專利名稱：小鼠Myogenin基因超表達載體的構建方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種小鼠Myogenin (mMyoG)基因超表達載體的構建方法及用途，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術領域的應用技術。
背景技術：
作為肌肉的基本組成單位，肌纖維的類型直接決定肉的品質，但是在成年動物中， 不通過肌纖維的新生即可改變原有肌纖維的特性。所以，成年動物肌纖維基因型轉化的機制與肌肉分化、生長過程中的機制必定有所不同。肌細胞生成素MyoG是MRFs家族中最重要的成員之一，是一個肌性的bHLH結構的轉錄因子，在肌肉早期的生長分化過程中發(fā)揮著重要作用，在成年動物體內(nèi)也有表達，但其作用尚不為人知。利用pTARGET 哺乳動物表達系統(tǒng)構建小鼠MyoG真核表達質粒，對開展MyoG在成年動物肌纖維轉化中的作用及對動物肉品質調(diào)節(jié)功能研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種小鼠MyoG表達載體的構建方法，以及該表達載體的用途。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種小鼠MyoG表達載體的構建方法，包括以下步驟1、小鼠MyoG表達載體的構建方法，其特征是包括以下步驟1)、根據(jù)載體的信息和靶序列設計并合成2對MyoG mRNA全長引物；2)、表達載體的構建引物退火后與pTARGET 載體連接轉化，得到小鼠MyoG表達載體的重組質粒。作為本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體的構建方法的改進步驟1)為根據(jù)Gene Bank上已知的MyoG基因的mRNA序列(即靶序列)及 pTARGET 哺乳動物表達載體的要求，設計2對引物，分別為引物I: 上游引物5 ‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II上游引物5‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5'-TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3‘。作為本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體的構建方法的進一步改進步驟2)為將引物退火延伸后得到的PCR產(chǎn)物割膠回收，與表達載體pTARGET 相連，采用熱激轉化大腸桿菌 JM109。作為本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體的構建方法的進一步改進對步驟2)所得的重組表達質粒進行鑒定通過抗生素篩選，將陽性克隆采用PCR和測序鑒定，測序引物為T7引物。鑒定目的是確定是否將靶序列正確地連接到載體上面，因為在連接的過程中會出現(xiàn)載體的自連以及連接方向錯誤等現(xiàn)象。本發(fā)明還同時提供了利用上述方法構建而得的小鼠MyoG表達載體的用途用于研究MyoG基因對肉質的調(diào)控作用。作為本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體的用途的改進，其包括以下步驟(1)將含MyoG表達載體的大腸桿菌擴培后，提取高純無內(nèi)毒素轉染級質粒；( 將含MyoG表達載體的高純無內(nèi)毒素轉染級質粒轉染小鼠C2C12成肌細胞等細胞，37°C，5%的(X)2中保溫4 他后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；(3)轉染4 后，分析mMyoG表達載體對mMyoG、肌纖維分型的影響，研究MyoG的功能。本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體的構建方法及其用途，具有以下有益效果本發(fā)明根據(jù)pTARGET 哺乳動物表達載體和NCBI上提供的基因信息，設計兩對引物，通過RT-PCR得到mMyoG mRNA全長序列，然后連接到pTARGET 哺乳動物表達載體上，熱激轉化至大腸桿菌JM109，構建得到mMyoG重組表達質粒。本發(fā)明所用的表達載體pTARGET 方便易得，載體構建方法簡單、可行，同時構建的表達質粒能高效地表達目的基因，是研究 mMyoG功能的一種較好的研究技術，對開展MyoG在成年動物肌纖維轉化中的作用及對動物肉品質調(diào)節(jié)功能研究具有重要意義。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是RT-PCR擴增MyoG編碼區(qū)全長電泳檢測圖；圖中M-—DNA marker, 1-—引物1的擴增產(chǎn)物，2-—引物2的擴增產(chǎn)物；圖2是陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳檢測圖； 圖中M-—DNA marker ； 1，2-—陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳結果；圖3是陽性克隆測序圖譜；圖4是重組表達質粒對mMyoG mRNA表達的影響圖；(圖中不同大寫字母表示P< 0. 01)；圖5是重組表達質粒對目的蛋白mMyoG表達影響的^festern Bloting檢測結果；圖6是重組表達質粒對四種肌球蛋白重鏈亞型基因mRNA表達的影響圖；(圖中不同小寫字母表示P< 0. 05 ；不同大寫字母表示P < 0. 01)；圖中圖6-1是重組表達質粒對MyHC-I mRNA表達的影響圖；圖6-2是重組表達質粒對MyHC-IIA mRNA表達的影響圖；圖6-3是重組表達質粒對MyHC-IIX mRNA表達的影響圖；圖6-4是重組表達質粒對MyHC-IIB mRNA表達的影響圖；(不同大寫字母表示P< 0.01)。
具體實施例方式(一)、小鼠Myogenin(MyoG)表達載體的構建與鑒定
1、根據(jù)GenBank上登錄的小鼠MyoG基因序列設計并合成PCR引物引物I:上游引物5‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘下游引物5‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II:上游引物5‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5‘ -TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3 ‘；2、基因組總RNA提取及逆轉錄=Trizol法提取小鼠的基因組總RNA，并采用 瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行檢測(驗證其在提取過程中是否被降解，沒有降解的情況 下才可以進行下一步的逆轉錄。)。然后以隨機引物為逆轉錄引物逆轉錄合成cDNA(所得 的⑶NA用于下述步驟3)。反應體系為RNA 2 u g，隨機引物1 y 1，逆轉錄酶1 P 1，buffer 4u 1, dNTP 24u 1, DEPC 水補至 20 yl 反應體積；反應條件為65°C，5min ； 25 °C, IOmin ； 42°C, Ih ；90°C, IOmin0隨機引物是人工合成的長度為6個寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物，沒 有明確的序列。3、目的基因片段的體外擴增及純化引物I的目的片段長度為70恥？，引物II的目的片段長度為684bp，均含啟動編 碼序列ATG及終止編碼序列TGA，并保證閱讀框的完整。以cDNA為模板擴增MyoG，反應體 系為cDNA 1 u 1,10XPCR buffer 5 ii 1，MgCl2 Q5mM) 3 ii 1，dNTP (IOmM) 1 ii 1，上下游引物 (IOiiM)各 liil，Taq 酶 0. 5iil，DEPC 水 37. 5 u 1 ；PCR 反應條件為(1)94°C 預變性 2min ； (2)94°C變性 30sec，63°C 45sec，共 35 個循環(huán)；⑶ 72°C 10min，4°C保存。由引物 I、II 擴增 得到的PCR產(chǎn)物分別命名為MMGl與MMG2。4、小鼠MyoG表達質粒構建將純化后的目的基因片段MMG1、MMG2與pTARGET 載體相連(重組質粒分別命名 為CMV-MMGl、CMV-MMG2)，4°C過夜，熱激轉化至感受態(tài)細胞JM109中，加入500 u 1 LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)2h，取200 ill涂于Amp/IPTG/X-Gal/LB平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜。5、重組質粒的鑒定將含步驟4構建所得的質粒的菌液經(jīng)抗性初步篩選后(初步篩選具體為Amp/ IPTG/X-Gal/LB,Amp是抗生素篩選，IPTG/X-Gal是藍白斑篩選)，挑取白色單菌落(經(jīng)Amp/ IPTG/X-Gal/LB篩選得來)接種于細1液體LB培養(yǎng)基中(含Amp 100ng/ml)，37°C振蕩培 養(yǎng)12h，進行PCR和克隆測序鑒定。菌液PCR反應體系如下表1所示表1、PCR反應體系
權利要求
1.小鼠MyoG表達載體的構建方法，其特征是包括以下步驟1)、根據(jù)載體的信息和靶序列設計并合成2對MyoGmRNA全長引物；2)、表達載體的構建引物退火后與PTARGET 載體連接轉化，得到小鼠MyoG表達載體的重組質粒。
2.根據(jù)權利要求1所述的小鼠MyoG表達載體的構建方法，其特征是所述步驟1)為根據(jù)Gene Bank上已知的MyoG基因的mRNA序列及pTARGET 哺乳動物表達載體的要求，設計2對引物，分別為引物I:上游引物5 ‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘下游引物5 ‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II 上游引物5 ‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5 ‘ -TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3 ‘。
3.根據(jù)權利要求2所述的小鼠MyoG表達載體的構建方法，其特征是所述步驟2)為 將引物退火延伸后得到的PCR產(chǎn)物割膠回收，與表達載體pTARGET 相連，采用熱激轉化大腸桿菌JM109。
4.根據(jù)權利要求3所述的小鼠MyoG表達載體的構建方法，其特征是對步驟幻所得的重組表達質粒進行鑒定通過抗生素篩選，將陽性克隆采用PCR和測序鑒定，測序引物為 T7引物。
5.利用如權利要求1 4所述方法構建而得的小鼠MyoG表達載體的用途，其特征是 用于研究MyoG基因對肉質的調(diào)控作用。
6.根據(jù)權利要求5所述的小鼠MyoG表達載體的用途，其特征是包括以下步驟(1)將含MyoG表達載體的大腸桿菌擴培后，提取高純無內(nèi)毒素轉染級質粒；(2)將含MyoG表達載體的高純無內(nèi)毒素轉染級質粒轉染小鼠C2C12成肌細胞等細胞， 37°C，5%的CO2中保溫4 他后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；(3)轉染4 后，分析mMyoG表達載體對mMyoG、肌纖維分型的影響，研究MyoG的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠MyoG表達載體的構建方法，包括以下步驟1)根據(jù)載體的信息和靶序列設計并合成2對MyoG mRNA全長引物；2)表達載體的構建引物退火后與pTARGETTM載體連接轉化，得到小鼠MyoG表達載體的重組質粒。本發(fā)明的小鼠MyoG表達載體能用于研究MyoG基因對肉質的調(diào)控作用。
文檔編號G01N33/53GK102344929SQ20111020270
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權日2011年7月20日
發(fā)明者馮杰, 朱琳娜, 汪以真, 王新霞, 郭佳, 韓菲菲 申請人:浙江大學