專利名稱：一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法。
背景技術：
眼睛時常接觸多種物質，包括化妝品、藥品、農藥和環(huán)境污染物等，這些外源物質的主觀接觸或意外暴露可能造成人群的健康風險。因此，評估和調查化妝品/化學物的潛在眼刺激性成為保障人們安全使用化妝品、日用化學品的前提。19世紀30年代，由于允許未經檢測含有對苯二胺的睫毛產品在美國市場售賣，導致消費者使用此類產品引起眼部過敏、角膜潰瘍和失明等不良反應。上述公共危害事件促使美國食品藥品和化妝品監(jiān)督管理局(FDA)在1938年采取行動，強制要求檢測眼部接觸產品的安全性。對于眼刺激物的毒理學評價，傳統(tǒng)方法采用1944年Draize提出的兔眼刺激體內實驗。一直以來，雖然兔眼實驗被認為是評估眼刺激或腐蝕性的唯一標準方法，但其科學性和合理性備受質疑。動物實驗的缺點包括方法的主觀性、動物與人體反應的差異、動物遭受極大痛苦等。隨著國際動物福利運動的興起和新技術的發(fā)展，50多年前國外最先提出了以〃減少(reduce) 〃、〃替代(r印Lace) 〃和〃優(yōu)化(refine) 〃為核心內容的“3R原則”，并在此基礎上大力開展動物實驗替代方法的研究。特別是近20年，不再以動物模式為基礎的測試系統(tǒng)已被科學家采用，并被許多國家的政府、歐洲和國際法規(guī)所接受。如歐盟化妝品指令《2003/15/EC》和法規(guī)《1223/2009/EC》對于化妝品動物實驗的禁止，歐盟新化學品法規(guī) REACH (化學品的注冊、評估、許可和限制)鼓勵動物試驗替代方法的開發(fā)和應用。美國替代方法研究評價中心(ICCVAM)提出的一系列非動物測試方法等。采用非活體動物的試驗系統(tǒng)進行眼刺激性評價是動物試驗替代技術的關鍵領域之一。因此，如何建立符合動物福利原則，科學、合理的體外試驗或體外實驗組合，識別和區(qū)分化學品、化妝品、眼部用藥品、農藥和其它眼部危害物質的刺激性及其程度，是保護消費者權益的重要技術支撐。根據(jù)體內眼損傷發(fā)生的機理，目前開發(fā)中的眼刺激替代方法可分為細胞系統(tǒng)、雞胚、人工角膜和離體器官四類，與其它三類相比，細胞系統(tǒng)標準化程度最高、成本最低而且快速。細胞系統(tǒng)代替體內動物實驗的原理是基于大多數(shù)具有眼刺激作用的物質也具有細胞毒性，因此可根據(jù)化學物質對細胞膜損傷和對細胞質內蛋白質大分子破壞的相關性建立體外方法。用于體外測試的細胞包括成纖維細胞(如小鼠3T3細胞)、血細胞和犬腎細胞(如MDCK細胞)等，與細胞系統(tǒng)和其它哺動物(大鼠、小鼠、兔)相比，來源于小型豬的紅細胞含量及血紅蛋白水平更接近于人類。目前基于標準化實驗動物小型豬紅細胞系統(tǒng)建立的體外方法還未見相關專利和文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，該方法通用、快速、簡便、成本低、對檢測儀器無特殊要求。本發(fā)明所提供的上述利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，是利用化學物引起紅細胞溶血和血紅蛋白變性的可能性及其程度，通過預測模型，評估化學物眼刺激性的方法，該方法簡與體內實驗相關性好，敏感程度高，能滿足常規(guī)毒性檢測和機制研究的需要。其中，用于定量指示紅細胞損傷的指標包括兩類，其一是紅細胞溶血(血紅蛋白從細胞內釋放出細胞外)，用于評估化學物(如表面活性劑和清潔劑)對細胞膜的損傷作用，可用分光光度計定量測定；其二是血紅蛋白變性，即氧合血紅蛋白變性，用于評估化學物(如酸、堿或有機溶劑，過氧化物)對細胞內大分子物質的烷化和變性作用，也可通過吸光度定量測定其變性程度。本發(fā)明基于兩項指標建立的預測模型不僅可以用于待測物有無刺激性的判斷，還可用于刺激程度大小的區(qū)分。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其包含以下步驟
一、小型豬血紅細胞懸浮液的制備
取小型豬靜脈血，置于抗凝管中，再加入PBS緩沖液，離心后除去上層懸浮液和白血細胞“棕黃色”層，再次加入PBS緩沖液重懸，離心，并重復上述步驟2-3次，至小型豬血紅細胞與PBS緩沖液有可見明顯的液面分界，將離心后的小型豬血紅細胞沉淀用PBS緩沖液稀釋至小型豬血紅細胞懸浮液的體積百分含量為2%，將制備好的小型豬血紅細胞懸浮液在4°C 凍存；
二、小型豬血紅細胞溶血試驗 2. 1范圍確定試驗
將受試物用PBS緩沖液制備如下濃度梯度的溶液1. 0 mg/LUO. Omg/LUOO. O mg/L、 1000.0 mg/L、10000. O mg/L和100000. 0 mg/L，取步驟(一)中制備獲得的小型豬血紅細胞懸浮液，按體積比為1 2，加入上述各濃度梯度的溶液，室溫下震蕩培養(yǎng)20-40min，離心， 用分光光度計測540nm時的溶血情況，測定結果與蒸餾水或去離子水處理的血液樣品相比較；
2. 2主溶血試驗
從范圍確定實驗的結果得到溶血效應發(fā)生的大概濃度范圍，根據(jù)上述范圍進行合理的間隔，按照幾何對數(shù)或最少設置六個濃度梯度，從而得到精確的評估50%溶血即H5tl的受試物濃度，并依次確定如下指標
2. 2. 1 50%溶血受試物濃度的確定 2. 2. 2小型豬血紅細胞100%溶血的確定 2. 2. 3小型豬血紅細胞脆性試驗 2.2.4受試物空白對照的確定 2.2.5陽性對照的確定； 2. 3溶血實驗結果分析
根據(jù)2. 2中獲得的濃度-溶血曲線，經統(tǒng)計求出使50%細胞發(fā)生損傷的受試物濃度，即 H50 值[mg/L]；
三、蛋白變性實驗
如觀察到紅細胞溶液的顏色從紅色向褐色改變表明蛋白變性的發(fā)生，蛋白變性的評估從如下兩個分析模型中選擇
83. 1蛋白變性定量模型一
實驗得到蛋白變性的2個定量指標分別為
Dlow[mg/L]使血紅蛋白變性的最低受試物濃度，即吸光度相當于蒸餾水或去離子水完全溶解紅細胞時吸光度的10% ；
Dfflax[%]:與蒸餾水或去離子水完全溶解紅細胞血紅蛋白完全變性相比，在某一濃度下使血紅蛋白發(fā)生變性的程度百分比；
根據(jù)Dlmt [mg/L]和0_[%]的值，蛋白變性實驗得到以下三種結果 3. 1. 1在最高測試濃度或低于此濃度(100，000mg/L)檢測到100%溶血或實際溶血> 95%，且一直維持到反應達到停滯期，在這種情況下，沒有預期蛋白變性作用發(fā)生，無需進一步評估，結果可記為=Dmax < 10%，且D1ot > IOOOOmg/ L ；
3. 1.2在某一濃度檢測到100%或>95%溶血發(fā)生，但在更高一級的濃度則反應減弱，并伴隨著顏色的改變，這種情況表明有溶血發(fā)生，并可能存在預期的蛋白變性，這種情況下， 應從范圍測試實驗得到的系列濃度得出準確的D1ot和Dmax值；
3. 1. 3任何范圍探測實驗中的濃度均未觀察到100%或> 95%溶血，在這種情況下，即使紅細胞未出現(xiàn)溶解，細胞內任何蛋白變性的程度都應測定，測試步驟如下
將裝有體積百分含量為2、的小型豬血紅細胞懸浮液離心后，小心移出其中的上清液， 離心回收紅細胞，按體積比為1 2，加入去離子水或蒸餾水裂解細胞，混勻后重懸細胞震蕩， 離心；
如總的血紅蛋白釋放，即移除的上清液離心后裂解釋放的血紅蛋白的吸光度值和檢測的受試物作用后釋放的血紅蛋白的吸光度值之和等于蒸餾水或去離子水引起的100%溶血，表明溶血作用在任何濃度都是穩(wěn)定的，無蛋白質變性發(fā)生； 3. 2蛋白變性的定量模型二實驗得到蛋白變性的3個定量指標分別為
R0 指空白血樣在波長為575nm下的吸光度α Q與在540nm下的吸光度β Q的比值； R1 指受試物在波長為575nm下的吸光度α :與在540nm下的吸光度β ！的比值； Rsds 指標準陽性化學物SDS在波長為575nm下的吸光度α SDS與在MOnm下的吸光度 3SDS的比值Rsds ；
從上述3個參數(shù)代入公式得出蛋白變性指數(shù)DI [%]
權利要求
1.一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是包含以下步驟一、小型豬血紅細胞懸浮液的制備取小型豬靜脈血，置于抗凝管中，再加入PBS緩沖液，離心后除去上層懸浮液和白血細胞“棕黃色”層，再次加入PBS緩沖液重懸，離心，并重復上述步驟2-3次，至小型豬血紅細胞與PBS緩沖液有可見明顯的液面分界，將離心后的小型豬血紅細胞沉淀用PBS緩沖液稀釋至小型豬血紅細胞懸浮液的體積百分含量為2%，將制備好的小型豬血紅細胞懸浮液在4°C 凍存；二、小型豬血紅細胞溶血試驗.2.1范圍確定試驗將受試物用PBS緩沖液制備如下濃度梯度的溶液1. 0 mg/LUO. Omg/LUOO. 0 mg/L、 1000.0 mg/L、10000.0 mg/L和100000. 0 mg/L，取步驟(一)中制備獲得的小型豬血紅細胞懸浮液，按體積比為1 2，加入上述各濃度梯度的溶液，室溫下震蕩培養(yǎng)20-40min，離心， 用分光光度計測540nm時的溶血情況，測定結果與蒸餾水或去離子水處理的血液樣品相比較；.2. 2主溶血試驗從范圍確定實驗的結果得到溶血效應發(fā)生的大概濃度范圍，根據(jù)上述范圍進行合理的間隔，按照幾何對數(shù)或最少設置六個濃度梯度，從而得到精確的評估50%溶血即H5tl的受試物濃度，并依次確定如下指標.2. 2. 1 50%溶血受試物濃度的確定 2. 2. 2小型豬血紅細胞100%溶血的確定 2. 2. 3小型豬血紅細胞脆性試驗 2.2.4受試物空白對照的確定 2.2.5陽性對照的確定；.2.3溶血實驗結果分析根據(jù)2. 2中獲得的濃度-溶血曲線，經統(tǒng)計求出使50%細胞發(fā)生損傷的受試物濃度，即 H50 值[mg/L]；三、蛋白變性實驗如觀察到紅細胞溶液的顏色從紅色向褐色改變表明蛋白變性的發(fā)生，蛋白變性的評估從如下兩個分析模型中選擇.3.1蛋白變性定量模型一實驗得到蛋白變性的2個定量指標分別為 Dlow[mg/L]使血紅蛋白變性的最低受試物濃度，即吸光度相當于蒸餾水或去離子水完全溶解紅細胞時吸光度的10% ；Dfflax[%]:與蒸餾水或去離子水完全溶解紅細胞血紅蛋白完全變性相比，在某一濃度下使血紅蛋白發(fā)生變性的程度百分比；根據(jù)Dlmt [mg/L]和0_[%]的值，蛋白變性實驗得到以下三種結果 3. 1. 1在最高測試濃度或低于此濃度(100，000mg/L)檢測到100%溶血或實際溶血> 95%，且一直維持到反應達到停滯期，在這種情況下，沒有預期蛋白變性作用發(fā)生，無需進一步評估，結果可記為=Dmax < 10%，且D1ot > IOOOOmg/ L ；·3. 1.2在某一濃度檢測到100%或>95%溶血發(fā)生，但在更高一級的濃度則反應減弱，并伴隨著顏色的改變，這種情況表明有溶血發(fā)生，并可能存在預期的蛋白變性，這種情況下， 應從范圍測試實驗得到的系列濃度得出準確的D1ot和Dmax值；·3. 1. 3任何范圍探測實驗中的濃度均未觀察到100%或> 95%溶血，在這種情況下，即使紅細胞未出現(xiàn)溶解，細胞內任何蛋白變性的程度都應測定，測試步驟如下將裝有體積百分含量為2、的小型豬血紅細胞懸浮液離心后，小心移出其中的上清液， 離心回收紅細胞，按體積比為1 2，加入去離子水或蒸餾水裂解細胞，混勻后重懸細胞震蕩， 離心；如總的血紅蛋白釋放，即移除的上清液離心后裂解釋放的血紅蛋白的吸光度值和檢測的受試物作用后釋放的血紅蛋白的吸光度值之和等于蒸餾水或去離子水引起的100%溶血，表明溶血作用在任何濃度都是穩(wěn)定的，無蛋白質變性發(fā)生；·3.2蛋白變性的定量模型二實驗得到蛋白變性的3個定量指標分別為R0 指空白血樣在波長為575nm下的吸光度α Q與在540nm下的吸光度β Q的比值； R1 指受試物在波長為575nm下的吸光度α :與在540nm下的吸光度β ！的比值； Rsds 指標準陽性化學物SDS在波長為575nm下的吸光度α SDS與在MOnm下的吸光度 3SDS的比值Rsds ；從上述3個參數(shù)代入公式得出蛋白變性指數(shù)DI [%]
2.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是 步驟(一)中所述的小型豬為五指山小型豬、廣西巴馬地區(qū)的巴馬小型豬、貴族香豬、滇南小耳豬或西藏林芝地區(qū)的西藏小型豬。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(一)中所述的抗凝管中含有K2-EDTA或含枸櫞酸鹽緩沖液，其中枸櫞酸鹽緩沖液中枸櫞酸鈉的濃度為66 mmol/L，檸檬酸的濃度為44 mmol/L，用超純水配制。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(一)中所述的PBS緩沖液含有以下組分以IL緩沖液計，氯化鈉8. 0g、氯化鉀0. 2g、葡萄糖1. Sg、無水磷酸氫二鈉1. 15g、無水磷酸氫鉀0. 2g、其余為去離子水，該PBS緩沖液的 pH 為 7. 2-7. 4。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(一)中小型豬靜脈血與PBS的體積比為2:5，離心時的轉速為1500rpm，離心時間為 IOmin0
6.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(一)中體積百分含量為洲的小型豬血紅細胞懸浮液采用如下方法進行校正首先取少量紅細胞懸液用蒸餾水或去離子水按體積比1 :10比例稀釋，在MOnm波長下分光光度計測定紅細胞溶液的吸光度0D，預期在Icm距離的光通路比色皿中測定的紅細胞溶液的平均OD 值應為0. 5，即期望OD值，以蒸餾水或去離子水為空白對照，然后取小型豬血細胞沉淀用部分PBS溶液稀釋，部分PBS溶液體積即PBS原始體積，充分混勻后，測定紅細胞懸液的吸光度，即獲得的0D，根據(jù)下述公式獲得期望PBS體積，在小型豬血紅細胞溶液中再補充入期望 PBS體積與PBS原始體積的差值的PBS溶液，即可獲得體積百分含量為m的小型豬血紅細胞懸浮液，為了校正使紅細胞懸液濃度準確稀釋到2、所需的PBS體積，以得到正常的所需要的OD值，通過以下公式計算
7.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(二)中所述的受試物為化學品、化妝品、農藥或眼部用藥品，所述的化學品包括表面活性劑、消毒用品或去垢劑；所述的化妝品包括洗發(fā)水、沐浴液或眼霜；所述的農藥包括殺蟲劑、殺菌劑、殺鼠劑、除草劑或植物生長調節(jié)劑；所述的眼部用藥品包括滴眼液、護理液、眼膜或眼部用凝膠。
8.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(二)的2. 2. 1中50%溶血受試物濃度的確定的具體過程為配制2. 1中所述不同濃度梯度含受試物的PBS緩沖液，每個濃度設置3個平行樣，取步驟(一)中制備獲得的小型豬血紅細胞懸浮液，按體積比為1 2，加入各濃度梯度的含受試物的PBS緩沖液，室溫下震蕩培養(yǎng)20-40min，離心，用分光光度計測MOnm時的溶血情況，根據(jù)不同濃度梯度的小型豬血紅細胞懸浮液和受試物混合溶液與溶血的關系建立濃度一溶血關系曲線，經統(tǒng)計作圖得到H5tl值，即使50%小型豬血紅細胞發(fā)生損傷的受試物濃度；步驟(二)的2. 2. 2中小型豬血紅細胞100%溶血的確定的具體過程為取小型豬靜脈血，采用蒸餾水或去離子水按步驟(一)中的方法處理后獲得小型豬血紅細胞懸浮液，按體積比為1:2，加入蒸餾水或去離子水，室溫下震蕩培養(yǎng)20-40min，離心，用分光光度計測540nm時的溶血情況，設定為 100%溶血；步驟(二)的2. 2. 3中小型豬血紅細胞脆性試驗的具體過程為將步驟(一) 中制備獲得的小型豬血紅細胞懸浮液，按體積比為1 2，加入PBS緩沖液，室溫下震蕩培養(yǎng) 20-40min,離心，用分光光度計測540nm時的溶血情況，PBS測定的小型豬血紅細胞脆性應不超過完全溶血的5%，如超過了 5%，則此批血液不能用于測試；步驟(二)的2. 2. 4中受試物空白對照設定過程為比較含質量百分含量為10%受試物的PBS溶液與PBS溶液分別用分光光度計檢測MOnm時的吸光度，兩者比較，如無明顯差異，即二者的吸光度差值不超過0. 02單位，則PBS可用于空白對照，否則則以10%受試物的PBS為空白對照，如果受試物離心后的吸光度值高于100%溶血值的20%，容易出現(xiàn)假陽性結果，應當對受試物樣品進行過濾后重新測定其OD值；步驟(二)的2. 2. 5中陽性對照為陽性對照采用十二烷基硫酸鈉，其最終實驗濃度為10-100mg/L。
9.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(二)2. 3的溶血實驗結果分析中若范圍測試實驗中最低濃度的三次平行測試都產生溶血，則H5tl等于或小于1. Omg/L ；若范圍測試實驗中最高濃度的三次平行測試中沒有發(fā)生溶血，則H5tl的值等于或大于100，000mg/L，不再進行蛋白變性的定量檢測；如果受試物的最高溶解濃度達不到100，000mg/L且沒有超過50%的溶血發(fā)生，或者化學物溶液檢測的吸光度高于100%溶血值的20%，表明該受試物不適用于本方法的測試；若濃度反應曲線呈現(xiàn)不連續(xù)的增長，在低濃度范圍內測定H5tl比在高濃度測定H5tl更有意義。
10.根據(jù)權利要求1所述的利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，其特征是步驟(四)中所述的蛋白變性的具體試驗過程是將紅細胞暴露于濃度逐漸增高的受試物中 20-40min，然后用分光光度計測定MO-Mlnm處的吸光值，最后得出紅細胞溶解后釋放的血紅蛋白變性時受試物的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用小型豬紅細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的實驗方法，該方法主要包括(一)、小型豬血紅細胞懸液的制備；(二)、小型豬血紅細胞溶血試驗；(三)、蛋白變性實驗；(四)、預測模型；(五)、分類和判斷。本發(fā)明方法所用血紅細胞來源可靠安全，測試材料容易獲得、均一性好，測試系統(tǒng)簡單、廉價，無需特殊設備，檢測方法快速、靈敏、通用。本發(fā)明方法可直接用于化學品包括表面活性劑、消毒用品、去垢劑等，化妝品包括洗發(fā)水、沐浴液、眼霜等，農藥、眼部用藥品及其它可能接觸眼睛的物質的安全評估，用于上述原料、配方或產品眼刺激性的快速篩查、分類和標識。
文檔編號G01N33/50GK102359946SQ20111020973
公開日2012年2月22日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權日2011年7月26日
發(fā)明者敖華英, 王希龍, 程樹軍, 談偉君, 黃韌 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 程樹軍