專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人源trim25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和抗病育種領(lǐng)域。更具體涉及一種抑制口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth DiseaseVirus, FMDV)增殖的TRIM25基因，同時(shí)還涉及一種抑制口蹄疫病毒增殖的TRIM25基因的制備方法，還涉及一種TRIM25基因在制備治療或預(yù)防FMDV藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界養(yǎng)豬第一大國(guó)。養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，豬肉占肉類(lèi)的 67.7%，是我國(guó)人民動(dòng)物蛋白質(zhì)的最主要來(lái)源。豬病嚴(yán)重制約著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。近年來(lái)， 口蹄疫、豬繁殖與呼吸道綜合征等重大疾病頻頻爆發(fā)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失?？谔阋叩谋┌l(fā)不但影響到經(jīng)濟(jì)發(fā)展、國(guó)際貿(mào)易，而且對(duì)社會(huì)的穩(wěn)定構(gòu)成威脅，因此又稱(chēng)之為“政治經(jīng)濟(jì)病”。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)都將該病列為重要?jiǎng)游飩魅静?，并列入重大跨?guó)動(dòng)物疫病的全球消滅計(jì)劃。在國(guó)際上，口蹄疫(Foot-and-Mouth disease, FMD造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。如2001年2月由英國(guó)引發(fā)的FMD使得法國(guó)、愛(ài)爾蘭、荷蘭等歐盟國(guó)家相繼暴發(fā)該病，南美的阿根廷也暴發(fā)FMD。英國(guó)在此期間共宰殺動(dòng)物達(dá)450萬(wàn)頭，由此造成的全部經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)90億英磅，而且2007年英國(guó)又發(fā)生兩起FMD疫情。有經(jīng)濟(jì)報(bào)告分析，如果畜牧業(yè)十分發(fā)達(dá)的美國(guó)暴發(fā)FMD，當(dāng)年的直接和間接損失將分別是40億美元和400億美元。我國(guó)的FMD疫情非常嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料表明，1999-2003年期間，我國(guó)發(fā)病動(dòng)物總數(shù)達(dá)890616頭(只)，遍及31個(gè)省、市、自治區(qū)，疫情暴發(fā)次數(shù)11 個(gè)，疫點(diǎn)數(shù)2375個(gè)。 2003年4月份以后，0型FMD出現(xiàn)了我國(guó)罕見(jiàn)的基因型毒株，泛亞毒株又卷土重來(lái)。青海和新疆分別發(fā)現(xiàn)了 A型和Asia I型FMD。新疆0型和Asia I型FMD同時(shí)流行，在病畜中還發(fā)現(xiàn)0型和Asia I型混合感染。2009-2010年豬0型FMD耿馬毒在我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)大面積的流行。而且各亞型之間無(wú)明顯的交叉保護(hù)，增加了疫情的復(fù)雜性和控制難度，使防疫工作面臨很大困難。因此如果能培育出抗FMD的豬新品種，將能從根本上解決FMD防控問(wèn)題，而其關(guān)鍵是發(fā)掘抗FMDV復(fù)制的抗性基因。目前研究表明，F(xiàn)MDV對(duì)干擾素非常敏感，干擾素處理的細(xì)胞能夠很好的抑制FMDV的增殖，因而激活干擾素信號(hào)通路的宿主信號(hào)分子具有抗FMDV 復(fù)制的潛力。三基序CTripartite motif, TRIM)蛋白家族包括60多個(gè)成員，在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮多種功能，如細(xì)胞分化、發(fā)育、發(fā)展、凋亡和免疫等(Quaderi et al. , 1997 ；Avela et al.，2000)。TRIM蛋白具有共同的特征性的三基序，三個(gè)鋅指結(jié)合區(qū)，一個(gè)RING指以及1 2個(gè)B-Box和一個(gè)環(huán)狀的環(huán)區(qū)，因而稱(chēng)為RBCC(Boxden，1998)。C末端在不同的分子間存在差異，大多有一個(gè)或更多的特異區(qū)域來(lái)決定該TRIM蛋白特異功能。TRIM RING區(qū)域具有E3 泛素化連接酶活性，介導(dǎo)不同底物的翻譯后修飾。通過(guò)CC區(qū)自我關(guān)聯(lián)，TRIM蛋白寡聚體化并充當(dāng)支架組裝成多蛋白復(fù)合物占特異的細(xì)胞層。最新研究表明，TRIM超家族中的多個(gè)成員由干擾素誘導(dǎo)表達(dá)，并且在參與了多種與天然免疫相關(guān)的生物過(guò)程。TRIM25RING E3泛素連接酶能使病毒RNA受體維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1) 的N段泛素化，進(jìn)而與下游MAVS結(jié)合激活宿主干擾素信號(hào)通路，啟動(dòng)IFN-β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用(McNab et al. ,2011 ；Gack et al. ,2007 ；Gack et al. ,2008 ；Yoneyama and Fujita，2001)。動(dòng)物病毒性疫病的預(yù)防傳統(tǒng)上主要通過(guò)疫苗的免疫預(yù)防接種，在動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中發(fā)揮著極其重要的作用。由于FMDV各亞型之間無(wú)明顯的交叉保護(hù)，增加了疫情的復(fù)雜性和控制難度，使防疫工作面臨很大困難。近年來(lái)隨著轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的快速發(fā)展，動(dòng)物的分子抗病育種得到長(zhǎng)足的進(jìn)步，可以從源頭上控制疫病尤其是病毒性疾病的發(fā)生。分子抗病育種是控制疾病有效的策略之一，如將疫苗免疫和分子抗病育種結(jié)合在一起必將有助于動(dòng)物疫病的控制。以人源FMDV(hFMDV)蛋白為研究對(duì)象，利用過(guò)表達(dá)hTRIM25蛋白的細(xì)胞株來(lái)評(píng)價(jià)hTRIM25對(duì)FMDV增值的影響，為FMDV的抗病毒育種提供優(yōu)良的候選基因奠定基石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是在于提供了一種穩(wěn)定表達(dá)人源TRIM25基因(hTRIM25)的細(xì)胞株BHK21-hTRIM25eGFP。該細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25和綠熒光蛋白eGFP，用于體外研究TRIM25蛋白抗病毒活性的優(yōu)良材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因(hTRIM25)的細(xì)胞株BHK21-hTRIM25eGFP的制備方法，利用自身攜帶的綠熒光eGFP和抗性基因nero的G418， 便于細(xì)胞株的篩選和建立。本發(fā)明另一個(gè)目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒(FMDV)增殖的hTRIM25基因的細(xì)胞株BHK21-hTRIM25eGFP在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒(FMDV)藥物(增殖上)中的應(yīng)用。在BHK-21細(xì)胞上過(guò)表達(dá)hTRIM25，通過(guò)細(xì)胞病變程度可以直接評(píng)價(jià)該蛋白抗病毒活性。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是在于提供了一種hTRIM25基因在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。通過(guò)顯微注射在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因，為研究該蛋白的抗病毒活性提供材料。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株的制備方法，其步驟是A、hTRIM25 基因的獲取參照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物phTRIM25F (5，-TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3，)phTRIM25R(5’ -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3，)提取Hela細(xì)胞RNA為模板，以通用引物擴(kuò)增獲得cDNA后，用特異引物phTRIM25F 和phTRIM25R擴(kuò)增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分別引入EcoRI和XhoI，便于進(jìn)行亞克隆。其反應(yīng)體系為模板 cDNA 5. 0 μ L，10XLA buffer 5. 0 μ L, phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (終濃度為 10pmol/L)，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0μ L，力口 ddH20 至 50. 0μ L。 按94°C作用3分鐘；然后94°C作用30秒分鐘，58°C退火30秒，72°C延伸3分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8% (g/v) 的瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小1893bp帶為hTRIM25基因。B、真核表達(dá)載體pCA_hTRIM25eGFP的構(gòu)建通過(guò)EcoRI和XhoI將hTRIM25連入pCA載體，獲得pCA-hTRIM25。然后用Sail和 XhoI分別酶切pEGFP-Cl和pCA_hTRIM25，回收載體pEGFP-Cl和含有啟動(dòng)子和hTRIM25片段并用T41igaSe連接，提取重組質(zhì)粒，分別通過(guò)EcoRI和HindIII酶切鑒定，結(jié)果表明成功獲得 pCA-hTRIM25eGFP (見(jiàn)圖 1B)。C、穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因的BHK21_hTRIM25eGFP細(xì)胞株的構(gòu)建通過(guò)脂質(zhì)體法Lipofectamine 2000(Invitrogen)將 pCA-eGFP 和 pCA-hTRIM25eGFPG 轉(zhuǎn)染 BHK-21(baby hamster kidney, ATCC CCL10)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 36 小時(shí)后用SOOyg/μ L G418篩選，進(jìn)行5輪后，通過(guò)間接免疫熒光和Wfestern blotting鑒定 hTRIM25蛋白的表達(dá)情況，并命名為BHK21-hTRIM25eGFP。①間接免疫熒光鑒定hTRIM25蛋白的表達(dá)將BHK-eGFP和轉(zhuǎn)染人源TRIM25的BHK_TRIM2kGFP細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，進(jìn)行間接免疫熒光。多聚甲醛固定，一抗為抗V5單克隆抗體 anvitrogen)，二抗為抗鼠的Ig-G-RFP FITC0由于綠熒光蛋白與hTRIM25融合，所以細(xì)胞直接在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光信號(hào)，初步表明外源基因表達(dá)情況。進(jìn)而用抗V5 抗體進(jìn)行間接免疫熒光，紅色熒光信號(hào)表明hTRIM25的表達(dá)。一種分離的細(xì)胞株，其序列為 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，表明成功構(gòu)建細(xì)胞株BHK21-hTRIM25eGFP。②Western blotting鑒定外源基因hTRIM25的表達(dá)收集長(zhǎng)滿(mǎn)單層BHK-eGFP和BHK_hTRIM25eGFP細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western blotting檢測(cè)。所用一抗為抗V5單克隆抗體Qnvitrogen)，二抗是HRP標(biāo)記的鼠抗兔單克隆抗體。結(jié)果在BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞中有75KD的特異性陽(yáng)性帶，與hTRIM25 蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP細(xì)胞陰性，表明BHK21_hTRIM25eGFP細(xì)胞株中hTRIM25有效表達(dá)(如圖2B)。通過(guò)間接免疫熒光和Wfestern blotting表明所建立BHK21_hTRIM25eGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25蛋白。由于hTRIM25蛋白理論上通過(guò)RING E3泛素連接酶使病毒RNA 受體維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)的N段泛素化，進(jìn)而與下游MAVS結(jié)合激活宿主干擾素信號(hào)通路，啟動(dòng)IFN-β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用，進(jìn)而通過(guò)抗病毒活性研究其生物功能。一種穩(wěn)定表達(dá)人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是為了研究hTRIM25基因?qū)MDV增殖的影響，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別接種 BHK-eGFP 和 BHK-TRIM25-eGFP，0. 8X104cells/well。次日分別用 0 型 FMDV 進(jìn)行病毒感染， 感染劑量為 IOOTCID5q (0.0125M0I)，每孔接種 100 μ 1, 37°C, 5% (v/v) C02 吸附 lh。Ih 后吸棄上清，補(bǔ)加200 μ 1維持液。分別在感染后不同的時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞情況并收集上清，進(jìn)而測(cè)定TCID5tl(如圖3)。一種抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是
為了在機(jī)體水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用PCA_hTRIM25eGFP，通過(guò)顯微注射進(jìn)行轉(zhuǎn)基因豬的研究，圖4為轉(zhuǎn)基因豬第一代產(chǎn)仔豬的DNA檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明所構(gòu)建的BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25蛋白。2.本發(fā)明是穩(wěn)定表達(dá)hTRHC5基因的細(xì)胞株BHK21_hTRIM25eGFP能夠抑制口蹄疫
病毒復(fù)制。3.本發(fā)明的hTRIM25基因可以用來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。


圖1為構(gòu)建真核質(zhì)粒pCA-eGFP和PCA_hTRIM25eGFPG的示意圖以及酶切鑒定IA為構(gòu)建真核質(zhì)粒pCA-eGFP和pCA_hTRIM25eGFPG的示意圖。圖IB為利用EcoRI和HindIII分別進(jìn)行酶切鑒定圖。圖2為一種人源TRIM25基因在BHK21細(xì)胞中表達(dá)圖譜示意圖。利用自身表達(dá)的綠熒光和抗V5標(biāo)簽的間接免疫熒光的鑒定BHK21_hTRIM25eGFP 細(xì)胞株(2A)；抗V5抗體進(jìn)行Western-blotting進(jìn)一步鑒定hTRIM25的表達(dá)，大小為 75KDa(2B)。圖3為一種穩(wěn)定表達(dá)人源TRIM25基因細(xì)胞株抑制口蹄疫病毒增殖的圖譜示意圖。將BHK-eGFP和BHK21_hTRIM25eGFP細(xì)胞分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 0. 8X104cells/welL·次日用0.0125M0I 0型和A型FMDV進(jìn)行病毒感染，分別于感染后不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞病變并取樣測(cè)定病毒含量。結(jié)果表明在Mh時(shí)，BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞細(xì)胞病變很少，而B(niǎo)HK-eGFP細(xì)胞病變程度很?chē)?yán)重，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落(A)。測(cè)定結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)病毒含量(半數(shù)組織培養(yǎng)感染計(jì)量TCID5tl，如B所示)，統(tǒng)計(jì)表明hTRIM25能顯著抑制FMDV的增殖(C)。圖4為轉(zhuǎn)基因母豬所產(chǎn)第一代仔豬樣品DNA檢測(cè)圖。通過(guò)顯微注射胚胎于母豬受孕，所產(chǎn)仔豬耳部樣品提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增外源基因hTRIM25結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株的構(gòu)建1、人源TRIM25基因的合成參照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物pTRIM25F (5， -TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3，)pTRIM25R (5， -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3，)提取Hela細(xì)胞RNA為模板，以通用引物擴(kuò)增獲得cDNA后，用特異引物phTRIM25F 和phTRIM25R擴(kuò)增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分別引入EcoRI和XhoI，便于進(jìn)行亞克隆。其反應(yīng)體系為模板質(zhì)粒 cDNA5. 0yL，10XLAbuffer 5 μ L，phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (終濃度為 10pmol/L)，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按94°C作用3分鐘；然后94°C作用30秒分鐘，58°C退火30秒，72°C延伸3分鐘，共35個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸10分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8% (g/v)的瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小1893bp為hTRIM25基因。2、真核表達(dá)載體pCA_hTRIM25eGFP的構(gòu)建通過(guò)EcoRI和XhoI將hTRIM25連入pCA載體，獲得pCA_hTRIM25。然后用SalI和 XhoI分別酶切pEGFP-Cl和pCA_hTRIM25，回收載體pEGFP-Cl和含有啟動(dòng)子和hTRIM25片段并用T41igaSe連接，提取重組質(zhì)粒，分別通過(guò)EcoRI和HindIII酶切鑒定，結(jié)果表明成功獲得 pCA-hTRIM25eGFP (見(jiàn)圖 1B)。3、穩(wěn)定表達(dá)人源TRIM25基因的BHK21hTRIM2kGFP細(xì)胞株的構(gòu)建用pCA-eGFP 和 pCA_hTRIM25eGFPG 共轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 36 小時(shí)后用 800 μ g/ μ LG418進(jìn)行篩選，進(jìn)行多輪篩選后，通過(guò)間接免疫熒光和Western-blotting鑒定外源基因hTRIM25的表達(dá)情況。(a)、間接免疫熒光鑒定hTRIM25的表達(dá)將BHK-eGFP和轉(zhuǎn)染人源TRIM25的BHK_TRIM2kGFP細(xì)胞接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，進(jìn)行間接免疫熒光，具體步驟如下1.吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次，每次5min ；2.吸棄PBS，每孔加Iml 4% (ν/ν)多聚甲醛，室溫?fù)u床作用30分鐘；3.吸棄4% (ν/ν)多聚甲醛，用PBS洗細(xì)胞3次，每次IOmin ；4.吸干 PBS,每孔加 1ML0. 2% (v/v) TrotonX-IOO 的 PBSA,冰上作用 5min ；5.用PBS洗細(xì)胞3次，每次!Bmin ；6.每孔加Iml 1% (g/v) BSA的PBS，室溫作用封閉Ih ；7.用PBS洗細(xì)胞1次，每次!Bmin ；8.加入一抗(anti-V antibody 1 200,) :300ul PBSA+1. 5ul anti-V antibody, IOOul/ 孔；9. 37°C 作用 Ih (CO2 培養(yǎng)箱)；10.用PBS洗細(xì)胞3次，每次!Bmin ；11.加入二抗(抗鼠的 Ig-G-RFP FITC antibody 1 100) :300ul PBSA+3. Oul FITC antibody+6. Oul DAPI (500ug/ml)，IOOul/ 孔；避光操作。12. 37°C 作用 Ih (C02 培養(yǎng)箱)；13.用PBS洗細(xì)胞3次，每次!Bmin ；14.熒光顯微鏡下觀察紅熒光情況，結(jié)果見(jiàn)附圖2A。由于BHK-TRIM2MGFP細(xì)胞自身有綠熒光，所以在熒光顯微鏡下可以直接觀察到綠色熒光信號(hào)。利用V5標(biāo)簽單克隆抗體，紅熒光檢測(cè)hTRIM25的表達(dá)，紅色信號(hào)表明 hTRIM25有效表達(dá)。另外藍(lán)色為細(xì)胞核的染色情況。(b)、Western blotting 鑒定 hTRIM25 的表達(dá)將長(zhǎng)滿(mǎn)單層BHK-eGFP和BHK_TRIM2kGFP細(xì)胞收集，提取蛋白，12 % SDS-PAGE 電泳后利用抗體為抗V5(Invitrogen)的單克隆抗體進(jìn)行Wfestern blot檢測(cè)。同時(shí)以 β -actin為內(nèi)參，結(jié)果表明BHK-TRIM2MGFP細(xì)胞有一條特異性條帶，大小為75KD，與預(yù)期結(jié)果一直，而B(niǎo)HK-eGFP細(xì)胞陰性(附圖2B)。
實(shí)施例2 一種抑制FMDV增殖的TRIM25基因的細(xì)胞株BHK21_hTRIM25eGFP在制備治療或預(yù)防FMDV藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是為了研究hTRIM25基因?qū)MDV增殖的影響，分別在感染后不同的時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)情況并收集上清，測(cè)定其病毒含量(TCID5tl)。1、FMDV感染細(xì)胞后形態(tài)學(xué)觀察為了觀察hTRIM25蛋白對(duì)FMDV增殖的影響，用相同劑量的FMDV(0. 0125M0I)感染BHK2 l-hTRIM25eGFP和ΒΗΚ-eGFP細(xì)胞，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞所致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)(附圖3A)。結(jié)果表明感染后Mi可以發(fā)現(xiàn)BHK-eGFP細(xì)胞中有明顯的細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙擴(kuò)大。而B(niǎo)HK-hTRIM25eGFP細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，直到感染后36h BHK-hTRIM25eGFP細(xì)胞才有的典型CPE。2、病毒滴度的測(cè)定為了量化hTRIM25蛋白對(duì)FMDV的抑制效果，測(cè)定病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)樣品中 FMDV的滴度。具體操作如下將BHK-eGFP 和 BHK_hTRIM25eGFP 細(xì)胞以 0. 8 X 104cells/well 量分別接種 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日用0.0125M0I 0型FMDV進(jìn)行病毒感染，每孔接種100 μ 1，各3個(gè)重復(fù)。37°C， 5% CO2吸附lh。Ih后吸棄上清，補(bǔ)加200 μ 1 2%胎牛血清的DMEM。分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞所致細(xì)胞病變效應(yīng)并收集上清，進(jìn)而測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品中病毒的滴度。按Reed-Muench法測(cè)定病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID5tl)(結(jié)果見(jiàn)附圖。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明感染BHK-hTRIM25eGFP細(xì)胞組病毒含量一直低于BHK-eGFP細(xì)胞感染組，滴度低 IO3倍，表明hTRIM25能顯著抑制FMDV的增殖(附圖3C)。實(shí)施例3 一種抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是為了在機(jī)體水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用PCA_hTRIM25eGFP，通過(guò)顯微注射進(jìn)行轉(zhuǎn)基因豬的研究，圖4為轉(zhuǎn)基因豬第一代產(chǎn)仔豬的DNA檢測(cè)結(jié)果。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書(shū)限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株的制備方法，其步驟是A、hTRIM25基因的獲取參照人源TRIM25基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物phTRIM25F :5’ -TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3’ ；phTRIM25R 5' -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3’ ；提取Hela細(xì)胞RNA為模板，以通用引物擴(kuò)增獲得cDNA后，用特異引物phTRIM25F和 phTRIM25R擴(kuò)增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分別弓|入feoRI和XhoI，進(jìn)行亞克隆，其反應(yīng)體系為模板 cDNA 5. 0 μ L, 1 OXLA buffer 5. 0 μ L, phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L 終濃度為 10pmol/L，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50. 0 μ L，按 94°C 作用3分鐘；然后94°C作用30秒分鐘，58 °C退火30秒，72 °C延伸3分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%g/v的瓊脂糖凝膠電泳，一條大小1893bp帶為hTRIM25基因；B、真核表達(dá)載體pCA-hTRIM25eGFP的構(gòu)建通過(guò)和ZAoI將hTRIM25連入pCA載體，獲得pCA_hTRIM25，然后用Sal\和損οI 分別酶切pEGFP-Cl和pCA-hTRIM25，回收載體pEGFP-Cl和含有啟動(dòng)子和hTRIM25片段并用T4 Iigase連接，提取重組質(zhì)粒，分別通過(guò)和歷^dIII酶切鑒定，結(jié)果表明成功獲得 pCA-hTRIM25eGFP ；C、穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞株的構(gòu)建通過(guò)脂質(zhì)體法 Lipofectamine 2000 將 pCA-eGFP 和 pCA_hTRIM25eGFPG 轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36小時(shí)后用800 μ g/μ L G418篩選，進(jìn)行5輪后，通過(guò)間接免疫熒光和Western blotting 鑒定 hTRIM25 蛋白的表達(dá)，為 BHK21- hTRIM25eGFP ；①間接免疫熒光鑒定hTRIM25蛋白的表達(dá)將BHK-eGFP和轉(zhuǎn)染人源TRIM25的BHK-TRIM2MGFP細(xì)胞接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，進(jìn)行間接免疫熒光，多聚甲醛固定，一抗為抗V5單克隆抗體，二抗為抗鼠的Ig-G-RFP FITC，綠熒光蛋白與hTRIM25融合，細(xì)胞直接在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號(hào)，用抗V5抗體進(jìn)行間接免疫熒光，紅色熒光信號(hào)表明hTRIM25的表達(dá)，構(gòu)建細(xì)胞株 BHK21-hTRIM25eGFP ；②Westernblotting鑒定外源基因hTRIM25的表達(dá)收集長(zhǎng)滿(mǎn)單層BHK-eGFP和BHK_hTRIM25eGFP細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western blotting檢測(cè)，一抗為抗V5單克隆抗體，二抗是HRP標(biāo)記的鼠抗兔單克隆抗體，結(jié)果在BHK21- hTRIM25eGFP細(xì)胞中有75KD的特異性陽(yáng)性帶，與hTRIM25蛋白大小相符，正常 BHK-eGFP細(xì)胞陰性，表明BHK21- hTRIM25eGFP細(xì)胞株中hTRIM25有效表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的一種人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株在制備治療或預(yù)防 FMDV藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的一種人源TRIM25基因在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒細(xì)胞株的制備方法和應(yīng)用，其步驟A、hTRIM25基因的獲取參照人源TRIM25基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物；B、真核表達(dá)載體pCA-hTRIM25eGFP的構(gòu)建通過(guò)EcoRI和XhoI將hTRIM25連入pCA載體，獲得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分別酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收載體pEGFP-C1和含有啟動(dòng)子和hTRIM25片段并用T4ligase連接，提取重組質(zhì)粒，分別通過(guò)EcoRI和HindIII酶切鑒定；C、穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞株的構(gòu)建通過(guò)脂質(zhì)體法Lipofectamine2000將pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后篩選，通過(guò)間接免疫熒光和Westernblotting鑒定hTRIM25蛋白的表達(dá)，為BHK21-hTRIM25eGFP。該株在制備治療或預(yù)防FMDV藥物中的應(yīng)用。構(gòu)建的BHK21-hTRIM25eGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25蛋白；穩(wěn)定表達(dá)hTRIM25基因的細(xì)胞株BHK21-hTRIM25eGFP能夠抑制口蹄疫病毒復(fù)制；hTRIM25基因用來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102321627SQ20111019107
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者劉莎莎, 周銳, 李祥敏, 許晉芳, 金梅林, 錢(qián)平, 陳煥春 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)