕獲，這已被許多臨床病例所證明；除此之外，由于腫瘤細胞被抗體偶聯(lián)的磁珠“觸及”并被刺激，致使這些捕獲的被大量免疫顆粒包被的腫瘤細胞已不再是處于自然狀態(tài)的細胞，從而很難對其進行后續(xù)分析與研究。有鑒于此，人們開始尋求其它的替代手段以獲取循環(huán)稀有細胞。與直接捕獲細胞技術相比， 現(xiàn)已公認通過去除紅細胞及白細胞從而達到富集循環(huán)稀有細胞的方法是最為有效可行的替代手段。雖然某些去除或分離特定細胞群的單一實驗方法已經(jīng)有所報道，諸如密度離心法(U. S. Pat. No. 4，927，750)，免疫磁性顆粒法(U. S. Pat. No. 4，177，145)，紅細胞裂解法，以及必須借助特殊細胞分離管的免疫磁性顆粒與密度離心的初步結合方法(U. S. Pat. No. 5，840，50 ，但所有這些方法已被證明耗時長，白細胞及紅細胞去除率低，靶細胞回收率低，以及因需要某些特殊器材而帶來的操作不便?；谏鲜鲈颍景l(fā)明對現(xiàn)有的幾種互不關聯(lián)的技術進行了優(yōu)化組合，從而提供了一套新穎獨特的整合方法，包括去除血漿蛋白， 加紅細胞裂解，加抗體包被的免疫微球，加基于獨特的細胞分離介質而成的密度離心分離方法。源于此一獨特的整合試驗方法的不可預知的實驗結果已經(jīng)被證明能夠非常快速高效及高特異性地地去除血漿蛋白，白細胞及紅細胞，從而達到有效富集循環(huán)稀有細胞的目的， 而且可以始終維持很高的稀有細胞回收率。迄今為止，人們所采用的所有有關從富集樣品中檢測循環(huán)稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞及剩余白細胞的方法都是基于免疫熒光染色。然而，其不可避免的高非特異染色信號， 昂貴的熒光顯微鏡，以及必需但不便利的工作環(huán)境(例如暗室)極大地限制了基于免疫熒光法進行循環(huán)腫瘤細胞及循環(huán)內皮細胞檢測工作的開展。本發(fā)明提供了基于堿性磷酸酶和過氧化物酶酶標抗體的特異組合進行雙色或多色染色，從而達到檢測富集的循環(huán)稀有細胞的目的。經(jīng)此新方法染色過的循環(huán)稀有細胞具有很好的細胞形態(tài)，并可借助普通光學顯微鏡或掃描儀進行觀察與分析，從而能快速簡便地從剩余白細胞中檢測出富集的循環(huán)稀有細胞。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一套新穎獨特的整合方法包括去除血漿蛋白，紅細胞裂解，加入免疫微球或免疫材料以去除白細胞，加入基于獨特的細胞分離介質而成的密度離心以從生物體液標本中分離循環(huán)稀有細胞。由濃縮與富集構成的本方法能夠快速地從生物體液標本， 如外周血中，富集循環(huán)稀有細胞，且回收率高。富集的細胞具有可用于影像學分析的很好的細胞形態(tài)。同時，病人標本中的大部分白細胞亦可被高效回收以應用于其它研究分析，例如基因譜的研究。在本項發(fā)明中，任何特殊器材如細胞分離管或磁鐵均不需要。本發(fā)明中，從人或動物收集的所述生物體液標本包括但并不局限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過并/或勻漿化的人或動物組織，培養(yǎng)的人或動物細胞。所述免疫微球由特異性識別白細胞標示物的抗體與微球表面進行共價或非共價偶聯(lián)而形成，所述微球的表面可經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學處理以適于與蛋白質相偶聯(lián)，所述微球的直徑介于10納米-100微米，即IOnm-IOO μ m，所述微球包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅(silica)，右旋糖苷(dextran)，瓊脂糖(s印harose，agarose)，或交聯(lián)葡聚糖(sephadex)。用于制備所述免疫微球的微球為磁性或非磁性。在本發(fā)明中，用于制備免疫微球的抗體特異性地識別下述但不局限于這些白細胞表面標示物:CD3,⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，CD84，或CD102等。制備免疫微球過程中， 或是識別這些CD分子中的任意一種的抗體，或是識別這些CD分子中任意兩種或兩種以上的抗體的組合與任何適宜偶聯(lián)的固體表面進行共價或非共價偶聯(lián)，例如直徑介于10納米到100微米(IOnm-IOOym)的磁性或非磁性微球。本發(fā)明中，所述免疫吸附劑是將任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學處理的適宜結合蛋白的固體表面如硅玻璃片(Silicon glass slide)與配體(Iigand)或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細胞表面標示物如CD45的抗體進行共價或非共價偶聯(lián)而制備而成。本發(fā)明中，所述獨特的細胞分離介質在20 °C溫度下比重范圍介于 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，這一特定范圍內的密度適于將幾乎所有有核細胞與紅細胞及免疫微球進行分離。所述細胞分離介質包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷包被的膠質二氧化硅(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)力口泛景i酸納(sodiumdiatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇組成的非離子聚合物(nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin)；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖(sucrose)；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液，所述細胞分離介質的比重可用任何滲透壓介于280-320m0sm/kg H20, pH6. 8-7. 8的緩沖液在20°C溫度下調制在 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)范圍內。所述免疫微球的比重高于所述細胞分離介質的比重?；谒黾毎蛛x介質的離心在普通商品化的離心管內進行。本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有細胞的方法還包括，將通過基于所述細胞分離介質的離心得到的沉積細胞以上的所有上清液全部收集。本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有細胞的方法，其中，所述裂解紅細胞以去除紅細胞的步驟在所述加入免疫微球或免疫吸附劑進行孵育的步驟之前、之后或者同時進行。如果本發(fā)明的方法不包括加入紅細胞裂解液進行紅細胞裂解的步驟，則可以通過長時間的離心來分離去除紅細胞。本發(fā)明方法富集的循環(huán)稀有細胞可以應用于以下方面通過免疫熒光或免疫組化加普通光學顯微鏡或可見光掃描儀對所述富集的循環(huán)稀有細胞的計數(shù)；PCR ；流式細胞儀檢測；基因表達譜分析；蛋白表達譜分析；酶學測定；腫瘤病人體外化療藥物的篩選；有關腫瘤病人化療方案的制定與指導化療的進行；對腫瘤病人體內的腫瘤細胞使用化療藥物及 /或一種或多種治療腫瘤抗體效果的評估；體內或體外培養(yǎng)富集的稀有細胞；在富集的稀有細胞上鑒定及確認現(xiàn)有的或新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞表面或細胞內的標示物；富集的稀有細胞應用于臨床治療；監(jiān)測腫瘤病人的腫瘤復發(fā)；開發(fā)新的治療腫瘤的藥物；作為腫瘤診斷的輔助手段；健康人群體檢；以及基于循環(huán)內皮細胞的有關心臟病的診斷與治療。迄今所有檢測循環(huán)稀有細胞的技術手段都基于免疫熒光方法。但來源于熒光染料自身負電荷引起的與靶細胞的非特異結合這一主要缺點卻無可避免。此一缺點給人們在區(qū)分真假陽性染色信號的過程中帶來了極大的困擾。本發(fā)明提供了一整套優(yōu)化過的新穎的基于免疫組化的多色染色方法，從而能夠克服免疫熒光帶來的非特異染色，并使得對染色的循環(huán)稀有細胞的檢測得以在普通光學顯微鏡下或者基于顯微鏡原理的掃描儀下進行。此方法已被證明為一種高特異性，快速，簡單，低成本的技術手段，而且不再需要任何熒光染料及昂貴的熒光顯微鏡。本發(fā)明對富集的稀有細胞進行檢測的方法還可以包括染色體熒光原位雜交。所述雙色染色是指對所述稀有細胞的標示物如一種或多種角蛋白，以及白細胞的標示物如CD45分別進行染色，所述稀有細胞和所述白細胞被染成不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染色的基礎上對所述稀有細胞的細胞核進行另外一種顏色的染色，或對所述稀有細胞的其他標示物進行第三種顏色的染色，所述染色包括將特異性識別所述稀有細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及特異性識別所述白細胞的一抗單克隆或多克隆抗體與所述富集的稀有細胞進行孵育。所述特異性識別所述稀有細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及所述特異性識別所述白細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體分別與不同的小分子相共價偶聯(lián)，所述小分子選自包括以下物質的組羅丹明(rhodamine)，生物素(biotin)，異羥基洋地黃甙 (digoxigenin)，Alexa Fluor 系列分子，F(xiàn)ITC，及 iTexas Red，但不限于這些物質。在本發(fā)明的某些具體實施方式
中，可識別角蛋白8，18，19或廣譜角蛋白中任意一種或任意兩種或兩種以上的一抗單克隆或多克隆抗體被用于識別從具有上皮來源的任何實體腫瘤脫落入血的循環(huán)腫瘤細胞。另外一株可識別白細胞表面標志CD45的單克隆或多克隆抗體用于白細胞染色以區(qū)分假陽性。所述染色包括加入可特異性識別所述小分子的與不同的酶相偶聯(lián)的二抗單克隆或多克隆抗體。所述偶聯(lián)的酶是過氧化物酶，或堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶被用于檢測所富集的稀有細胞?？梢栽谳d玻片上或在溶液中對用本發(fā)明的方法富集的稀有細胞進行染色。在本發(fā)明的一些具體實施方式
中，將抗所述稀有細胞的標示物與抗白細胞的標示物的一抗抗體按任意順序與所述富集的稀有細胞一起進行孵育，或將兩種抗體制備成混合液同時與所述富集的稀有細胞進行孵育。本發(fā)明中，所述稀有細胞或其它細胞既可直接被共價或非共價偶聯(lián)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲，也可通過本發(fā)明的富集方法所富集。本發(fā)明的染色方法還包括聯(lián)合使用免疫熒光染色與基于免疫組化的染色及可見光下的觀察，所述免疫熒光用于檢測富集的循環(huán)稀有細胞，而所述基于免疫組化的染色則用于白細胞染色。在本發(fā)明的某個具體實施方式
中，識別角蛋白的一抗抗體被標記上熒光分子，而抗CD45的一抗則被標記上小分子以用于過氧化物酶催化的基于免疫組化的可見光顏色反應。本發(fā)明獨特的富集與染色兩種方法的結合可以極大地促進檢測血中稀有細胞如循環(huán)腫瘤細胞的普及應用。該新穎獨特的富集與染色方法已被證明成本低，且能快速高效及高特異性地富集并定量檢測血中的稀有細胞。本發(fā)明還涉及一種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括進行染色體熒光原位雜交，以及利用熒光或普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。本發(fā)明的目的還在于一種用于從生物體液中富集稀有細胞的試劑盒，包括紅細胞裂解液，免疫微球或者免疫吸附劑，獨特的細胞分離介質。試劑盒還包括說明書用于說明試劑盒的使用。本發(fā)明還涉及一種用于檢測富集的稀有細胞的試劑盒，包括特異性識別所述稀有細胞標示物的共價偶聯(lián)了小分子的一抗單克隆或多克隆抗體，可識別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克隆抗體以及所述酶的相應底物。該試劑盒可選地包括免疫熒光染料標記的抗體。該試劑盒還包括用于染色體熒光原位雜交的探針及試劑。該試劑盒還包括說明書，用于說明試劑盒的使用。本發(fā)明還涉及一種用于從生物體液樣本中富集循環(huán)稀有細胞的自動化系統(tǒng)，包括用于自動去除血漿蛋白的離心機，用于自動加入紅細胞裂解液的裝置，用于自動加入免疫微球或免疫吸附劑的裝置，用于自動加入一種細胞分離介質的裝置，密度離心裝置以及自動收集上清的裝置。本發(fā)明還涉及一種對富集的稀有細胞進行檢測的自動化系統(tǒng)，包括基于免疫組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的自動掃描裝置。所述染色裝置包括自動加樣器，孵育器和自動清洗裝置。名詞解釋稀有細胞其在采集的體液樣本內的所有有核細胞中的占有比例小于0. 1%0它們包括循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，腫瘤干細胞，干細胞，及某些免疫細胞等。循環(huán)稀有細胞循環(huán)稀有細胞是指存在于體液中的稀有細胞。生物體液標本其為從人或動物體中收集的液體，它們包括但并不局限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過的人或動物組織，培養(yǎng)的人或動物細胞。紅細胞裂解(hemolysis)在低滲條件下裂解紅細胞。免疫組化(IHC)通過偶聯(lián)于抗體上的酶與底物的反應顯現(xiàn)光學顯微鏡下可觀察到的顏色。
免疫熒光將抗體標記熒光分子


圖1是將乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞經(jīng)本發(fā)明方法富集后，再經(jīng)本發(fā)明的基于免疫組化的方法進行三色染色后獲得的圖像。圖2是用染色體熒光原位雜交方法檢測循環(huán)腫瘤細胞得到的圖像。
具體實施例方式本發(fā)明首次將四種互不關聯(lián)的單一實驗手段(即去除血漿蛋白，裂解紅細胞，抗體包被的免疫微球及基于特殊細胞分離介質的密度離心)進行了改進與優(yōu)化組合從而提供了一套新穎獨特的可快速高效地從外周血或其它體液樣本中富集循環(huán)稀有細胞的方法。 富集后的循環(huán)稀有細胞不需經(jīng)免疫熒光染色，而是用本發(fā)明中由免疫組化優(yōu)化衍生而成的技術進行雙色或多色染色，并可借助普通光學顯微鏡或掃描儀完成對染色的稀有細胞的觀察，圖像采集與分析處理。其中稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，腫瘤干細胞，干細胞，及某些免疫細胞，其中所述循環(huán)腫瘤細胞來自于具有或不具有上皮來源的任何實體瘤，如黑色素瘤。1.用于富集血中循環(huán)稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞及循環(huán)內皮細胞的方法與試劑本發(fā)明中的技術手段可從源于體內或體外的體液標本中富集或分離任意所需的稀有細胞。體液標本包括但并不局限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶學，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過的人或動物組織，培養(yǎng)的人或動物細胞。在本發(fā)明的某些具體實施方式
中，血液被收集于任意一種商品化的采血管中(如 BD, New Jersey, USA ；Cyto-Chex, Iowa, USA)。這些采血管含有任何一種下述抗凝劑枸櫞酸葡萄糖(A⑶)，乙二胺四乙酸(EDTA)，肝素(h印arin)等。標本應在72小時之內進行處理。在本發(fā)明的其它某些具體實施方式
中，本方法將去除血漿蛋白，裂解紅細胞，加入抗體包被的免疫磁珠，及基于特殊細胞分離介質的密度離心進行了組合優(yōu)化從而可有效地去除血漿蛋白，紅細胞和白細胞。作為替代手段，富集手段也可簡化為由兩個步驟組成，即免疫微球加紅細胞裂解；或免疫微球加基于特殊細胞分離介質的密度離心。不同于其它常規(guī)的用密度離心法分離細胞后只能費時費力且非精確地收集不同比重的分界相溶液，本發(fā)明中沉積細胞以上的所有上清液全部被收集。在本發(fā)明的實施方式中，免疫微球的制備是將單克隆或多克隆抗體與任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學處理的適宜結合蛋白的固體表面(例如直徑介于IOnm-IOO μ m的微球)進行共價或非共價偶聯(lián)。這些微球包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅(silica)，右旋糖苷(dextran)，瓊脂糖(s印harose，agarose)，或交聯(lián)葡聚糖(s印hadex)。這些微球可以是磁性的，也可為非磁性的。在本發(fā)明的某些實施方式中，免疫微球可由免疫吸附劑所替代。免疫吸附劑的制備是將特異的單克隆或多克隆抗體與任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學處理的適宜結合蛋白的固體表面進行共價或非共價偶聯(lián)，如硅玻璃片(silicon glass slide).在本發(fā)明的一些實施方式中，用于密度離心的特殊細胞分離介質具有特定范圍的比重，S卩1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，在此比重范圍內的細胞分離介質可用于分離所需的細胞。本項發(fā)明中的細胞分離介質包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷包被的膠質二氧化硅(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)加泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇組成的非離子聚合物(nonionic polymerconsisting of sucrose and epichlorohydrin)； 任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖(sucrose)；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；和/或任意蛋白溶液。細胞分離介質的比重可用任何滲透壓介于 280-320m0sm/kg H20, pH 6. 8-7. 8 的緩沖液調制而成。免疫微球的比重高于細胞分離介質的比重。在本發(fā)明的實施方法中，血漿蛋白可用離心方法去除。本發(fā)明中首次使用紅細胞裂解法與基于特殊細胞分離介質的密度離心相結合以快速高效地去除紅細胞。本發(fā)明中首次使用免疫微球與基于特殊細胞分離介質的密度離心相結合以快速高效地去除白細胞。作為替代手段，本發(fā)明中的去除白細胞亦可簡化為只使用免疫微球或免疫吸附劑。在本發(fā)明的具體實施方式
中，用于制備免疫微球或免疫吸附劑的抗體既可以是特異性地識別任意下述白細胞表面標示物的一種抗體，或是識別任意兩種或兩種以上下述白細胞表面標示物的抗體CD3，CD31, CD34, CD45, CD50, CD69, CD84，或 CD102 等。在本發(fā)明的具體實施方式
中，紅細胞與白細胞的去除可以以任意適宜的順序進行。它們既可同時去除，亦可紅細胞或白細胞先被去除。富集的循環(huán)稀有細胞可用于一系列后續(xù)分析，包括免疫熒光分析，基于免疫組化的染色分析，PCR，體外或體內培養(yǎng)富集的循環(huán)稀有細胞等。2.檢測富集的循環(huán)稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞目前所有發(fā)表的有關檢測循環(huán)腫瘤細胞的方法都基于免疫熒光染色。然而免疫熒光染色不可避免的主要缺點，即人們熟之為“鬼影”的非特異性染色卻給人們在判斷真假陽性細胞的過程中帶來了極大的困擾。本發(fā)明提供了一整套優(yōu)化后的基于免疫組化的多色染色方法。通過本發(fā)明試驗手段富集的循環(huán)稀有細胞經(jīng)此方法染色后，可極大地消除非特異染色。此染色方法與普通光學顯微鏡相結合，為不同領域的人們開展檢測循環(huán)稀有細胞提供了極大的便利。在本發(fā)明的某一具體實施方式
中，經(jīng)本方法富集的循環(huán)稀有細胞用2%多聚甲醛 (paraformaldehyde)固定。在本發(fā)明的其它具體實施方式
中，可識別角蛋白8，18，19或廣譜角蛋白中任意一種或任意兩種或兩種以上的一抗單克隆或多克隆抗體被用于識別循環(huán)腫瘤細胞，這些血中的循環(huán)腫瘤細胞脫落于具有上皮來源的任何實體瘤。另外一株可識別白細胞表面標志CD45 的單克隆或多克隆抗體被用于區(qū)分假陽性。在本發(fā)明的其它一些具體實施方式
中，抗角蛋白或CD45的一抗單克隆或多克隆抗體分別與下述任意一種小分子進行共價偶聯(lián)，它們包括但不局限于羅丹明 (rhodamine)，生物素(biotin)，異羥基洋地黃甙(digoxigenin)，Alexa Fluor 系列分子， FITC，及 iTexasRed 等。
在本發(fā)明的其它具體實施方式
中，可特異識別標記在一抗抗體上的小分子的二抗單克隆或多克隆抗體分別與堿性磷酸酶，過氧化物酶或其它酶相共價偶聯(lián)。在本發(fā)明的某個具體實施方式
中，作為另外一種選擇的替代方法，免疫熒光可與經(jīng)可見光識別的免疫組化法相結合。在此方法中，識別角蛋白的一抗單克隆或多克隆抗體被標記上任何顏色的熒光分子，如Alexa Fluor系列，Quantum dot, FITC等，而抗⑶45的一抗被標記上上述小分子以用于過氧化物酶催化的免疫組化可見光顏色反應。這種組合可極大地降低由免疫熒光引起的白細胞表面標示物CD45的非特異染色。自動染色裝置包括自動加樣裝置，孵育裝置和自動清洗裝置。實施例實施例1.從乳腺癌病人外周血中富集循環(huán)腫瘤細胞采集5ml人外周血于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的采血管中(BD，New Jersey,USA) 0離心血樣(700xg，10分鐘)后，可以使用吸液管或者自動吸液裝置來吸除上清以去掉血漿蛋白。將離心后得到的沉淀物重懸于30毫升紅細胞裂解液(BD Pharmingen, California,USA)后，孵育20分鐘。進行標本離心(700xg，10分鐘)以便分離出在上清液中的被裂解的紅細胞碎片。去掉上清后，將沉淀物(即沉積細胞)重懸于5毫升磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)。向其中加入0. 5毫升包被有抗白細胞表面抗原例如CD45的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California, USA)，室溫孵育30分鐘。將所有反應液加到普通50毫升離心管內的5毫升細胞分離介質的頂層，離心400xg，10分鐘。收集所有上清液。上清液離心900xg，10分鐘。離心后得到的沉積細胞重懸于磷酸鹽緩沖液后可做進一步分析。該實施例中的細胞分離介質是這樣制備的5.7%多聚糖(polysucrose)與 9%泛影酸鈉(Sigma，Missouri, UDA)的混合物在高精度數(shù)字密度儀(型號DMA 4500， Anton-Paar，Virginia，USA)于 20°C監(jiān)測下，用 PBS 將其密度調至成 1. 07256-1. 07638 克 / 毫升(gr/ml or gr/cm3)。實施例2.三色法染色從乳腺癌病人外周血中富集的循環(huán)腫瘤細胞富集的循環(huán)腫瘤細胞置于載玻片上，用由磷酸鹽緩沖液配制而成的2%多聚甲醛(paraformaldehyde)室溫固定2小時后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。細胞與含生物素 (Pierce, Illinois, USA)標記的抗角蛋白 8+18+19 單克隆抗體(Abeam, UK, 1 μ g/ml)及羅丹明(Pierce，Illinois, USA)標記的抗CD45單克隆抗體(Abcam，UK, 1 μ g/ml)混合液(由磷酸鹽緩沖液稀釋而成)在室溫孵育30分鐘。載玻片用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后，與含堿性磷酸酶標記的抗生物素單抗(Sigma，Missouri, USA, 1 μ g/ml)及過氧化物酶(Pierce，Illinois, USA)標記的抗羅丹明單抗(Abcam，UK, 1 μ g/ml)混合液(由磷酸鹽緩沖液稀釋而成)室溫孵育30分鐘。載玻片用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后，用Vector Laboraories (California, USA)出產(chǎn)的紅色速染細胞核試劑盒，堿性磷酸酶及過氧化物酶底物試劑盒進行顯色反應。染色結果見附圖。參見附圖1，通過本發(fā)明中的實驗方法對乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞進行富集后，再用基于免疫組化的三色染色法進行染色。圖中所示為普通光學顯微鏡下觀察到的循環(huán)腫瘤細胞。大細胞乳腺癌細胞(tumor cell)，其角蛋白染成藍色，細胞核為粉紅色；小細胞白細胞(WBC)，其表面CD45被染成棕色。實施例3.染色體熒光原位雜交法檢測循環(huán)腫瘤細胞
將富集的腫瘤細胞作為標本置于載玻片上。染色后的標本用20毫克/毫升的RNA 酶處理1小時后，使用SSC緩沖液漂洗玻片。標本用無水乙醇脫水10分鐘后，加熱到70°C 持續(xù)5分鐘變性。標本再用無水乙醇脫水10分鐘，并于45°C與探針雜交孵育過夜。標本用SSC緩沖液洗滌后，用熒光顯微鏡觀察。該標本可以是經(jīng)實例2中的方法染色后的富集腫瘤細胞，進行染色體熒光原位雜交的目的是進一步確定基于免疫組化的三色染色檢測腫瘤細胞的真實性。為了便于快速診斷，標本亦可不經(jīng)抗體染色，而直接進行染色體熒光原位雜交。染色體熒光原位雜交的結果見附圖2。細胞的染色體顯示為紅色和綠色。從紅色或綠色的數(shù)目可以判斷是否染色體發(fā)生變異，是否為腫瘤細胞。實施例4.檢測循環(huán)腫瘤細胞應用于臨床快速評估抗腫瘤化療藥物的療效及腫瘤復發(fā)的監(jiān)測目前臨床上評估化療藥物的療效的常用方法是每3個月為病人做一次CT檢查。如此長的時間間隔對與那些化療效果不佳的病人所造成的傷害是致命性的。而每1-2周進行的檢測循環(huán)腫瘤細胞則在化療開始2-4周后即可為醫(yī)生提供準確的評估數(shù)據(jù)。循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目的降低意味著化療藥物的有效性。反之，如果循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目沒有明顯的改變甚至增高，則意味著病人需接受不同的化療藥物治療。腫瘤復發(fā)意味著原發(fā)灶或轉移灶的腫瘤又進入了活躍期。此時病人血中的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目會明顯升高。對經(jīng)過治療后出院的腫瘤病人進行長期的循環(huán)腫瘤細胞的跟蹤觀察(一般為每3個月檢查一次)，可以為早期判斷腫瘤是否復發(fā)提供非常用力的證據(jù)。本領域的技術人員應當明了，上述優(yōu)選實施例只是對本發(fā)明的具體說明，并不構成對本發(fā)明的限制。根據(jù)需要可以對其進行多種改進，組合，亞組合以及變換，所有的改進， 組合，亞組合、變換以及等效替換都落入在所附的權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括基于免疫組化的染色與免疫熒光相結合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多色染色，以及利用熒光或普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。
2.根據(jù)權利要求1的方法，還包括染色體熒光原位雜交。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述雙色染色是指對所述稀有細胞的標示物如一種或多種角蛋白，以及白細胞的標示物如CD45分別進行染色，所述稀有細胞和所述白細胞被染成不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染色的基礎上對所述稀有細胞的細胞核進行另外一種顏色的染色，或對所述稀有細胞的其他標示物進行第三種顏色的染色，所述染色包括將特異性識別所述稀有細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及特異性識別所述白細胞的一抗單克隆或多克隆抗體與所述富集的稀有細胞進行孵育。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述特異性識別所述稀有細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及所述特異性識別所述白細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體分別與不同的小分子相共價偶聯(lián)，所述小分子選自以下物質羅丹明、生物素、異羥基洋地黃甙、Alexa Fluor系列分子、FITC、及Texas Red，以及類似物質。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述染色包括加入可特異性識別所述小分子的與不同的酶相偶聯(lián)的二抗單克隆或多克隆抗體。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，所述偶聯(lián)的酶是過氧化物酶，或堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶被用于檢測所富集的稀有細胞。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，還包括聯(lián)合使用免疫熒光染色與基于免疫組化的染色及可見光下的觀察，所述免疫熒光用于檢測所述富集的稀有細胞，而所述基于免疫組化的染色則用于白細胞染色。
8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，將抗所述稀有細胞的標示物與抗白細胞的標示物的一抗抗體按任意順序與所述富集的稀有細胞一起進行孵育，或將兩種抗體制備成混合液同時與所述富集的稀有細胞進行孵育。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，在載玻片上或在溶液中對所述富集的稀有細胞進行染色。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述稀有細胞或其它細胞既可直接被共價或非共價偶聯(lián)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲，也可從生物體液樣本中富集。
11.一種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括進行染色體熒光原位雜交，以及利用熒光或普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。
12.一種用于檢測富集的稀有細胞的試劑盒，包括特異性識別所述稀有細胞標示物的共價偶聯(lián)了小分子的一抗單克隆或多克隆抗體，可識別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克隆抗體以及所述酶的相應底物。
13.根據(jù)權利要求12所述的試劑盒，還包括免疫熒光染料標記的抗體。
14.根據(jù)權利要求12所述的試劑盒，還包括用于染色體熒光原位雜交的探針及試劑。
15.根據(jù)權利要求12至14中任一項所述的試劑盒，還包括說明書，用于說明試劑盒的使用。
16.一種對富集的稀有細胞進行檢測的自動化系統(tǒng)，包括基于免疫組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的自動掃描裝置。
17.根據(jù)權利要求16所述的自動化系統(tǒng)，所述染色裝置包括自動加樣器，孵育器和自動清洗裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括進行基于免疫組化的染色與免疫熒光相結合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多色染色，以及利用熒光或普通光學顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。本發(fā)明新穎獨特的富集與染色方法已被證明成本低，且能快速高效及高特異性地富集并定量檢測血中的稀有細胞。
文檔編號G01N33/68GK102313813SQ20111018266
公開日2012年1月11日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權日2008年5月20日
發(fā)明者林平 申請人:北京萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司