專利名稱：一種基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)13:^1 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種高度傳染性疾病。自2006年我國爆發(fā)了由PRRSV變異株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)，其與經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征相比，主要表現(xiàn)為發(fā)病豬持續(xù)高溫41°C以上；各年齡段豬均可出現(xiàn)急性死亡；母豬流產(chǎn)率可達30%以上；仔豬表現(xiàn)為發(fā)病率高達100%，死亡率高達50%以上。我國農(nóng)業(yè)部于2008年底將其列為一類動物傳染病。目前國內(nèi)對PRRS的防控主要采取疫苗免疫為主，使豬群產(chǎn)生免疫抗體以抵御 PRRS侵襲，降低養(yǎng)豬場的風險。而當前部分豬場在免疫PRRS疫苗后，豬群仍有PRRS發(fā)生。 因此能合理客觀及時評估豬場PRRS疫苗免疫效果，為豬群PRRS防控提供科學依據(jù)顯得尤為重要。PRRS疫苗免疫機體后產(chǎn)生中和抗體及非中和抗體，其中中和抗體能夠與病毒表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病毒黏附機體靶細胞受體。故豬體內(nèi)始終保持一定水平的PRRSV 中和抗體，對于維持豬群健康具有重要意義。目前已經(jīng)證明PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中可以產(chǎn)生特異性中和抗體的有GP3、GP4和GP5蛋白，M蛋白也可能產(chǎn)生中和抗體，其中GP5蛋白被公認為是機體產(chǎn)生保護性體液免疫的主要蛋白。通過對國內(nèi)市場使用的PRRS血清抗體檢測試劑盒調(diào)查顯示，主要有PRRS全病毒蛋白和N蛋白為抗原包被的ELISA檢測試劑盒。前者可檢測PRRSV的各種抗體水平，能夠全面體現(xiàn)PRRSV抗體總水平；后者則檢測PRRSV N蛋白的抗體，可以體現(xiàn)早期抗體及主要結(jié)構(gòu)蛋白N抗體水平，但是均不能有效說明機體內(nèi)特異性中和抗體水平，不能客觀地體現(xiàn)機體抵抗病毒的能力和疫苗免疫效果。因此有必要開發(fā)出一種能檢測PRRSV GP5蛋白產(chǎn)生的特異性抗體的商品化試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，選取核苷酸同源性較高的HP PRRSV GZJL株，通過 PRRSV GP5基因原核表達載體的構(gòu)建與表達，建立基于表達產(chǎn)物PRRSV GP5蛋白的iELISA 方法，并進行條件優(yōu)化，以便制備成商品化iELISA試劑盒。該iELISA試劑盒的發(fā)明，將為 PRRS疫苗免疫效果的評價，提供一種更加客觀和有效的指標，減少了生產(chǎn)中PRRS疫苗免疫的盲目性，為PRRS的免疫防控提供技術(shù)支撐?；赑RRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒其組成包括50 200 μ L重組蛋白包被、包被緩沖液 25mL-40mL、酶標二抗 300-500 μ L、IXPBST 緩沖液 800mL-1000mL、陽性對照 lmL、 陰性對照lmL、封閉緩沖液25mL-40mL、底物液A10mL_15mL、底物液B10mL_15mL和終止液10mL-15mLo所述的重組蛋白包被為重組蛋白使用包被緩沖液稀釋為1.8 mg/100yL 3 mg/lOOyL;重組蛋白為PRRSV GP5基因通過大腸桿菌BL21 (DE3)表達系統(tǒng)獲得GP5蛋白， 并通過His · Bind Purification Kit進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白；包被緩沖液為=Na2CO3 1.59 g^NaHCO3 2.93 g溶于去離子水中，定容至1000 mL,調(diào)至 ρ H 9. 5 9. 8。所述的酶標二抗為羊抗豬IgG-HRP。所述的IXPBST 緩沖液為NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g,KH2PO4 0. 2 g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9 g、Tween-20 0. 5 mL 溶于 800 mL 蒸溜水，調(diào)整 pH 為 7. 2 7. 6，定容至 1000 mL。所述的陽性對照為通過PRRS分離毒臨床感染豬獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按1 10 1 200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免PRRS疫苗的豬血清，稀釋度為 1:10 1:200。所述的封閉緩沖液為=BSAO. 3 g (0. 1 0. 5 g)溶于100 mL PBST緩沖液；所述底物液A為Na2HPO4 14. 60 g、檸檬酸9.33 g和過氧化氫脲0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，調(diào)至ρ H 5. 0 5. 4 ；所述底物液B為TMB 20mg和無水乙醇10 mL，加雙蒸水至1 000 mL，過濾除菌，無菌分裝。所述的終止液為0. 2 % 0. 3% HF溶液?；赑RRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒的制備方法，它包括以下步驟 第一，原核表達系統(tǒng)表達融合蛋白His-dGP5，并經(jīng)His · Bind Purification Kit 純化得到融合蛋白，應用SDS-PAGE和Western-blotting分析其純化效果及反應原
性；
第二，步驟一的純化融合蛋白His-dGP5作為包被抗原，進行抗原包被液濃度、抗原包被條件、封閉液、血清稀釋度、封閉時間、酶標二抗稀釋濃度和顯色反應時間iELISA的條件的優(yōu)化；
第三，取40份已知PRRS抗體陰性的豬血清，按步驟二確定的最佳反應條件，進行 iELISA反應。樣本OD63tl值>陰性樣本OD63tl值的平均值(X) +3 (標準差)，可在99%的水平上判為陽性，當樣本OD63tl值<陰性樣本OD63tl值的平均值(X) +3 (標準差)時，判為陰性。本發(fā)明有益效果本發(fā)明方法適用于檢測豬血清PRRSV GP5 IgG，能夠體現(xiàn)機體內(nèi)中和抗體水平，將為PRRS疫苗免疫效果的評價，提供一種更加客觀和有效的指標，減少了生產(chǎn)中PRRS疫苗免疫的盲目性，為PRRS的免疫防控提供技術(shù)支撐。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
(1)效果好GP5抗體水平能夠較好的體現(xiàn)機體抵抗PRRSV侵襲和疫苗免疫效果，減少了生產(chǎn)中PRRS疫苗免疫的盲目性，降低豬場的生產(chǎn)成本。(2)相對于進口的全病毒包被ELISA試劑盒約5000元的銷售價格，本發(fā)
明的PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒單個成本價僅500元，能夠極大降低PRRS血清抗體監(jiān)測成本。


圖1為本發(fā)明的PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒制備生產(chǎn)流程圖。
具體實施例方式
具體實施例方式
基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒原料組成為
PRRS標準陽性和標準陰性血清；重組蛋白為PRRSV GP5基因通過大腸桿菌BL21 (DE3)表達系統(tǒng)獲得GP5蛋白，并通過His · Bind Purification Kit進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白，使用包被緩沖液稀釋為1.8 mg/100yL ^3 mg/ΙΟΟμ L ；包被緩沖液=Na2CO3 1. 59g、NaHCO3 2. 93g溶于去離子水中，定容至IOOOmL, il 至 ρ H9. 6 ；酶標二抗羊抗豬 IgG-HRP ；IXPBST 緩沖液NaCl 8. 0g、KCl 0. 2g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-20 0. 5mL 溶于 800mL 蒸餾水，調(diào)整 pH 為 7. 4，定容至 IOOOmL ；封閉緩沖液=BSAO. 3g溶于IOmL PBST緩沖液；底物液A =Na2HPO4 14. 60g、檸檬酸 9. 33 g、過氧化氫脲0. 52 g，溶于三蒸水，并定容至1 000 mL，調(diào)至pH 5. 2 ；底物液B :TMB 20mg、無水乙醇10 mL，加雙蒸水至1 000 mL，過濾除菌，無菌分裝；終止液0. 25% HF溶液；
如圖1所示意，本發(fā)明的iELISA試劑盒的制備方法為
第二，原核表達系統(tǒng)表達融合蛋白His-dGP5，并經(jīng)His · Bind Purification Kit
純化得到融合蛋白濃度為2. 4 mg/mL，應用SDS-PAGE*Wfestern-blotting分析其純化效果及反應原性；
第二，步驟一的純化融合蛋白His-dGP5作為包被抗原iELISA的條件優(yōu)化為iELISA 方法最佳反應條件為抗原包被液濃度1. 0μ g/ΙΟΟμ L ；血清稀釋度1:10 ；抗原包被條件 370C Ih再室溫12h ；封閉液0. 1%BSA，封閉時間Ih ；酶標二抗稀釋濃度1 2000 ；顯色反應時間 15min ；
第三，取40份已知PRRS抗體陰性的豬血清，按步驟二確定的最佳反應條件，進行 iELISA反應。樣本OD63tl值彡陰性樣本OD63tl值的平均值(X)+3 (標準差)=0.觀5，可在99% 的水平上判為陽性；因此當樣本OD63tl值彡0. 285時，判為陽性；當樣本01)630值< 0. 285時， 判為陰性；
第四，基于重組PRRSV GP5蛋白間接ELISA試劑盒的最佳使用步驟與方法確定
①以2.4 mg/100 μ L重組PRRSV GP5蛋白包被ELISA反應板，4 °C作用12h_16h后，應用PBST洗滌ELISA反應板5次；②以0. 3mg/100 μ L的BSA溶液封閉ELISA反應板，37°C， 封閉Ihlh后，應用PBST洗滌ELISA反應板5次；③將待檢血清用PBST做1 10倍稀釋， 按100 μ L加入ELISA反應板，37°C作用Ih后，應用PBS洗滌ELISA反應板5次；④將羊抗豬IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀釋，按100 μ L加入ELISA反應板，37°C作用Ih后，應用 PBST洗滌ELISA反應板5次；⑤將底物液A和B各50 μ L力口入ELISA反應板，避光室溫顯色 15min,加入50 μ L終止液，立即在酶標儀630nm波長下讀取OD值。⑥試驗結(jié)果判定標準為樣本OD63tl值(樣本OD63tl值>陰性樣本OD63tl值的平均值(X)+3標準差(SD)) > 0. 285為陽性，OD63tl值< 0. 285為陰性;
第五，應用步驟三建立的iELISA方法，檢測PRRS標準陽性血清的OD63tl值為1. 232 ；豬圓環(huán)病毒病標準陽性血清、豬瘟標準陽性血清、豬偽狂犬病標準陽性血清、豬細小病毒病標準陽性血清、豬乙型腦炎準陽性血清的OD63tl值為0. 112 0. M5，確定特異性良好；
第六，應用步驟三建立的iELISA方法，批內(nèi)及批間重復性試驗變異系數(shù)為均< 15. 0%，確定該iELISA批內(nèi)重復性及批間重復性良好；
第七，應用步驟三建立的iELISA方法，檢測368份中和試驗檢測的臨床豬血清樣本，陽性率為55. 4% (204/368)，確定其臨床適用性良好；
第八，步驟五、步驟六和步驟七合格即制得基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒以上第一至第七步驟中按照原料配比進行。
權(quán)利要求
1.一種基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于其組成包括重組蛋白包被5(Γ200 μ L、包被緩沖液25mL-40mL、酶標二抗300-500 μ LUX PBST緩沖液 800mL-1000mL、陽性對照lmL、陰性對照lmL、封閉緩沖液25mL_40mL、底物液A10mL_15mL、底物液 B10mL-15mL 和終止液 10mL_15mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的重組蛋白包被為重組蛋白使用包被緩沖液稀釋為1.8 mg/100yL 3 mg/100yL;重組蛋白為PRRSV GP5基因通過大腸桿菌BL21 (DE3)表達系統(tǒng)獲得GP5蛋白，并通過His · Bind Purification Kit進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白；包被緩沖液為=Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g溶于去離子水中，定容至1000 mL，調(diào)至ρ H 9. 5 9. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的酶標二抗為羊抗豬IgG-HRP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的 IXPBST 緩沖液為NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0. 2 g、Na2HPO4 · 12H20 2.9 g 禾口 Tween-20 0. 5 mL溶于800 mL蒸溜水，調(diào)整pH為7. 2 7. 6，定容至1000 mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的陽性對照為通過PRRS分離毒臨床感染豬獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按 1:10 1:200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免PRRS疫苗的豬血清，稀釋度為 1:10 1:200。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的封閉緩沖液為BSA0. 3 g (0. 1 0. 5 g)溶于100 mL PBST緩沖液；所述底物液A為 Na2HPO4 14. 60 g、檸檬酸9.33 g和過氧化氫脲0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，調(diào)至ρ H 5. 0 5. 4 ；所述底物液B為TMB 20mg和無水乙醇10 mL，加雙蒸水至1 000 mL, 過濾除菌，無菌分裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于所述的終止液為0. 2 % 0. 3% HF溶液。
8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒的制備方法，其特征在于它包括以下步驟原核表達系統(tǒng)表達融合蛋白His-dGP5，并經(jīng)His · Bind Purification Kit純化得到融合蛋白，應用SDS-PAGE和Western-blotting分析其純化效果及反應原性；第二，步驟一的純化融合蛋白His-dGP5作為包被抗原，進行抗原包被液濃度、抗原包被條件、封閉液、血清稀釋度、封閉時間、酶標二抗稀釋濃度和顯色反應時間iELISA的條件的優(yōu)化；第三，取40份已知PRRS抗體陰性的豬血清，按步驟二確定的最佳反應條件，進行 iELISA反應；樣本OD63tl值>陰性樣本OD63tl值的平均值(X) +3 (標準差)，可在99%的水平上判為陽性，當樣本OD63tl值<陰性樣本OD63tl值的平均值(X) +3 (標準差)時，判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于PRRSVGP5蛋白的iELISA試劑盒及制備方法，其組成包括重組蛋白包被50~200μL、包被緩沖液25mL-40mL、酶標二抗300-500μL、1×PBST緩沖液800mL-1000mL、陽性對照1mL、陰性對照1mL、封閉緩沖液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和終止液10mL-15mL。本發(fā)明能監(jiān)測豬血清PRRSVGP5蛋白抗體，將為PRRS疫苗免疫效果的評價，提供一種更加客觀和有效的指標，減少了生產(chǎn)中PRRS疫苗免疫的盲目性，為PRRS的免疫防控提供技術(shù)支撐。
文檔編號G01N33/569GK102353778SQ201110189010
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者周碧君, 文明, 方英, 王開功, 程振濤, 陳軍義 申請人:貴州大學