專利名稱：增強和調(diào)節(jié)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光發(fā)射的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增強和調(diào)節(jié)由魯米諾(luminol)、過氧化物酶、氧化劑和電子介質(zhì) (electron mediator)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的新方法。
背景技術(shù)：
由過氧化物酶催化的魯米諾的化學(xué)發(fā)光氧化在抗原、抗體和核酸的分析測試，特別是印跡分析，例如斑點印跡、Western印跡(蛋白質(zhì))、Southern印跡和Northern印跡 (核酸)中具有廣泛應(yīng)用。已知，例如由 L. J.Kricka 在 Clinical Chemistry 1991 ；37 :1472-1481 ；或 L. J. Kricka, J. C :Voyta禾口 I. Bronstein在"Chemiluminescent Methods forDetecting and Quantitating Enzyme Activity", Methods Enzymol. 2000 ；305 :370-390 ^)^ , ^ 加電子介質(zhì)或增強劑可以使得過氧化物酶催化的魯米諾的化學(xué)發(fā)光氧化更快和更有效。幾種化合物已經(jīng)用作電子介質(zhì)，包括G. H. G. Thorpe和L. J. Kricka, Methods Enzymol. 1986 ； 133 331描述的熒光素、6-羥基苯并三唑、對碘苯酚類、對香豆酸；美國專利4，279，950中描述的芳香胺類；歐洲專利申請603953 (1994)中描述的乙酰苯胺類；美國專利5，171,688 中描述的N-取代的吩噻嗪類；美國專利5，629，168中描述的硼酸類(boronic acids)。據(jù)信，在電子介質(zhì)的存在下，過氧化物酶催化的魯米諾氧化按照下列路線進行HRP+H202 — HRP-I(1)
HRP-I+LF — HRP-II+L.-(2)
HRP-II+LF — HRP+L ‘“(3)
HRP-I+E — HRP-II+E —(4)
HRP-II+E — HRP+E ‘"(5)
E. — E+L … (6)
L …一L+LF (7)
L+H202 — LO 廣 (8)
LO廣一AP2> (9)
AP2-* — AP2^hv (10)其中，HRP、HRP-I和HRP-II分別表示原生形式及其兩種氧化形式的過氧化物酶； LH-、L ‘ _、L和L022_代表魯米諾陰離子、魯米諾自由基陰離子、diazaquinone和魯米諾過氧化物；E和E ‘_代表電子介質(zhì)(或初級增強劑)及其相應(yīng)的自由基；最后，AP2-表示3-氨基鄰苯二甲酸的二價陰離子，AP2-*表示其激發(fā)態(tài)。根據(jù)這一路線，過氧化物酶HRP被過氧化物氧化為HRP-I。魯米諾陰離子和初級增強劑被HRP-I氧化為其相應(yīng)的自由基，同時該酶轉(zhuǎn)化為它的HRP-II形式。隨之，HRP-II將另一分子的魯米諾陰離子或初級增強劑氧化為其相應(yīng)的自由基，同時再生為原生形式的HRP酶，原生形式的HRP酶可以參與另一氧化循環(huán)。在電子介質(zhì)E的存在下觀察到的光輸出的增加是由于關(guān)鍵中間體L‘_的更快產(chǎn)生(參見，例如，S. B =Vlasenko, A. A. Arefeyev, A. D. Klimov, B. B. Kim, E. L. Gorovits,A.P.Osipov, Ε. M. Gavrilova, A. M. Yegorov, J. Biolumin. Chemilumin. 1989 ；4 164-176)。 一旦形成，L‘_快速歧化為魯米諾陰離子LH_和diazaquinone L。diazaquinone容易受到過氧化物對羰基(carbonilic)碳(C = 0)的親核攻擊，形成魯米諾過氧化物。最后，魯米諾過氧化物分解為其激發(fā)形式的3-氨基鄰苯二甲酸根AP2—*，同時放出分子氮。激發(fā)狀態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根然后發(fā)出425nm的藍色光子。如美國專利申請2008/0241686 和在 E.Marzocchi，S. Grilli，L. DellaCiana, L. Prodi, M. Mirasoli, A. Roda, Anal. Biochem. 2008 ；277 :189-194 中描述的，通過使用某些酰化催化劑獲得化學(xué)發(fā)光光發(fā)射的進一步的顯著增加。只有在與電子傳遞類型的初級增強劑結(jié)合使用時，屬于4-氨基吡啶類的這些化合物才提供光輸出的進一步的提高。因此， 它們可以被稱為“二級增強劑”，參見，例如，以下參考文獻M.M. Vdovenko，L. DellaCiana, I.Yu.Sakharov, Anal. Biochem. 2009；392 :54-58。雖然美國專利申請2008/0M1686的4-氨基吡啶催化劑對于魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率具有強的作用，但它們難以進行調(diào)節(jié)。甚至非常少量的化合物也產(chǎn)生信號的大幅度增加。此外，與不存在這些化合物時相比，信號衰減快得多。但是，提供能夠產(chǎn)生增加的光輸出并具有相對較低的信號衰減率的配方是有利的。這些特征在需要重復(fù)讀數(shù)時尤其是有價值的。出于這個原因，與使用美國專利申請2008/0M1686的4_氨基吡啶獲得的信號放大相比，提供具有更好的信號放大調(diào)節(jié)水平的二級增強劑是現(xiàn)有技術(shù)的有價值的進步。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種增強和調(diào)節(jié)由魯米諾、過氧化物酶、氧化劑和電子介質(zhì)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的新方法。根據(jù)本發(fā)明，在隨后的權(quán)利要求中指定的組合物能夠?qū)崿F(xiàn)上述目標，這些權(quán)利要求應(yīng)認為構(gòu)成本說明的組成部分。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了屬于N-唑類(N-azoles)的二級增強劑在化學(xué)發(fā)光組合物中的用途。本發(fā)明的二級增強劑特別包括以下N-唑類咪唑、1-甲基咪唑、1， 2，3-三唑禾口 1，2，4-三唑。N-唑被定義為包含至少一個另外的(非碳)氮原子的五元氮雜芳香環(huán)化合物。雖然一般說來且無論目的如何，本發(fā)明涉及唑類增強和調(diào)節(jié)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的用途，但是它主要適用于分析的場合。術(shù)語“分析”指分析物的檢測、半定量和定量。通常，分析的實施要求將光輸出與過氧化物酶的使用量相關(guān)聯(lián)，以使得過氧化物酶是直接測定的物質(zhì)。雖然本發(fā)明可用于確定任何反應(yīng)伴體(魯米諾、過氧化物酶、氧化劑、電子介質(zhì)、作為二級增強劑的N-唑)的存在或量，但反應(yīng)伴體不一定是待測定的物質(zhì)本身。例如，氧化劑可以由前一反應(yīng)或先前的一系列反應(yīng)產(chǎn)生。過氧化物酶或魯米諾可以以與能夠結(jié)合感興趣的分析物的配體(如，例如，用于免疫酶分析以確定抗原的抗體，或確定抗體的抗原)的偶聯(lián)物的形式存在?；蛘咴陔s交分析中過氧化物酶可以與核苷酸、寡核苷酸或核酸偶聯(lián)。因此，本發(fā)明適用于分析物的任何一種診斷分析方法，所述分析物的存在或量與在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中共同反應(yīng)的選自魯米諾、過
4氧化物酶、氧化劑、初級增強劑、作為二級增強劑的N-唑的伴體反應(yīng)的存在或量相關(guān)，檢測或測量化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光發(fā)射以使得待分析的分析物的存在或量與光的產(chǎn)生相關(guān)。本發(fā)明還包括用于進行分析的試劑盒，該試劑盒包括魯米諾、氧化劑、作為初級增強劑的電子介質(zhì)和作為二級增強劑的N-唑。該試劑盒還可以進一步包括過氧化物酶，該酶任選地標記到或適于標記到對于待分析的分析物特異性的配體上。


下面參考附圖只是以舉例的方式描述本發(fā)明，其中圖1顯示以咪唑作為二級增強劑的化學(xué)發(fā)光信號(初始值和900秒時間后的信號衰減百分比)隨PH變化的圖。圖2顯示以1-甲基咪唑作為二級增強劑的化學(xué)發(fā)光信號(初始值和900秒時間后的信號衰減百分比)隨PH變化的圖。圖3顯示以1，2，4_三唑作為二級增強劑的化學(xué)發(fā)光信號(初始值和900秒時間后的信號衰減百分比)隨PH變化的圖。圖4顯示化學(xué)發(fā)光信號隨各種二級增強劑(M0RP、咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3_三唑、 1，2，4-三唑)的濃度變化的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的二級增強劑特別包括以下N-唑類咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3_三唑和1， 2，4-三唑。這些化合物特別可用于需要高和穩(wěn)定的光輸出水平的化學(xué)發(fā)光分析，如印跡分析，包括狗8丨6111、Southern和Northern印跡，以及斑點印跡和核酸雜交分析。咪唑作為過氧草酸酯(peroxyoxalate)化學(xué)發(fā)光的催化劑是公知的(T. Jonsson 禾口 K. Irgum, Anal.Chim. Acta 1999 ；400 :257-264 ；Τ.Jonsson 禾口 K. Irgum, Anal. Chem. 2000 ;72 :1373-1380)。然而，上述系統(tǒng)不能與本發(fā)明的目標相比。因此，被指定為不同的類型，如 K. D. Gundermnann 禾口 F. McCapra 在“Chemiluminescence in Organic Chemistry", Springerl987中所說明的，即第IV類-過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光對第V類-魯米諾和相關(guān)化合物。特別地，已知某些有機草酸酯與過氧化氫反應(yīng)以產(chǎn)生不穩(wěn)定的過氧草酸酯，后者立即分解為C02。將熒光團添加到混合物中，能夠發(fā)生化學(xué)引發(fā)的電子交換的化學(xué)發(fā)光。已知酰化催化劑(如咪唑或4-二甲氨基吡啶)催化過氧草酸酯的形成，從而提高光輸出。這些反應(yīng)發(fā)生在極性非質(zhì)子溶劑(如乙腈)中，且非常迅速，在大約幾秒鐘內(nèi)結(jié)束。 它們顯然不是特別適于免疫酶學(xué)分析的開發(fā)。N-唑增強劑的濃度一般為0. 001至200毫摩爾/升，優(yōu)選0. 1毫摩爾至50毫摩爾 /升。特別地，咪唑濃度一般為0. 1毫摩爾至50毫摩爾/升。在所有情況下，初始光輸出的pH依賴性遵循鐘形曲線。一般在低于9. 1的pH下獲得初始光輸出方面的最好結(jié)果；特別地，在圖1和2中，對于咪唑和1-甲基咪唑在8. 3至 8.6的pH范圍內(nèi)獲得最好的結(jié)果，而在圖3中，對于1，2，4_三唑，最佳條件偏移到較高的 PH區(qū)間，優(yōu)選為8. 6至9. 3。另一方面，作為15分鐘后初始光信號的降低百分比計算的光信號穩(wěn)定性在所有情況下遵循S形曲線。該S形曲線的拐點出現(xiàn)在大約與初始信號的最大值相同的PH值處。
顯示初始光輸出對于二級增強劑濃度的依賴性的曲線圖如圖4中所示。與對于 4-嗎啉代吡啶(MORP)( 一種典型的4-氨基吡啶催化劑)甚至在非常低的濃度下觀察到的光輸出的非常急劇的增加相反，當N-唑類用作二級增強劑時信號強度的上升更為和緩。此外，MORP在6mM濃度下達到最大效應(yīng)，但是隨著濃度進一步提高，其增強效應(yīng)然后急劇減小，而N-唑類或者在非常高的濃度下開始緩慢降低它們的作用(例如，咪唑)，或者它們傾向于達到穩(wěn)定水平(1-甲基咪唑、1，2，4-三唑和1，2，3-三唑)。從這些數(shù)據(jù)可以清楚地看出，與之前已知的4-氨基吡啶類相比，基于N-唑類的二級增強劑的使用允許對于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的控制達到高得多的水平。因此，可以通過使用 N-唑類，緊密地調(diào)節(jié)初始光信號及其持續(xù)時間。這一特性是非常有價值的，因為它允許制備精細調(diào)節(jié)用于特定用途的化學(xué)發(fā)光HRP底物。例如，它可以用于獲得更緩和的增強效應(yīng)以及長得多的信號持續(xù)時間，以最大限度獲得在給定的暴露窗口(window of exposure)產(chǎn)生的光的總量。因此，可以根據(jù)光檢測的方法(例如，具有不一致的特性的膠片對電子設(shè)備， 如電荷耦合器件(CCD))優(yōu)化化學(xué)發(fā)光底物。至于引起觀察到的N-唑類二級增強劑的效應(yīng)的反應(yīng)機制，可能與對于4-氨基吡啶所提出的有一些相似，例如，對于diazaquinone L的親核攻擊，從而產(chǎn)生對于過氧化氫更具反應(yīng)性的中間體。N-唑類和4-氨基吡啶之間的差異可能是由于它們的不同的親核性。至于本發(fā)明的酶底物的其他組分，可適用下面的說明。使用的魯米諾必須具有合適的純度且適于發(fā)光分析。魯米諾可以作為鈉鹽使用。 化學(xué)發(fā)光底物中的魯米諾的濃度一般為0. 1毫摩爾/升至50毫摩爾/升，優(yōu)選是0. 5至10
毫摩爾/升。氧化劑可以是任何能夠氧化魯米諾以產(chǎn)生光的物質(zhì)。優(yōu)選為過氧化物源，如過氧化氫或過硼酸鈉。用于化學(xué)發(fā)光底物中的氧化劑濃度是0. 1至100毫摩爾/升，優(yōu)選0. 5
至10毫摩爾/升。初級增強劑(電子介質(zhì))可以是任何能夠作為氧化劑和魯米諾之間的電子介質(zhì)的電活性物質(zhì)。特別是屬于以下化合物類型的增強劑苯并噻唑類、酚類、芳香胺類、N-烷基吩噻嗪類、靛酚類、芳基硼酸類。優(yōu)選的增強劑為對碘苯酚、對碘苯基硼酸、3_(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鹽或4-(吩噻嗪-10-基)丁烷-1-磺酸鹽。初級增強劑必須具有足夠和合適的純度以用于化學(xué)發(fā)光分析。特別地，它不能含有可以抑制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的雜質(zhì)。按照本發(fā)明的過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光分析中使用的初級增強劑的濃度為0. 001至20 毫摩爾/升，優(yōu)選0. 1至10毫摩爾/升。過氧化物酶是適用于發(fā)光分析中的任何過氧化物酶。特別地，它可以是辣根過氧化物酶，例如Sigma型VI A或IX。它也可以是陰離子過氧化物酶，例如大豆過氧化物酶或甘薯過氧化物酶。過氧化物酶可以是游離的或與配體或者生物聚合物或者固相偶聯(lián)。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)適用于檢測和定量分析物，例如，利用蛋白質(zhì)或核酸與作為示蹤劑的過氧化物和膜之間的鍵的形成。通過向膜加入化學(xué)發(fā)光底物開始發(fā)光反應(yīng)。光發(fā)射被延長，并可以通過膠片、相機或其它儀器測量。如本領(lǐng)域中已知，由魯米諾、過氧化物源(氧化劑)、初級增強劑和作為二級增強劑的N-唑組成的化學(xué)發(fā)光底物可以方便地制備為試劑盒的形式。特別地，魯米諾和過氧化物最好配制為單獨的溶液(小瓶)，例如，A和B，以延長其保存期。初級和二級增強劑以及其他添加劑(如螯合劑和穩(wěn)定劑)可以被添加到魯米諾或過氧化物溶液/小瓶中或這兩者中。這兩個試劑盒溶液還含有緩沖物質(zhì)，并以使得在混合時化學(xué)發(fā)光底物或“工作溶液”達到最佳的PH值的方式配制。過氧化物酶不與其底物組分一起存儲，而是作為單獨的成分， 通常作為與用于感興趣的物質(zhì)/分析物的配體的偶聯(lián)物，并且也可以由最終用戶實行?；诒景l(fā)明的底物溶液的化學(xué)發(fā)光分析包括斑點印跡分析和用于蛋白質(zhì)的 Western印跡分析及用于核酸的Southern和Northern印跡分析。印跡分析使用凝膠電泳以將感興趣的分析物(蛋白質(zhì)或核酸分子)與存在于待測試樣品中的其他組分(其他蛋白質(zhì)或其他核酸分子)分離。分析物和其他組分然后被轉(zhuǎn)移到膜上，在此使用對于分析物特異性的配體(抗體、寡核苷酸探針)探測(檢測)它們。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光底物的另一重要應(yīng)用是用于ELISA免疫酶分析，特別是對于以極少量存在的分析物，如腫瘤標志物、甲狀腺激素、蛋白質(zhì)病毒(HIV、HCV、HPV)或類固醇激素(雌二醇、醛固酮)。進行用于檢測分析物的ELISA分析，該分析包括對感興趣的分析物具有特異性的至少一種配體(檢測劑)。樣品中的分析物非特異性地(通過吸附到表面) 或特異性地(在“夾心”ELISA中，由對于相同分析物具有特異性的另一個配體捕獲)固定在固體載體(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。在分析物固定后，加入檢測劑，從而形成與分析物的復(fù)合物。檢測劑可以共價連接到過氧化物酶，或本身可以由通過生物偶聯(lián)(例如通過生物素或抗生物素蛋白鏈菌素)與過氧化物酶結(jié)合的第二檢測劑檢測。在各步驟之間，通常用溫和的去污劑溶液洗滌板以除去未特異性結(jié)合的任何蛋白質(zhì)或抗體。在最后的洗滌步驟之后，通過加入酶底物(本文所述的化學(xué)發(fā)光底物)使板顯色以產(chǎn)生表明樣品中分析物的量的光信號。
實施例下面的實施例用于說明本發(fā)明的具體方面。然而，它們并不是為了限制本發(fā)明。當然，只要本發(fā)明的原理保持相同，構(gòu)建的細節(jié)和實施方式可以相對于已被描述和通過實施例說明的內(nèi)容廣泛地變化，而不會背離本發(fā)明的范圍。本申請中使用的所有試劑均購自Sigma-Aldrich。使用Varian Eclipse分光熒光計和以下設(shè)置進行實施例中報告的所有測量生物/化學(xué)發(fā)光模式，發(fā)射波長425nm，發(fā)射狹縫20nm ；光電倍增管檢測電壓中等。實施例1 咪唑?qū)τ隰斆字Z-過氧化物-3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉-過氧化物酶反應(yīng)的PH依賴性在0. 15mM的Tris緩沖液，pH 9. 0中，使用以下組成制備化學(xué)發(fā)光底物[魯米諾鈉鹽]=5mM[過硼酸鈉]=4mM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=3mM[咪唑]=10mM。制備一系列的一次性聚甲基丙烯酸甲酯比色杯，各含有2mL的底物溶液。向每個比色杯添加少量的5M HCl或5M NaOH,以調(diào)節(jié)pH到8. 0-10. 0的范圍內(nèi)，而在任何情況下都沒有導(dǎo)致總體積的顯著變化。向每個比色杯添加10 μ L的2 μ g/mL的辣根過氧化物酶溶液 (HRP-型VIA)，同時開始30秒的倒計時。用一方塊paraf ilm封口膜封閉比色杯，并渦旋3秒。然后將比色杯插入分光熒光計中。在30秒倒計時結(jié)束時，開始發(fā)光信號的測量，并記錄900秒的時間。在所有情況下，信號在加入過氧化物酶后30秒內(nèi)達到穩(wěn)定水平，然后開始緩慢下降。初始信號水平以及前900秒之內(nèi)的信號減少百分比相對于pH值繪圖，圖1。實施例2 1-甲基咪唑?qū)τ隰斆字Z-過氧化物-3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉-過氧化物酶反應(yīng)的PH依賴性在0. 15mM的Tris緩沖液，pH 9. 0中，使用以下組成制備化學(xué)發(fā)光底物[魯米諾鈉鹽]=5mM[過硼酸鈉]=4mM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=3mM[1-甲基咪唑]=10mM。使用如實施例2所述同樣的實驗程序。初始信號水平以及前900秒之內(nèi)的信號減少百分比相對于PH值繪圖，圖2。實施例3 :1，2，4-三唑?qū)τ隰斆字Z-過氧化物-3-(吩噻嗪_10_基)丙烷磺酸鈉-過氧化物酶反應(yīng)的PH依賴性在0. 15mM的Tris緩沖液，pH 9. O中，使用以下組成制備化學(xué)發(fā)光底物[魯米諾鈉鹽]=5mM[過硼酸鈉]=4mM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=3mM[1，2，4-三唑]=10福。使用如實施例2所述同樣的實驗程序。初始信號水平以及前900秒之內(nèi)的信號減少百分比相對于PH值繪圖，圖3。實施例4 3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉增強的魯米諾-過氧化物-過氧化物酶反應(yīng)對于二級增強劑濃度的依賴性在0. 15M，pH 9. 00士0. 05的Tris緩沖液中，使用以下組成制備一系列化學(xué)發(fā)光底物[魯米諾鈉鹽]=5mM[過硼酸鈉]=4mM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=3mM二級增強劑M0RP、咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑，具有以下濃度[M0RP] = 0. 025mM,0. 05mM,0. 125mM,0. 25mM,0. 5mM,1. 5mM,3mM,5mM,6. 5mM,8mM, IOmM[咪唑]=1. 5mM, 2mM, 2. 5mM, 3mM, 5mM, IOmM, 15mM, 20mM, 35mM, 45mM, 75mM[1-甲基咪唑]=1. 5mM, 3mM, 5mM, 15mM, 25mM, 35mM, 45mM, 75mM[1，2，3-三唑]=3mM，25mM，55mM，85mM.[1，2，4-三唑]=1. 5mM，3mM，5mM，25mM，45mM，55mM，75mM，85mM。制備一系列的一次性聚甲基丙烯酸甲酯比色杯，每個含有2mL的底物溶液。向每個比色杯添加10 μ L的2 μ g/mL的辣根過氧化物酶溶液(HRP-型VIA)，同時開始30秒的倒計時。用一方塊Parafilm封口膜封閉比色杯，并渦旋3秒。然后將比色杯插入分光熒光計中。在30秒倒計時結(jié)束時，開始發(fā)光信號的測量，并記錄900秒的時間。在所有情況下，信
8號在加入過氧化物酶后30秒內(nèi)達到穩(wěn)定水平，然后開始緩慢下降。初始水平、穩(wěn)定水平相對于二級增強劑濃度繪圖，圖4?？梢钥闯?，即使在非常低的濃度下，MORP對于信號強度的影響是相當強烈的。信號輸出在大約1.5mM的MORP下急劇地達到最大值，然后突然下降。 與之相反，N-唑類對于信號強度發(fā)揮緩和得多的效應(yīng)，在高得多的濃度水平下達到穩(wěn)定水平。因此，它們對于化學(xué)發(fā)光的光輸出提供相當程度的調(diào)節(jié)，使用二烷基氨基吡啶二級增強劑(如M0RP)無法獲得這種調(diào)節(jié)。實施例5 用于通過化學(xué)發(fā)光測量過氧化物酶的底物為了確保長期穩(wěn)定性，化學(xué)發(fā)光底物的成分可以作為單獨的溶液提供，其在需要時可以混合以產(chǎn)生工作溶液。例如，可以通過混合等份的以下溶液獲得用于過氧化物酶測量的工作溶液底物(1)溶液 A 在0. IOM 的 Tris 緩沖液，pH 9. 6 中，[魯米諾鈉鹽]=2mM [3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=0. 3mM[咪唑]=0. 25mM。溶液B 在50M，pH 5. 0的醋酸鹽緩沖液中，[過硼酸鈉]=8mM?；旌先芤篈和B后，工作溶液pH值是9. 0。底物O)溶液A 在0. 25M 的 Tris 緩沖液，pH 9. 6 中，[魯米諾鈉鹽]=IOmM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-I-磺酸鈉]=1.5mM[咪唑]= 1.0mM。溶液B:在50M，pH 5. 0的醋酸鹽緩沖液中，[過硼酸鈉]=8mM?；旌先芤篈和B后，工作溶液pH值是9. 0。底物(3)溶液A:在0. 30M 的 Tris 緩沖液，pH 9. 3 中，[魯米諾鈉鹽]=IOmM[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉]=6mM[咪唑]=40mM。溶液B:在50M，pH 5. 0的醋酸鹽緩沖液中，[過硼酸鈉]=8mM。
混合溶液A和B后，工作溶液PH值是8. 6。實施例6 總Akt Western印跡分析H. iTowbin 等人 Proc. Acad. ki. 76，4；350-4353 (1979)描述了所使用的印跡法。通過在12%十二烷基硫酸鈉(SDQ聚丙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳分離C2C12細胞裂解產(chǎn)物的連續(xù)稀釋液。將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進行Western印跡。用5%的奶粉溶液封閉非特異性結(jié)合位點1小時，然后用洗滌緩沖液OOmM Tris,137mM NaCl)洗滌幾次。然后印跡與以1 20，000稀釋的兔抗總Akt —起溫孵1小時，接著如上述洗滌以除去未與抗原連接的抗體。具有印跡的膜與以HRP (羊抗兔，1 100，000稀釋)標記的第二抗體一起溫孵 1小時。根據(jù)實施例5的底物(2)制備工作溶液。然后將工作溶液加入到膜，并溫孵5分鐘。以1分鐘的曝光使用放射自顯影膠片獲得化學(xué)發(fā)光信號。放射自顯影圖像被掃描和數(shù)字化。結(jié)果與使用市售化學(xué)發(fā)光底物(SuperSignal Dura,ThermoScientific)獲得的那些結(jié)果相當。實施例7 人甲狀腺球蛋白ELISA分析這種免疫計量分析是基于捕獲抗體、抗原(人甲狀腺球蛋白，Tg)和大豆過氧化物酶(SbP)標記的抗體之間的免疫化學(xué)反應(yīng)。通過用生物素化的捕獲抗體的溶液溫孵用抗生物素蛋白鏈菌素涂覆的微孔板制備具有捕獲抗體的孔。然后用市售試劑盒的Tg校準劑溫孵該孔。經(jīng)過在37°C下的1小時溫孵，用PBS-0. 05% Tween-20洗滌板。然后向每孔加入 200 μ L的過氧化物酶標記的抗-Tg抗體溶液。在室溫下溫孵該孔1小時，然后洗滌以除去過量的偶聯(lián)物。將如實施例5底物3制備的化學(xué)發(fā)光工作溶液添加到孔中，并溫孵10分鐘。獲得對于0.2ng/mL的Tg的檢測下限(LOD)。該值與用基于堿性磷酸酶/ 二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)檢測系統(tǒng)的市售試劑盒獲得的LOD是相同的。
權(quán)利要求
1.一種增強由魯米諾、過氧化物酶、氧化劑和初級增強劑的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在二級增強劑的存在下發(fā)生，其中，所述二級增強劑選自N-唑類的化學(xué)類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述二級增強劑選自咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3_三唑和1，2，4-三唑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述過氧化物酶選自辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶和甘薯過氧化物酶。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述過氧化物酶是游離的或與配體偶聯(lián)的。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述氧化劑選自過硼酸鈉和過氧化氫。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述初級增強劑是3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸鈉。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在8.0至10. 0、優(yōu)選8. 3 至9. 3 WpH下進行。
8.一種對于樣品中的分析物進行印跡分析的方法，其中，所述方法采用權(quán)利要求1至 7的任一項所述的增強由魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的方法作為檢測和定量所述分析物的手段。
9.一種對于樣品中的分析物進行ELISA分析的方法，其中，所述方法采用權(quán)利要求1至 7的任一項所述的增強由魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射的方法作為檢測和定量所述分析物的手段。
10.用于進行確定樣品中的分析物的分析的試劑盒，其中，所述試劑盒包括魯米諾、氧化劑、電子介質(zhì)形式的初級增強劑和唑形式的二級增強劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑盒，其中，魯米諾存在于第一小瓶中，所述氧化劑存在于第二小瓶中，其中，所述初級增強劑和二級增強劑存在于第一小瓶中或第二小瓶中或者存在于兩個小瓶中。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括過氧化物酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12的任一項的試劑盒，其中，魯米諾或所述過氧化物酶與能夠結(jié)合分析物的配體偶聯(lián)或適于與其偶聯(lián)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13的任一項的試劑盒，其中，所述二級增強劑選自咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14的任一項的試劑盒，其中，所述氧化物酶選自辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶和甘薯過氧化物酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15的任一項的試劑盒，其中，所述氧化劑選自過硼酸鈉和過氧化氫。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16的任一項的試劑盒，其中，所述初級增強劑是3-(吩噻嗪- ο-基)丙烷-ι-磺酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明提供通過使用屬于N-唑類(即包含至少一個另外的氮原子的五元氮雜芳香環(huán)化合物的類型)的?；呋瘎?二級增強劑)增強和調(diào)節(jié)來自包括魯米諾、過氧化物酶、氧化劑和電子介質(zhì)(初級增強劑)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光發(fā)射的方法。特別可用作二級增強劑的N-唑類為咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。本發(fā)明也描述了包含作為二級增強劑的所述N-唑類的化學(xué)發(fā)光底物在診斷分析中的用途。
文檔編號G01N21/76GK102313732SQ201110191020
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者F·羅德格希羅, L·德拉西亞納, R·佩爾西亞坎特 申請人:喜雅納肯有限公司