專利名稱：一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法。
背景技術：
在防病治病方面，中藥復方提取制劑占據著重要的位置，中藥提取之后，其植物組織已不符存在，顯微鑒別亦無能為力，所以其質量控制方法都是以各種有效成分為指標，進行薄層鑒別與含量測定。但在各類國家質量標準中，薄層鑒別多是處理一個樣品溶液，一塊薄層板，展開一次，一種顯色劑，鑒別一味藥材。為排除干擾，樣品的前處理程序多復雜、煩瑣，需用大量的有機試劑反復純化處理，費力、費時、費試劑、污染環(huán)境，危害健康，檢測周期長。這樣，一個含6 7項薄層鑒別和二項含量測定的質量標準檢測完成，一般要花費一周的時間，如遇復試，時間翻倍，檢測速度嚴重制約著中藥現代化生產速度。所以尋找簡便、快捷的檢測方法、提高檢測效率、降低檢測成本，成為中藥質量控制必須突破的難關。以中國藥典2010年版一部收載的金蒲膠囊質量標準為例剖析如下。該標準項下收載了 7項薄層鑒別和兩項含量測定。具體方法如下鑒別(1)取本品內容物4g，加甲醇20ml，浸漬10分鐘，濾過，取濾液10ml，蒸干， 殘渣加水IOml使溶解，再加鹽酸1ml，置水浴中加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷Iml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0. Ig,同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為15 5 1的30 60°C的石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，斑點變成紅色。(2)取本品內容物4g，加濃氨試液Iml與三氯甲烷20ml，浸漬1小時，時時振搖，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇5ml使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索乙素對照品，加乙醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液20μ 1、對照品溶液1μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為10 6 1的正己烷-三氯甲烷-甲醇為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏至斑點顯色清晰，揮盡薄層板上吸附的碘，置紫外光燈365nm 下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。(3)取本品內容物3g，加三氯甲烷25ml，加熱回流5小時，濾過，濾液中加活性炭 0. 3g，振搖，放置30分鐘，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加三氯甲烷Iml使溶解，作為供試品溶液。另取華蟾酥毒基對照品，加三氯甲烷制成每Iml含2mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液ΙΟμΙ、對照品溶液2μ1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為4 :3:3 的環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。(4)取本品內容物6g，加80%丙酮溶液20ml，超聲處理30分鐘，靜置，取上清液， 作為供試品溶液。另取紅花對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各 ΙΟμΙ，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為7 0.4 2 3的乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。(5)取本品內容物6g，加甲醇50ml，加熱回流1小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20ml，取正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗至中性，取正丁醇液，蒸干， 殘渣加甲醇Iml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每Iml含Img 的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液IOy 1、對照品溶液5μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為13 7 2的三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液為展開劑，展開，取出， 晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點；置紫外光燈365nm下檢視，顯相同顏色的熒光斑點。(6)取本品內容物5g，加三氯甲烷20ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇Iml使溶解，作為供試品溶液。另取膽酸對照品，加乙醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液10 μ 1、對照品溶液4 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為15 7 5的異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上， 顯相同顏色的斑點。(7)取本品內容物10g，加三氯甲烷30ml，加熱回流4小時，放冷，濾過，濾液蒸干， 殘渣加三氯甲烷Iml使溶解，作為供試品溶液。另取穿山甲對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各ΙΟμΙ，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為20 1 的甲苯-丙酮為展開劑，展開，取出，晾干。噴以體積比為9 1的醋酐-硫酸的混合溶液， 80°C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
苦參含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為 18 18 70 0.1的乙腈-甲醇-pH6.8的磷酸鹽緩沖液-三乙胺為流動相，檢測波長為 220nm,理論板數，按苦參堿峰計算不低于8000。對照品溶液制備取苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含60 μ g的溶液，即得。供試品溶液制備取裝量差異項下的本品內容物，研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨溶液2ml使?jié)駶?，再加三氯甲?5ml，以功率250w，頻率33kHz，超聲處理20分鐘，濾過，取濾液，再用三氯甲烷洗滌殘渣、容器及濾器4次，每次5ml，濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。本品每粒含苦參以苦參堿C16H24N2O計，不得少于0. 16mg。蟾酥含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為 43.5 56. 5的乙腈-水為流動相，檢測波長為^2nm，理論板數，按華蟾酥毒基峰計算應不低于4000。對照品溶液制備取華蟾酥毒基對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含 0. 16mg的溶液，即得。供試品溶液制備取本品40粒的內容物，精密稱定，混勻，研細，取約5g，精密稱定， 置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流5小時，濾過，濾液加活性炭0. 3g，振搖，放置5 分鐘，濾過，用三氯甲烷10ml，分次洗滌濾器及濾渣，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。本品每粒含蟾酥以華蟾酥毒基C26H34O6計，不得少于25 μ g。上述例子中的7項薄層鑒別，粗略地計算一下，7項薄層鑒別僅樣品前處理時間， 就要花費20小時，樣品38g，有機溶劑370ml，加上展開劑70ml與展開時間14小時，1批樣品的薄層鑒別，就要花去約5天的時間與440ml有機溶劑。加上苦參與蟾酥的定量測定時間3天，樣品處理溶劑165ml，流動相中的有機相330ml，一批樣品的薄層鑒別和定量測定完成，需時間8天，有機試劑770ml。如遇復試，得到檢測結果，就需半月時間，檢測速度無法與機械化大生產相匹配。提高檢測效率、降低檢測成本、減少環(huán)境污染，成了檢測人員刻不容緩的奮斗目標，我們就是在該背景條件下，發(fā)明了一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法。該止咳片，由黃芩、蜜炙枇杷葉、蜜炙麻黃、苦杏仁、前胡、桑白皮、瓜蔞、苦杏仁、金銀花、竹茹十味中藥組成，配比如下
黃芩150-190份蜜炙枇杷葉280-350份蜜炙麻黃150-200份苦杏仁150-200份前胡250-320份桑白皮250-320份瓜 蔞280-310份桔梗160-200份金銀花250-300份竹 茹250-320份上述處方中的十味中藥，蜜炙枇把葉、蜜炙麻黃、苦杏仁、前胡用8-10倍量 40-70%乙醇提取1-3次，每次1-3小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，備用； 桑白皮、竹茹、瓜蔞、桔梗、金銀花，加8-10倍量水煎煮至沸，加入黃芩，煎煮1-3次，每次1-3 小時，合并提取液，濾過，濾液濃縮至在60°C測定相對密度為1.05-1. 10清膏，加乙醇，使含醇量達70-75%，冷藏放置20-M小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，與醇提液合并，濃縮至在60°C測定相對密度為1. 10-1. 18清膏，噴霧干燥。取噴霧粉與10-30%淀粉，混勻，制粒，加0. 1-0.5%的硬脂酸鎂，壓片，包薄膜衣，即得。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是針對檢測速度無法與機械化大生產相匹配的難點，發(fā)明了采用同一供試品溶液與甲醇超聲的各藥材的上清溶液，在4塊薄層板上，簡便、快捷地完成前胡、黃芩、 麻黃、枇杷葉、金銀花、苦杏仁六味藥材鑒別。為排除干擾，采用另一種供試品溶液，完成桔梗藥材的鑒別。并用同一非緩沖鹽流動相，以等度洗脫的方式，20分鐘內同時測定鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷。
該發(fā)明7味藥材的薄層鑒別，三種有效成分的定量測定，一共需用供試樣品5. 5g， 前處理時間2小時，加上薄層展開與定量測定的時間、溶劑，總花費溶劑220ml，時間2天， 與上述的金蒲膠囊比較，都是7味藥材的薄層鑒別與2-3種成分的定量測定，本發(fā)明可提高檢測效率4倍，節(jié)約供試品86%、有機溶劑74%，是一套簡便、快捷、高效、低耗、低污染、多指標控制藥品質量的現代化標準。其中前胡、黃芩、麻黃和苦杏仁的薄層鑒別以及鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的同時定量測定為首次報道。本研究中樣品以含水甲醇提取后，吸取一定量，通過氧化鋁柱除雜，含水甲醇洗脫，濾過，續(xù)濾液進樣的程序，去除了綠原酸、黃芩苷等酸性成分的干擾，使供試品溶液成為近無色的澄清溶液。首次以普通的反相色譜柱，非緩沖鹽體系，體積比為4. 5 9 86.5 的乙腈-甲醇-0. 磷酸為流動相，進行了鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的同時定量測定，待測成分波峰分離良好，色譜柱耐用性廣。通過方法學考察，鹽酸麻黃堿進樣量在0. 0505 0. 505 μ g，與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Y = 2294941. 7X+1112，y = 0. 999997 (見表1、圖8)；苦杏仁苷進樣量在0. 1488 1.488 μ g，與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Y = 7^603Χ+3142，γ =0. 99996 (見表2、圖9)。采用加樣回收實驗，結果表明鹽酸麻黃堿9次測定的平均回收率為100. 14%，RSD為1.99% (見表3)；苦杏仁苷9次測定的平均回收率為97. 88%，RSD 為1. 64% (見表4)。精密度(見表5)、穩(wěn)定性(見表6)、重復性(見表7)、專屬性(見圖 10、11、12、13)與柱耐用性(見表8、圖14、15、16)實驗均符合方法學要求。適用于止咳片中鹽酸麻黃堿和苦杏仁苷的同時定量測定。本發(fā)明解決其技術問題所采用的方案為(1)快速薄層鑒別方法①取止咳片，研細，稱取2g，加甲醇細1，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取前胡、黃芩和麻黃對照藥材各0. 1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取供試品溶液8 10μ 1，對照藥材溶液各5 6μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為20 4 0.5的氯仿-甲醇-濃氨為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與前胡對照藥材色譜相應的位置上，至少顯三個相同的熒光斑點(見圖1)；置紫外光燈254nm下檢視，在與黃芩對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點(見圖幻；噴以2%的茚三酮無水乙醇溶液，100°C 烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與麻黃對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點(見圖3)。經空白對照，空白樣品(不含前胡或黃芩或麻黃的樣品)不干擾測定，鑒別專屬。②取枇杷葉對照藥材0. 1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為7. 5 2.5 0.15的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑， 展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點(見圖4)。經空白對照，空白樣品(不含枇杷葉的樣品)不干擾測定，鑒別專屬。③取金銀花對照藥材0. 1 0. 2g，加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6 μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為15 5 5的乙酸丁酯-甲酸-水的上層溶液為展開劑， 展開，取出，晾干，100°C烘烤約5分鐘，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(見圖5)。經空白對照，空白樣品(不含金銀花的樣品)不干擾測定，鑒別專屬。④取苦杏仁對照藥材0. 2 0. 5g，加甲醇2 細1，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 8 μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為15 2 0.1的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開， 取出，晾干，噴以2%磷鉬酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，至少顯2個相同顏色斑點(見圖6)。經空白對照，空白樣品(不含苦杏仁的樣品)不干擾測定，鑒別專屬。⑤取止咳片，除去包衣，研細，稱取3g，加熱水25ml，超聲使溶解，棉花濾過，濾液加鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，加乙酸乙酯20 25ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為供試品溶液；另取桔梗對照藥材0. 5 0. 8g，加熱水20ml、鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，棉花濾過，濾液加乙酸乙酯15 20ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為對照藥材溶液；吸取供試品溶液5 8μ 1，對照藥材溶液8 10 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為4 :1:4: 1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積比為1 6的5%香草醛硫酸溶液乙醇的混合溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色主斑點(見圖7)。經空白對照，空白樣品(不含桔梗的樣品)不干擾測定，鑒別專屬。麻黃與苦杏仁含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為 4.5 9 86. 5的乙腈-甲醇-0.1%磷酸為流動相；檢測波長207nm;理論板數按苦杏仁苷峰計算不低于1500。對照品溶液的制備取鹽酸麻黃堿和苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成儲備液，在取儲備液適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸麻黃堿12 μ g、苦杏仁苷35 μ g的混合溶液，作為對照品溶液。再取鹽酸偽麻黃堿適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸偽麻黃堿5 μ g的溶液，作為定位溶液。供試品溶液的制備取止咳片20片，除去包衣，精密稱定，研細，取0. 3 0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇15 25ml，密塞，稱定重量，以功率250w、頻率 40kHz，超聲處理15分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)溶液anl，置裝有100-120目中性氧化鋁1 1. 5g的內徑Icm的色譜柱上，用70 80% 甲醇洗脫至IOml的量瓶中至約9ml，加1滴磷酸，用70 80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0. 45 μ m的微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。測定法分別精密吸取對照品溶液與定位溶液各8 10μ 1、供試品溶液10 15 μ 1，注入液相色譜儀，以鹽酸偽麻黃堿確認保留時間與鹽酸麻黃堿一致，以鹽酸麻黃堿
計算含量。本品每片含麻黃以鹽酸麻黃堿計，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總量不得低于 0. 7mg，含苦杏仁以苦杏仁苷計不得低于2. 7mg。
本發(fā)明的原理如下1.根據中藥各有效成分的化學結構和極性不同，隨著展開劑的移動，在薄層板上的吸附、解吸附的能力而不一樣，使各有效成分的斑點得以分離。又借助各成分極性大小， 選取極性近似的有效成分，在不同的檢視條件下，呈現不同的斑點顏色，在同一塊薄層板上可同時互不干擾地檢測數種有效成分，同一供試品溶液，供多項鑒別應用。2.通過調整流動相的組分、比例以及檢測波長，使性質不同的有效成分能在同一流動相中，同一檢測波長下，都能呈現一定的波峰面積，而且其波峰面積與含量呈良好線性關系，而得以定量測定。本發(fā)明的創(chuàng)新點及有益效果如下(1)突破了一個樣品溶液，一塊薄層板，展開一次，檢測一種中藥的傳統(tǒng)鑒別方式， 創(chuàng)新了采用同一供試品溶液與甲醇超聲的各對照藥材上清液，在4塊薄層板上，完成6味中藥的快速薄層鑒別檢測。6項鑒別只需樣品2g，甲醇23ml，展開劑40ml，時間2小時，其簡便性、快捷性，是目前傳統(tǒng)鑒別方法都不具備的。(2)在同一塊薄層板上，三種不同的檢視條件下，同時檢出前胡、黃芩和麻黃的薄層鑒別、苦杏仁磷鉬酸乙醇溶液顯色的低毒性顯色技術以及桔梗脂溶性水解提取液中偏水溶性成分的專屬鑒別方法為首次報道，拓寬了鑒別思路，具創(chuàng)新性與實用性。(3)本處方由十味中藥組成，成分復雜，既有酸性的綠原酸、苦杏仁苷、黃芩苷類， 又有堿性的麻黃堿類，而且黃芩苷類在反相色譜柱上，具有很強的保留性質。通過調酸堿性的萃取方式，無法使酸性的苦杏仁苷與堿性的麻黃堿共存，亦無法同時測定，而且導致前處理繁瑣、費時。本發(fā)明正是針對該問題，利用生物堿和苦杏仁苷都能溶于含水甲醇的特性， 用含水甲醇提取，再通過氧化鋁小柱，巧妙地使強酸性的綠原酸和黃芩苷類被吸附，而弱酸性的苦杏仁苷和堿性麻黃堿類不被吸附的酸堿度之差，排除了綠原酸和黃芩苷類的干擾， 得到近于無色的供試品溶液，保證了測定圖譜基線平穩(wěn)、待測定波峰重現性良好。配以優(yōu)選的流動相組分與比例，使麻黃堿和苦杏仁苷在20分鐘內同時測定完畢，麻黃堿保留時間約 6分鐘，苦杏仁苷的保留時間約12分鐘，波峰分離良好。(4)中國藥典2010年版一部收載的麻黃有三個品種，即木賊麻黃、草麻黃和中麻黃。文獻報道其麻黃堿含量差異較大，在木賊麻黃和草麻黃中以麻黃堿為主，偽麻黃堿含量較少；中麻黃中偽麻黃堿含量較高，麻黃堿含量較少。因此目前在國家各類中藥質量標準中，都是以麻黃堿和偽麻黃堿分別測定的含量相加控制產品質量。鑒于鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿二者為同分異構體，其光譜圖和單位濃度的波峰面積都相同，又都是止咳有效成分，所以調整為保留時間相同的同一波峰，以鹽酸麻黃堿計二者的總量，解決了以普通的等度洗脫，同一流動相無法同時測定苦杏仁苷的難題，方法簡便、快捷、準確，成本低，效率高。(5)本發(fā)明與傳統(tǒng)的質量檢測方法相比，提高檢測效率3 4倍，節(jié)省檢測時間 80 %，降低檢測成本80 %，減少環(huán)境污染90 %，為一部具有推廣應用前景的示范性檢測方法。


圖1為前胡的薄層鑒別。圖2為黃芩的薄層鑒別。
圖3為麻黃的薄層鑒別。圖4為枇杷葉薄層鑒別。圖5為金銀花薄層鑒別。圖6為苦杏仁薄層鑒別。圖7為桔梗薄層鑒別。圖8鹽酸麻黃堿對照品線性關系9苦杏仁苷對照品線性關系10鹽酸麻黃堿和苦杏仁苷對照品HPLC色譜11止咳片樣品的HPLC色譜圖。圖12缺苦杏仁的空白樣品HPLC色譜13缺麻黃的空白樣品HPLC色譜14 Grace Smart色譜柱(5 μ m,4. 6 X 250mm)止咳片樣品的HPLC色譜圖。圖15迪馬dimonsil色譜柱(5 μ m，4. 6X 150mm)止咳片樣品的HPLC色譜圖。圖16日本島津SP-ODS色譜柱(5 μ m，4. 6 X 150謹)止咳片樣品的HPLC色譜圖。圖1，圖2和圖3為同一塊薄層板，圖1是在紫外燈365nm下檢視前胡的熒光斑點， 圖2是在紫外燈254nm下檢視黃芩的斑點，圖3是顯色后在日光下檢視麻黃的斑點，圖1、圖 2和圖3的樣品標號一樣，1為黃芩對照藥材，2為黃芩空白，3、4、5為樣品，6為前胡對照藥材，7為麻黃對照藥材，8為前胡空白，9為麻黃空白。圖4中，1空白，2為枇杷葉對照藥材，3、4、5為樣品。圖5中，1為金銀花對照藥材，2、3、4為樣品，5為空白。圖6中，1、2、3為樣品，4為苦杏仁對照藥材，5為空白。圖7中，1為空白，2為桔梗對照藥材，3、4、5為樣品。圖8、圖9中，橫坐標為進樣量μ g，縱坐標為峰面積。圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15、圖16中，1為鹽酸麻黃堿，2為苦杏仁苷。 本發(fā)明具體實施方式
如下①取止咳片，研細，稱取2g，加甲醇細1，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取前胡、黃芩和麻黃對照藥材各0. 1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取供試品溶液8 10 μ 1，對照藥材溶液各5 6 μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為20 4 0.5的氯仿-甲醇-濃氨為展開劑， 展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與前胡對照藥材色譜相應的位置上，至少顯三個相同的熒光斑點；置紫外光燈254nm下檢視，在與黃芩對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點；噴以2%的茚三酮無水乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與麻黃對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點。②取枇杷葉對照藥材0. 1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為7. 5 2.5 0.15的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開齊IJ， 展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點。③取金銀花對照藥材0. 1 0. 2g，加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6 μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為15 5 5的乙酸丁酯-甲酸-水的上層溶液為展開劑， 展開，取出，晾干，100°C烘烤約5分鐘，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。④取苦杏仁對照藥材0. 2 0. 5g，加甲醇2 細1，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液。吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 8 μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為15 2 0.1的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開， 取出，晾干，噴以2%磷鉬酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，至少顯2個相同顏色斑點。⑤取止咳片，除去包衣，研細，稱取3g，加熱水25ml，超聲使溶解，棉花濾過，濾液加鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，加乙酸乙酯20 25ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為供試品溶液；另取桔梗對照藥材0. 5 0. 8g，加熱水20ml、鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，棉花濾過，濾液加乙酸乙酯15 20ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為對照藥材溶液；吸取供試品溶液5 8μ 1，對照藥材溶液8 10 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為4 :1:4: 1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積比為1 6的5%香草醛硫酸溶液乙醇的混合溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色主斑點。麻黃與苦杏仁含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為 4.5 9 86.5的乙腈-甲醇-0. 磷酸為流動相；檢測波長207nm ；理論板數按苦杏仁苷峰計算不低于1500。對照品溶液的制備取鹽酸麻黃堿和苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成儲備液，在取儲備液適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸麻黃堿12 μ g、苦杏仁苷35 μ g的混合溶液，作為對照品溶液。再取鹽酸偽麻黃堿適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸偽麻黃堿5 μ g的溶液，作為定位溶液。供試品溶液的制備取止咳片20片，除去包衣，精密稱定，研細，取0. 3 0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇15 25ml，密塞，稱定重量，以功率250w、頻率 40kHz，超聲處理15分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)溶液anl，置裝有100-120目中性氧化鋁1 1. 5g的內徑Icm的色譜柱上，用70 80% 甲醇洗脫至IOml的量瓶中至約9ml，加1滴磷酸，用70 80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0. 45 μ m的微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。測定法分別精密吸取對照品溶液與定位溶液各8 10μ 1、供試品溶液10 15 μ 1，注入液相色譜儀，以鹽酸偽麻黃堿確認保留時間與鹽酸麻黃堿一致，以鹽酸麻黃堿
計算含量。本品每片含麻黃以鹽酸麻黃堿計，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總量不得低于 0. 7mg，含苦杏仁以苦杏仁苷計不得低于2. 7mg。制劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷的含量測定結果(見表9)。表1鹽酸麻黃堿進樣量與峰面積
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法，其特征在于(1)快速薄層鑒別方法①取止咳片，除去包衣，研細，稱取2g，加甲醇細1，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取前胡、黃芩和麻黃對照藥材各0. 1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10 分鐘，上清液作為對照藥材溶液；吸取供試品溶液8 10μ 1，對照藥材溶液各5 6μ 1，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比為20 4 0.5的氯仿-甲醇-濃氨為展開劑， 展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與前胡對照藥材色譜相應的位置上，至少顯三個相同的熒光斑點；置紫外光燈254nm下檢視，在與黃芩對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點；噴以2%的茚三酮無水乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與麻黃對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點；②取枇杷葉對照藥材0.1 0. 3g，分別加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液；吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為7. 5 2.5 0.15的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點；③取金銀花對照藥材0.1 0. 2g，加甲醇1 :3ml，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液；吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 6μ 1，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以體積比為15 5 5的乙酸丁酯-甲酸-水的上層溶液為展開劑，展開， 取出，晾干，100°C烘烤約5分鐘，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點；④取苦杏仁對照藥材0.2 0. 5g，加甲醇2 細1，超聲處理10分鐘，上清液作為對照藥材溶液；吸取鑒別①項下的供試品溶液和對照藥材溶液各5 8μ 1，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以體積比為15 2 0.1的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%磷鉬酸乙醇溶液，100°C烘烤至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，至少顯2個相同顏色斑點；⑤取止咳片，除去包衣，研細，稱取3g，加熱水25ml，超聲使溶解，棉花濾過，濾液加鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，加乙酸乙酯20 25ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為供試品溶液；另取桔梗對照藥材0. 5 0. Sg,加熱水20ml、鹽酸anl，沸水浴中加熱30分鐘，冷卻，棉花濾過，濾液加乙酸乙酯15 20ml，萃取，乙酸乙酯層蒸干，殘留物加甲醇1ml，使溶解，作為對照藥材溶液；吸取供試品溶液5 8μ 1，對照藥材溶液8 10 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為4 :1:4: 1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積比為1 6的5%香草醛硫酸溶液乙醇的混合溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色主斑點；(2).三成分同時定量測定方法A.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為 4.5 9 86.5的乙腈-甲醇-0. 磷酸為流動相；檢測波長207nm;理論板數按苦杏仁苷峰計算不低于1500 ；B.對照品溶液制備取鹽酸麻黃堿和苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成儲備液，在取儲備液適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸麻黃堿12 μ g、苦杏仁苷35 μ g的混合溶液，作為對照品溶液；再取鹽酸偽麻黃堿適量，加70%甲醇制成每Iml含鹽酸偽麻黃堿 5yg的溶液，作為定位溶液；C.供試品溶液制備取止咳片20片，除去包衣，精密稱定，研細，取0.3 0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇15 25ml，密塞，稱定重量，以功率250w、頻率 40kHz，超聲處理15分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)溶液anl，置裝有100-120目中性氧化鋁1 1. 5g的內徑Icm的色譜柱上，用70 80% 甲醇洗脫至IOml的量瓶中至約9ml，加1滴磷酸，用70 80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0. 45 μ m的微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；D.測定法分別精密吸取對照品溶液與定位溶液各8 10μ 1、供試品溶液10 15 μ 1， 注入液相色譜儀，以鹽酸偽麻黃堿確認保留時間，以鹽酸麻黃堿計算含量；本品每片含麻黃以鹽酸麻黃堿計，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總量，不得低于0. 7mg, 含苦杏仁以苦杏仁苷計不得低于2. 7mg。
2.根據權利要求1所述的一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法，其特征在于所述的鹽酸偽麻黃堿定位溶液，系用于確定鹽酸偽麻黃堿應與鹽酸麻黃堿具相同的保留時間，為同一波峰。
3.根據權利要求1所述的一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法，其特征在于所述的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，二者為同分異構體，其光譜圖與單位濃度的峰面積都相同，又都是止咳有效成分，所以調整為保留時間相同的同一波峰，以鹽酸麻黃堿計二者的總量，簡便、快捷，可與苦杏仁苷以等度洗脫的方式，用同一流動相同時測定。
4.根據權利要求1所述的一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法，其特征在于中性氧化鋁柱的作用是去除干擾成分綠原酸和黃芩苷類，得到近于無色的供試品溶液，保證測定圖譜基線平穩(wěn)、待測定波峰重現性良好。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種止咳片的快速薄層鑒別與三成分同時定量測定方法。其特征在于用薄層色譜法在5塊薄層板上對制劑中的前胡、黃芩、麻黃、枇杷葉、金銀花、苦杏仁和桔梗進行了鑒別。方法簡便、快捷，前6項鑒別只需樣品2g，甲醇23ml，展開劑40ml，時間2小時。用HPLC法，對制劑中的鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷進行了同時定量測定，快捷的前處理技術，有效排除了干擾，使三成分的同時定量測定基線平穩(wěn)，待測定波峰重現性良好?？焖俦予b別和三成分的同時定量測定構成了一部高水準的藥品質量標準，不但可多指標控制藥品質量，與常規(guī)方法相比，提高檢測效率3倍，節(jié)省時間3/4，降低成本80％，減少環(huán)境污染90％。
文檔編號G01N30/90GK102297926SQ20111019295
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權日2011年7月12日
發(fā)明者劉金伶, 安麗娜, 申玉龍, 韓桂茹 申請人:劉金伶