專利名稱：一種基于量子點的免疫熒光檢測氯霉素的方法及專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于量子點的免疫熒光檢測氯霉素的方法及專用試劑盒。
背景技術(shù)：
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是應(yīng)用廣泛的抗菌素，曾對畜禽疾病控制和治療起到了重要作用。但由于氯霉素存在嚴重的副作用，能引起人的再生障礙性貧血，粒細胞缺乏癥等疾病，歐美等發(fā)達國家已相繼禁止或嚴格禁止用。針對氯霉素在我國一再濫用的狀況，我國在《動物性食品獸藥殘留規(guī)定》中也規(guī)定可食部分不得檢出，并且在出口的日常檢測中，將其列為必檢項目，一旦發(fā)現(xiàn)超標(biāo)，一律禁止出口。目前，用于氯霉素殘留物定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是色譜/質(zhì)譜法，但其樣品前處理過程繁瑣費時，檢測費用高?；诟偁幮悦嘎?lián)免疫反應(yīng)原理的ELISA方法不需進行復(fù)雜的樣品前處理過程，檢測時間相對短，但其精度不夠，只能用于定性篩查，無法用于定量確證。當(dāng)前出口水產(chǎn)品等農(nóng)產(chǎn)品中檢測氯霉素殘留及其污染狀況調(diào)查的樣品數(shù)量大，任務(wù)重，花費高，檢測周期過長。因此，急需檢測結(jié)果穩(wěn)定、 快速、經(jīng)濟的標(biāo)準(zhǔn)方法。量子點(Quantum Dots, QDs)標(biāo)記材料是近年來發(fā)展起來的一類新型材料，包括 II-VI族和III-V族半導(dǎo)體納米晶。由于量子點突出的發(fā)光和吸收特性，使其具有熒光壽命長、寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、很高的光化學(xué)穩(wěn)定性、可進行多色標(biāo)記等優(yōu)越特性，采用其作為標(biāo)記材料，可實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的超微量檢測。由于適用于免疫診斷試劑的量子點標(biāo)記材料必須滿足量子產(chǎn)率高、熒光強、生物相容性好、高度穩(wěn)定及成本低等要求，而現(xiàn)行國外商業(yè)化的量子點其量子產(chǎn)率多在40%以下，其尺寸偏小，需要用激光光學(xué)儀器來照射激發(fā)，目前僅能應(yīng)用在細胞免疫熒光檢測和流式細胞檢測和分選等方面，因此國際市場上還沒有量子點免疫檢測試劑問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測氯霉素的免疫熒光檢測試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測氯霉素的免疫熒光檢測試劑盒，包括氯霉素包被原和量子點標(biāo)記的氯霉素抗體。上述試劑盒中，所述氯霉素抗體為抗體效價為IO6以上(具體為IO6)、抗體親和常數(shù)為IO6 IOi1或IO7 IOi1或IO8M4的氯霉素單克隆抗體；具體為抗體效價為106、抗體親和常數(shù)為IO8M-1的氯霉素單克隆抗體，所述氯霉素單克隆抗體購自云南大學(xué)單克隆抗體工程技術(shù)中心，產(chǎn)品目錄號為CAP-OO1。所述量子點為表面羧基含量為IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的量子點；所述量子點的量子產(chǎn)率為40 70%或50 70%或60% ；所述量子點的激發(fā)光波長為345nm，發(fā)射波長是 620nmo
上述任一所述試劑盒中，所述量子點的粒徑為10 20nm，所述粒徑具體為13 20nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為20nm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，具體為10 20% 之間，再具體為15% ；上述任一所述試劑盒中，所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體中，所述量子點上的羧基與所述氯霉素抗體上的氨基形成肽鍵，進而使所述量子點與所述氯霉素抗體連接。上述任一所述試劑盒中，所述氯霉素包被原為氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物，其中所述氯霉素與所述載體蛋白通過氯霉素中引入的羧基與載體蛋白中的氨基形成的肽鍵而連接；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纖維蛋白原和兔和雞的丙種球蛋白中的任一種。上述任一所述試劑盒中，所述試劑盒中還包括氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、洗滌液、含有孔的聚苯乙烯板、包被緩沖液和封閉液；所述氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品為D-蘇式_(-)-N-[(-(羥基甲基)-(_羥基-對硝基苯乙基]-2，2-二氯乙酰胺；所述稀釋液為PBS緩沖液；具體為0. 02M、pH7. 4的PBS緩沖液。所述洗滌液為PBST緩沖液；具體按照如下方法制備取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 NaN3溶于所述稀釋液中，溶解后用稀釋液定容至1L。所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；具體為0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。所述封閉液為含有用于包被的蛋白的PBS緩沖液；所述用于包被的蛋白為BSAjP 清蛋白和血藍蛋白中的任一種。具體按照如下方法制備將IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀釋液中，溶解后用稀釋液定容至1L。上述任一所述試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為如下溶液形式的標(biāo)準(zhǔn)品用所述稀釋液將所述D-蘇式-(-)-N-[(-(羥基甲基)-(-羥基-對硝基苯乙基]_2，2- 二氯乙酰胺稀釋成如下各個濃度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10ug/L。上述任一所述試劑盒中，所述氯霉素包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上， 包被方法為用所述包被緩沖液稀釋所述氯霉素包被原得到10yg/ml的包被液，每孔中加 100 μ 1。上述任一所述試劑盒中，所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體以如下溶液形式存在于試劑盒中將每25ug所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體用5ml所述稀釋液稀釋得到的溶液。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測樣品中氯霉素的方法。本發(fā)明所提供的檢測樣品中氯霉素的方法，包括如下步驟用上述任一所述的試劑盒對待測樣品進行檢測，所述待測樣品為動物肌肉組織樣本、動物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本。所述待測樣品具體為豬尿。本發(fā)明檢測方法的原理采用量子點作為熒光信號標(biāo)記分子，將氯霉素抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點標(biāo)記的氯霉素抗體，使其形成抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物，用熒光檢測儀激發(fā)并檢測該免疫熒光復(fù)合物的熒光強度，通過與測定形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得待測氯霉素的濃度?？乖?抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是加入量子點標(biāo)記的氯霉素抗體后，包被的氯霉素抗原與檢測樣品中的氯霉素競爭性地結(jié)合氯霉素抗體，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物。
抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是同時加入量子點標(biāo)記的氯霉素抗體及檢測樣品后，包被在聚苯乙烯微孔中的氯霉素抗原與檢測樣品中的氯霉素競爭性地與氯霉素抗體結(jié)合，其中與檢測樣品結(jié)合剩余的氯霉素抗體與包被在微孔板中的氯霉素抗原發(fā)生特異結(jié)合后形成固定在微孔板中的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物。本發(fā)明的氯霉素免疫熒光檢測試劑與量子點標(biāo)記的免疫熒光檢測技術(shù)相關(guān)，是采用量子點作為熒光信號標(biāo)記材料，進行免疫熒光定量測定的一類方法，該技術(shù)整合了熒光量子點納米材料化學(xué)合成、表面修飾及標(biāo)記技術(shù)、間接競爭式免疫檢測技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測氯霉素，在于采用了一種基于量子點標(biāo)記的免疫熒光定量測定的方法，即將氯霉素抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子點標(biāo)記的間接競爭免疫熒光檢測法的測定原理，在加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點標(biāo)記的氯霉素抗體后，通過檢測結(jié)合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物的熒光強度來實現(xiàn)對氯霉素的檢測結(jié)合到聚苯乙烯板微孔的量子點標(biāo)記抗體的數(shù)量不同，所產(chǎn)生的熒光強度也不同。在一定濃度范圍內(nèi)熒光強度值的高低與樣品中的氯霉素的含量成反比。通過添加不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品可制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線查詢各檢測樣品的熒光強度值可得到對應(yīng)的氯霉素藥物的濃度值。其具體的技術(shù)步驟包括(一 )熒光量子點標(biāo)記探針的制備采用適合的水溶性熒光量子點，活化其表面的羧基后，采用化學(xué)偶聯(lián)的方式將氯霉素抗體定向連接到量子點表面。(二)包被抗原采用與牛血清白蛋白偶聯(lián)的氯霉素抗原作為包被抗原，通過物理吸附的方法將此抗原直接包被于聚苯乙烯板微孔中。(三)抗原-抗體熒光免疫復(fù)合物的形成于上述包被好的聚苯乙烯板微孔中加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點標(biāo)記的氯霉素抗體，吸附在孔內(nèi)的氯霉素抗原與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的氯霉素競爭性的與氯霉素抗體相結(jié)合，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物。(四)定量熒光檢測采用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測上述所形成的抗原-抗體熒光免疫復(fù)合物的熒光強度；激發(fā)波長345nm ；發(fā)射波長620nm ；通過測定系列對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強度形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過與測定形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得待測氯霉素的濃度。所述抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是加入量子點標(biāo)記的氯霉素抗體后，包被的氯霉素抗原與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的氯霉素競爭性地結(jié)合氯霉素抗體，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，其上標(biāo)記的量子點經(jīng)激發(fā)后可發(fā)熒光， 本發(fā)明使用的激發(fā)光波長是345nm，發(fā)射波長是620nm，得到發(fā)紅光的抗原-抗體免疫復(fù)合物。所述熒光強度的檢測是用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，由于所采用的抗體是固定濃度的，通常待測樣品中的氯霉素藥物的濃度越高，被抗體捕獲的藥物量越多，與包被的氯霉素抗原結(jié)合的抗體越少，測得的熒光強度值越低。由于量子點在與抗體進行偶聯(lián)中要用超速離心進行分離純化，粒徑太小的量子點如Snm和IOnm的無法離心，偶聯(lián)后無法純化，使用效果較差；粒徑太大的量子點如60nm以上的比較容易聚集，用在試劑盒上均一性較差。所述量子點的粒徑為10 20nm，所述粒徑具體為13 20nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為20nm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，較好為10 20%之間，優(yōu)選15%。量子點的熒光量子產(chǎn)率及其熒光強度直接決定了檢測靈敏度及其準(zhǔn)確性的高低， 傳統(tǒng)方法制備的量子點的熒光量子產(chǎn)率通常都低于40%，熒光強度較弱。為提高其靈敏度及準(zhǔn)確性，所述量子點的量子產(chǎn)率為40 70%，所述量子點的熒光量子產(chǎn)率具體為50 70%，所述量子點的熒光量子產(chǎn)品尤其優(yōu)選為60%。為用于氯霉素殘留物檢測，量子點表面需帶有易于與氯霉素抗體偶聯(lián)的基團，這些基團可以是羧基、氨基等基團，優(yōu)化的基團是帶羧基的表面官能團，通常采用化學(xué)方法連接抗體，即用EDC和NHS活化量子點后，再與抗體發(fā)生羧合反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。在將氯霉素抗體和量子點以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體前，還包括活化所述量子點表面官能團的步驟。量子點表面的羧基含量不同會影響到檢測的靈敏度，為提高靈敏度， 所述官能團具體為羧基，所述羧基的含量為ι χ IO-3 9 X 10-3mmol/mg,所述羧基的含量具體為1 X 10_3 6 X 10_3mmol/mg，所述羧基的含量尤其優(yōu)選為5 X 10_3mmol/mg。在免疫檢測中，抗體的性能指標(biāo)對于檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，通常而言，特異性強、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，為提高靈敏度，所述氯霉素抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA由于氯霉素是小分子物質(zhì)，其分子表面特性不利于與聚苯乙烯微孔板的直接結(jié)合，需要將其與載體蛋白進行偶聯(lián)后才能借助于載體蛋白的表面特性而達成與聚苯乙烯微孔板的良好結(jié)合。可用作載體蛋白的有各種動物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，還有鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白 (Ovalbumin,OVA)、纖維蛋白原或兔和雞的丙種球蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，賴氨酸含量高，自由氨基多，在不同的PH和離子強度下均有較大的溶解度，在含有有機溶劑(如吡啶、DMF等)的情況下均可和半抗原進行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)，是作為載體蛋白的極佳選擇，故本發(fā)明選用BSA作為偶聯(lián)蛋白。本發(fā)明通過對熒光量子點、氯霉素抗原和氯霉素抗體分子特性的研究，通過對各種水溶性熒光量子點制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化，選擇適合的水溶性熒光量子點與特異性的抗體進行定向共價化學(xué)偶聯(lián)，獲得功能性的熒光量子點標(biāo)記探針，并通過優(yōu)化競爭性免疫反應(yīng)的各種條件，達到對氯霉素殘留藥物的快速和高靈敏定量測定。實驗證明，本發(fā)明試劑盒的靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確度高。本發(fā)明方法能實現(xiàn)對氯霉素殘留藥物的定量檢測，并且檢測限低、檢測靈敏度高、特異性好，還適用于多種樣品的檢測。因此，本發(fā)明在氯霉素的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1水溶性Cdk/ZnS熒光量子點電鏡(TEM)照片。圖2用量子點標(biāo)記的間接競爭免疫熒光法檢測氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、檢測試劑盒的組成及制備氯霉素購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，產(chǎn)品目錄號為^57GBW(E)060907。其化學(xué)名稱為D-蘇式-(-)-N-[(-(羥基甲基)-(-羥基-對硝基苯乙基]-2，2- 二氯乙酰胺。1、氯霉素包被原氯霉素與載體蛋白BSA的偶聯(lián)物，氯霉素分子上有羥基，可據(jù)此引入羧基，再與 BSA通過氯霉素中的羧基與BSA中的氨基形成的肽鍵而連接。CAP-BSA抗原的合成采用重氮化法，具體步驟如下1)取50mg氯霉素溶解于Iml無水乙醇溶液中，用lmol/L HCl調(diào)PH至1. 0，然后加入鋅粉65°C反應(yīng)40分鐘，得到反應(yīng)液a ；2)反應(yīng)液a離心(離心的時間為lOmin、離心的離心力為4000g，離心的溫度為 40C )，取上清液，用lmol/L HCl調(diào)pH至1. 0，于4°C逐滴加入180ul濃度為1. 45mol/L的 NaNO2水溶液，充分攪拌反應(yīng)池，得到溶液b ；3)在 IOml 0. 02mol/L, pH 為 7. 4 的 PBS 中力口入 400mg BSA (Sigma-aldrich, 85041C)配制成40g/L的BSA-PBS溶液(溶液c)，4)將Iml步驟2)所得溶液b中加入BSA-PBS溶液10ml，用2mol/l NaOH調(diào)節(jié)至 PH至8. 5，于4°C下進行耦合反應(yīng)Mi ；得到反應(yīng)液d ；5)將反應(yīng)液d于0. 02mol/L, pH為7. 4的PBS中透析48h，每12h更換一次透析液。所得產(chǎn)品用凍干機凍干，于-20°C保存，得到氯霉素抗原。2、氯霉素包被原的包被采用包被緩沖液將氯霉素包被原稀釋為濃度10μ g/ml的包被液，在96孔聚苯乙烯微孔板條中每孔各加100 μ 1，于4°C冰箱放置過夜。第二天棄去包被液、用洗滌液沖洗各板孔3次后，各孔加入200 μ 1封閉液，于37°C封閉處理池。之后棄去封閉液、用洗滌液沖洗各板孔3次后，進行真空抽干、用鋁箔袋密封后放置于-20°C保存。3、量子點標(biāo)記的氯霉素抗體氯霉素抗體為效價為106、親和常數(shù)為IO8M4的氯霉素單克隆抗體，其購自云南大學(xué)單克隆抗體工程技術(shù)中心，產(chǎn)品目錄號為CAP-001。量子點購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為TLS LumiQD 20。該量子點的表征如下粒徑為20nm、粒徑的CV為15%，量子產(chǎn)率為60%，表面羧基含量為 5X 10-3mmol/mg，水溶性，CdSe/SiS核殼結(jié)構(gòu)，激發(fā)光波長為345nm，發(fā)射波長是620nm ；紅色熒光量子點。量子點的掃描圖如圖2所示。所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體中，所述量子點上的羧基與所述氯霉素抗體上的氨基形成肽鍵，進而使所述量子點與所述氯霉素抗體連接。量子點標(biāo)記方法是1)取2. 5mg的上述量子點用0. IM的MES緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl 溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)洗滌并用20000rpm離心富集去上清后，用Iml濃度為0. 1M、 PH值為4. 7的MES緩沖液重懸，加入0. 96mg (終濃度為5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和1. 15mg (終濃度為IOmM) N-羥基丁二酰亞胺(NHS)于其中。反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)半小時后，得到活化后的量子點；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液洗滌，取0. 15mg氯霉素單克隆抗體和2. 5mg 活化后量子點混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液(稱取1. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于 IOOml純水，調(diào)pH至8. 5)中充分混勻。室溫(25°C )下反應(yīng)3. 5小時，讓抗體和量子點形成穩(wěn)定的肽鍵共價結(jié)合，得到含有偶聯(lián)后量子點的反應(yīng)液；3)反應(yīng)結(jié)束后，向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的 BSA(Sigma-Aldrich,85041C)對剩余活性氨基位點進行封閉，反應(yīng)在37°C下進行0. 5小時， 得到含有封閉后量子點的反應(yīng)液；完成后，用pH = 7. 4的0. 02M PBS緩沖液(稱取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4)洗滌，20000rpm 離心
富集去上清，重懸后4°C保存待用，得到量子點標(biāo)記氯霉素抗體。4、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液將氯霉素稀釋成如下各個濃度的溶液0. 001,0. 005、
0.0U0. 05、0· 1、0. 5、l、5、10ug/L ；5、稀釋液0. 02M、ρΗ7· 4 的 PBS 緩沖液；配制稱取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H2O 和 8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4。6、洗滌液=PBST緩沖液；取0. 2ml Tween20及0. Ig的NaN3溶于上述PBS緩沖液中，溶解后用上述PBS緩沖液定容至1L。7、包被緩沖液0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。8、封閉液將IOg BSA和0. 2ml Tween20溶于上述PBS緩沖液中，溶解后用PBS緩沖液定容至1L。實施例2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法在制備好的氯霉素微孔板條中加入濃度為0、0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、
1、5、10ug/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，50ul/孔，將量子點標(biāo)記ENR抗體用PBS-T稀釋液1 50 稀釋[即25ug標(biāo)記抗體5ml稀釋液]，每個微孔中加入50ul，室溫振蕩1小時，洗滌液洗 3次后用熒光酶標(biāo)儀檢測其熒光強度數(shù)值。熒光酶標(biāo)儀設(shè)置為激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長 620nmo將競爭檢測的檢測限定為Β0/Β = 1. 2時(B0為0標(biāo)準(zhǔn)樣檢測值，B為待測樣檢測值)的競爭藥物的質(zhì)量濃度，根據(jù)曲線回歸方程確定檢測體系的靈敏度。檢測結(jié)果如下表 1所示，將檢出限定為0. 001ug/L。表1氯霉素不同濃度樣品的量子點試劑盒檢測值
氯·_素濃度(Ugl)00.0010.0050.010.050.10.51510熒光Testl1.72061.52781.36511.22150.96060.75070.50650.28670.09280.0438強度Test21.86241.56511.33881.15470.96380.71310.58790.27860.11660.049權(quán)利要求
1.一種用于檢測氯霉素的免疫熒光檢測試劑盒，包括氯霉素包被原和量子點標(biāo)記的氯霉素抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述氯霉素抗體為抗體效價為IO6以上、抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1的氯霉素單克隆抗體；所述量子點為表面羧基含量為ι χ 10_3 9X 10_3mmol/mg的水溶性Cdk/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的量子點；所述量子點的量子產(chǎn)率為40 70%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述量子點的粒徑為10 20nm，其粒徑的偏差在10 30%之間；所述氯霉素包被原為氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、洗滌液、含有孔的聚苯乙烯板、包被緩沖液和封閉液；所述氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品為D-蘇式-(-)-N-[(-(羥基甲基)-(-羥基-對硝基苯乙基]_2， 2-二氯乙酰胺；；所述稀釋液為PBS緩沖液；所述洗滌液為PBST緩沖液；所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為含有用于包被的蛋白的PBS緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為如下溶液形式的標(biāo)準(zhǔn)品用所述稀釋液將所述D-蘇式-(-)-N-[(-(羥基甲基)-(-羥基-對硝基苯乙基]-2，2- 二氯乙酰胺；稀釋成如下各個濃度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、 5、10ug/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述氯霉素包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法為用所述包被緩沖液稀釋所述氯霉素包被原得到 10 μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體以如下溶液形式存在于試劑盒中將每25ug所述量子點標(biāo)記的氯霉素抗體用5ml所述稀釋液稀釋得到的溶液。
8.—種檢測樣品中氯霉素的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒對待測樣品進行檢測，所述待測樣品為動物肌肉組織樣本、動物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于量子點的免疫熒光檢測氯霉素的方法及專用試劑盒。本發(fā)明提供的用于檢測氯霉素的免疫熒光檢測試劑盒，包括氯霉素包被原和量子點標(biāo)記的氯霉素抗體。本發(fā)明方法能實現(xiàn)對氯霉素殘留藥物的定量檢測，并且檢測限低、檢測靈敏度高、特異性好，還適用于多種樣品的檢測。因此，本發(fā)明在氯霉素的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK102288765SQ20111018930
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者吳峰, 袁航, 馬嵐 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院