專利名稱：檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種己烯雌酚的檢測裝置和方法，具體地說是一種應(yīng)用于測定食品中人工合成雌激素己烯雌酚(Diethylstilbestrol， DES)的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法，以及利用該傳感器測定己烯雌酚的方法。
背景技術(shù)：
己烯雌酚是一種人工合成的非留體雌激素，1938年在倫敦被人工合成，它能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的藥理與治療作用，主要用于雌激素低下癥及激素平衡失調(diào)引起的功能性出血、閉經(jīng)，還可用于死胎引產(chǎn)前，以提高子宮肌層對催產(chǎn)素的敏感性。己烯雌酚還具有促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝合成、提高動物日增重和減少脂肪合成等作用，曾經(jīng)一度作為促生長劑廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。然而隨后人們逐漸發(fā)現(xiàn)添加高濃度己烯雌酚會在生物體中殘留，并且對生物體具有潛在的致畸致癌等危害，世界各國紛紛禁止在食用性動物中使用。目前用于DES殘留檢測的方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。但這些方法的技術(shù)要求高，需要大型分析儀器，操作過程繁瑣，測定樣品的成本也高，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。DES殘留檢測的方法中還包括電化學(xué)檢測方法，如CN200710040472. X公開了一種己烯雌酚的玻碳電極修飾的電化學(xué)檢測方法，包括電極的預(yù)處理；納米金溶膠液的制備； 聚乙烯亞胺一納米金修飾玻碳電極的制備先后分為聚乙烯亞胺修飾玻碳電極的制備與聚乙烯亞胺一納米金修飾電極的制備兩個(gè)步驟；用聚乙烯亞胺一納米金修飾電極測試己烯雌酚的含量。該發(fā)明的工作電極的修飾過程簡單且能重復(fù)利用，測試的重現(xiàn)性良好及靈敏度高，檢測限可達(dá)到lng/g，但是該方法的特異性不好。自上世紀(jì)80年代以來，生物傳感器的研究與開發(fā)呈現(xiàn)出突飛猛進(jìn)的局面，各類傳感器應(yīng)運(yùn)而生。其中，與測定抗原抗體反應(yīng)有關(guān)的傳感器稱為免疫傳感器?？乖贵w結(jié)合前后可導(dǎo)致多種信號的改變，如在重量、光學(xué)、熱學(xué)、電化學(xué)等方面。免疫傳感器在檢測己烯雌酚上已得到廣泛應(yīng)用，如各種基于抗體和抗原反應(yīng)的用于己烯雌酚檢測的免疫試劑(盒)。由于電化學(xué)分析具有的以下特點(diǎn)和優(yōu)勢，如可以實(shí)現(xiàn)在體檢測，不受樣品顏色、 濁度的影響(即樣品可以不經(jīng)處理，不需分離)，且所需儀器設(shè)備相對簡單，因此應(yīng)用前景看好。本發(fā)明旨在綜合利用復(fù)合納米技術(shù)、表面化學(xué)修飾技術(shù)、免疫分析技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)等，通過一種己烯雌酚檢測的直接電化學(xué)免疫傳感器的制備，建立一種高靈敏度、 特異性好、低成本、可現(xiàn)場檢測的快速檢測己烯雌酚的方法，有效地解決目前己烯雌酚檢測方法所存在的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法，所述的傳感器具有很高的靈敏度和專一性，可用于己烯雌酚檢測。
本發(fā)明的另一目的還在于提供一種快速、高靈敏度、低成本、可用于現(xiàn)場測定的食品中己烯雌酚殘留量的檢測方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采用的技術(shù)方案如下
一種檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器，包括基底電極，其特征在于所述的基底電極表面沉積納米金后，修飾石墨烯-己烯雌酚-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。 所述的基底電極優(yōu)選玻碳電極。本發(fā)明的另一目的是提供一種所述免疫傳感器的制備方法，技術(shù)方案如下
一種檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于在基底電極表面沉積納米金，將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與己烯雌酚混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和己烯雌酚包被并固定于電極表面，并將電極浸泡在牛血清蛋白 (BSA)溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。所述的基底電極優(yōu)選玻碳電極。所述的免疫傳感器的制備，更具體和更優(yōu)選的方法包括如下步驟
1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液；
準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮
液；
2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min 3)納米金沉積清洗后的玻碳電極用電化學(xué)方法沉積金納米粒子，于100mg/L的 HAuCl4溶液中，在-0. 2V電勢下恒電位掃描60s ；
4)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的己烯雌酚溶液混合，滴涂于步驟3)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；
5)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。所述的石墨烯的制備，可以氧化石墨(GO)作為前驅(qū)體，通過氧化石墨的還原和石墨烯的功能化得到性能優(yōu)異的石墨烯。上述免疫傳感器可用于測定己烯雌酚的含量。修飾電極在含有己烯雌酚抗體和游離的己烯雌酚的溶液中孵育時(shí)，溶液中游離的己烯雌酚和固定在電極表面的己烯雌酚與溶液中己烯雌酚抗體發(fā)生競爭性免疫反應(yīng)，己烯雌酚抗體與電極表面固定的己烯雌酚反應(yīng)后，抗體吸附在電極表面。游離的己烯雌酚濃度越高，固定在電極上的己烯雌酚結(jié)合的抗體越少。以K3Fe(CN)6為探針，進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，抗體在電極表面的吸附，會使 !^e (CN)63_Λ_氧化還原峰電流值降低。因此利用競爭性免疫反應(yīng)機(jī)制，不同濃度的己烯雌酚孵育后的電極，在1(3狗(0幻6溶液中差分脈沖伏安法(DPV)得到的曲線峰電流不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著己烯雌酚濃度在孵育液中的增加，DPV峰電流增大，且峰電流增大值與己烯雌酚濃度呈線性，從而實(shí)現(xiàn)對己烯雌酚的定量檢測。因此，本發(fā)明還涉及一種基于所述的免疫傳感器檢測己烯雌酚的方法，包括以下步驟
51)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的含有不同濃度游離己烯雌酚的PH為 7. 4的磷酸緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含有相同濃度的己烯雌酚抗體；
2)建立工作曲線將免疫傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，孵育后用磷酸緩沖溶液沖洗免疫傳感器，在K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ici,含有游離己烯雌酚的標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加Δ I (Δ I=Ix-I0)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中己烯雌酚濃度C成正比，繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到Δ I-C線性回歸方程；
3)己烯雌酚測定將待測樣品配制為含有與步驟1)相同濃度己烯雌酚抗體的磷酸緩沖溶液，按照與步驟2)相同的方法對免疫傳感器進(jìn)行孵育和差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；根據(jù)響應(yīng)電流的增加Δ I和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到己烯雌酚含量。所述的KJFe(CN)6]溶液的濃度優(yōu)選為2 mM。免疫反應(yīng)條件優(yōu)選在37°C下孵育60 min。所述的己烯雌酚抗體的濃度優(yōu)選10 μ L/50 μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液。所述的步驟3)優(yōu)選采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定。上述方法檢測己烯雌酚含量，檢測限可達(dá)到0. 1 ng/ml，線性范圍0.5 1500 ng/ ml ο本發(fā)明的免疫傳感器及其己烯雌酚檢測方法基于以下原理。所述的免疫傳感器系一種納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極，結(jié)合納米金比表面積大、導(dǎo)電性能和生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)，石墨烯超強(qiáng)的導(dǎo)電性能和較大的比表面積等特性，以及殼聚糖可吸附固定生物分子和對石墨烯優(yōu)異的分散效果等特性構(gòu)建而成。在電極上沉積納米金后，將石墨烯的殼聚糖溶液超聲分散，與己烯雌酚混合并滴涂在電極上，利用殼聚糖的粘性將石墨烯和己烯雌酚包被并固定于電極上，并將電極浸泡在BSA 溶液中，以封閉非特異性的活性位點(diǎn)。免疫傳感器的電極表面修飾見圖1?；诒景l(fā)明的免疫傳感器，利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，可對己烯雌酚進(jìn)行檢測，其原理如圖2。所述的免疫傳感器對溶液中己烯雌酚的檢測是基于抗體和抗原之間特定免疫反應(yīng)的競爭模式。(a)當(dāng)電極浸入含有己烯雌酚抗體和游離己烯雌酚的溶液中時(shí)，固定在電極上的己烯雌酚抗原與溶液中游離的己烯雌酚與溶液中的己烯雌酚抗體發(fā)生競爭反應(yīng)。(b) 基于己烯雌酚抗體和抗原之間特定反應(yīng)的競爭模式，當(dāng)電極浸入到含有特定抗體的溶液時(shí)，己烯雌酚抗體與抗原的特異反應(yīng)使抗體吸附在電極上。(c)抗體-抗原復(fù)合物在電極表面的形成導(dǎo)致電極產(chǎn)生位阻，減少了電極活動區(qū)域，阻礙了探針離子到達(dá)電極，峰值電流下降。因此，可以根據(jù)免疫傳感器各階段電化學(xué)信號的差異對溶液中游離的己烯雌酚進(jìn)行檢測。本發(fā)明通過納米金/石墨烯/殼聚糖復(fù)合納米材料固定己烯雌酚抗原于基底電極上，制備一種雌激素藥物己烯雌酚的非標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，利用Kfe(CN)6為探針，以循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法監(jiān)測免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對己烯雌酚進(jìn)行定性與定量檢測。本發(fā)明的傳感器具有高度的靈敏度和專一性，檢測方法簡單、高效，適用范圍廣泛，檢測限可達(dá)到 0. 1 ng/ml，線性范圍 0. 5 1500 ng/ml。總之，本發(fā)明綜合利用復(fù)合納米技術(shù)、表面化學(xué)修飾技術(shù)、免疫分析技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)等，解決了當(dāng)前己烯雌酚檢測中迫切存在的問題，具有快速現(xiàn)場檢測、靈敏度高、 成本低等特點(diǎn)。


圖1本發(fā)明的免疫傳感器電極表面修飾示意圖。圖2本發(fā)明的免疫傳感器檢測己烯雌酚的原理，(a)將修飾好的電極浸入含有游離己烯雌酚和己烯雌酚抗體的溶液中進(jìn)行孵育，(b)以[Fe (CN)6]〃4_為探針進(jìn)行電化學(xué)檢測，(c)通過監(jiān)測電信號的變化檢測己烯雌酚濃度。 圖3石墨烯的SEM電鏡照片。圖4不同修飾電極(a)裸電極，(b)石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極，(C)納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極，(d)石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極在含有己烯雌酚的抗體中孵育后，在2mM&K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的CV曲線圖，掃速為100
mv/so圖5本發(fā)明的免疫傳感器在孵育液中的孵育時(shí)間對DPV峰電流的影響。圖6孵育液中抗體含量對DPV峰電流的影響。圖7 本發(fā)明的免疫傳感器的DPV曲線圖。(a)納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極的DPV曲線圖；在含有不同濃度的己烯雌酚(b) 1500 ng/mL, (c) 1000 ng/ mL，(d)500 ng/mL, (e)25 ng/mL, (f)0. 5 ng/mL, (g)0 ng/mL 的孵育液中孵育后，在 2 mM 的K3 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的DPV曲線圖。圖8響應(yīng)電流的變化Δ I與己烯雌酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，所述的實(shí)施例有助于對本發(fā)明的理解和實(shí)施，并非構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以具體實(shí)施方式
為限，而由權(quán)利要求加以限定。以下實(shí)施例中使用上海晨華公司的電化學(xué)工作站(CHI660D)，以修飾的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極進(jìn)行電化學(xué)測量。所使用的己烯雌酚抗體是北京華安麥科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的己烯雌酚試劑盒，其效價(jià)濃度為1:20 萬。實(shí)施例1免疫傳感器制備
一種檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器，是在玻碳電極表面沉積納米金后，修飾石墨烯-己烯雌酚-殼聚糖復(fù)合物而得。其制備方法如下
1)氧化石墨的制備50 mL m H2SO4+10 g K2S208+10 gP205混合，將12 g石墨粉加入到上述混合液中，反應(yīng)6 h。加入2 L水，過夜。460冰箱冰凍處理)，將氧化的石
墨粉加入到濃中攪拌。溫度控制在10 °〇以下，緩慢加入60 g KMnO4Jg合物在35 V 反應(yīng)2 h，緩慢加入920 mL去離子水，保持50 ！以下，攪拌反應(yīng)2 h。加入2. 8 L水以及 50 mL 30 % H2O2，攪拌反應(yīng)一天。使用5 L 10%的HCl沖洗，離心。然后再用5 L水洗，至溶液呈中性。2)石墨烯的制備稱取上述氧化石墨0. 05 g，加入到100 mL pH=ll的NaOH溶液中；在150 W下超聲90 min制備氧化石墨烯分散液；在4000 rpm下離心3 min除去極少量未剝離的氧化石墨；向離心后的氧化石墨烯分散液中加入0.1 mL水合胼，在90 °C攪拌反應(yīng)2 h，得到石墨烯的分散液。如圖3所示為制得的石墨烯的掃描電鏡照片，由圖中可以看出，石墨烯呈很薄的片狀。石墨烯由一層密集的、包裹在蜂巢晶體點(diǎn)陣上的碳原子組成，是世界上最薄的二維材料，其厚度僅為0.335 nm。結(jié)構(gòu)完整的石墨烯是由不含任何不穩(wěn)定鍵的苯六元環(huán)組合而成的二維晶體，化學(xué)穩(wěn)定性高，表面呈惰性狀態(tài)，與其它介質(zhì)(如溶劑等)的相互作用較弱，并且由于石墨烯片與片之間有較強(qiáng)的范德華力的作用，使其容易產(chǎn)生聚集，難溶于水及常用的有機(jī)溶劑。由于石墨烯擁有優(yōu)異的電學(xué)性能，其重要用途之一是可以用來制備高性能的納米復(fù)合材料，但石墨烯難溶于水及常用的有機(jī)溶劑。有研究表明，石墨烯在殼聚糖中分散時(shí)， 兩者之間將發(fā)生有效的負(fù)荷轉(zhuǎn)移，兩者之間的相互作用使得石墨烯在殼聚糖中呈分子水平分散，具有很好的分散效果。3)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0. 05 M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得1 mg/mL的殼聚糖溶液，置于4 °C冰箱備用。準(zhǔn)確稱取5 mg石墨烯樣品于2 mL殼聚糖溶液中，超聲分散1 h，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液。4)電極修飾直徑為3mm的玻碳電極用分別用1. 0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲:3min。清洗后的玻碳電極先沉積金納米粒子(gold nanoparticles)，于100mg/L的HAuCl4溶液中在-0. 2V電勢下恒電位掃描60s ；再將4 μ L 石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2 mg/mL的己烯雌酚溶液(乙醇水=1:4)混合， 滴涂于表面沉積納米金的玻碳電極表面，40 °C下烘干30min。表面修飾后的電極于37 °C 下浸泡在5 %的BSA溶液中30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)。
實(shí)施例2修飾電極循環(huán)伏安掃描
對不同修飾電極進(jìn)行循環(huán)伏安研究，其結(jié)果如圖4。裸電極(曲線a)在2mM的 K3[Fe (CN) 6]溶液中的循環(huán)伏安曲線表現(xiàn)出一對明顯的狗(CN) 63-74-氧化還原峰；當(dāng)電極上修飾了石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖后(曲線b)，峰電流明顯增大，石墨烯顯示出優(yōu)異的電化學(xué)活性，增強(qiáng)了電子的傳遞；當(dāng)電極上修飾了納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖后(曲線 c)，峰電流更加增大，納米金與石墨烯復(fù)合材料具有更加優(yōu)越的電化學(xué)性能；將納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極放入含有己烯雌酚抗體的孵育液中孵育后(曲線d)，峰電流下降，這是由于己烯雌酚抗體與電極上的抗原反應(yīng)，吸附在電極上，阻礙了電子的傳遞造成的，這也說明己烯雌酚抗原已經(jīng)修飾在了電極上。
實(shí)施例3檢測條件優(yōu)化
不同檢測條件的影響，如免疫反應(yīng)的時(shí)間和抗體濃度，由DPV法進(jìn)行確定。
1、免疫反應(yīng)時(shí)間
實(shí)施例1制得的免疫傳感器使用含有相同的抗體濃度的孵育液分別孵育0，10，20，40， 60和70分鐘后，用PBS清洗，在2 mM K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，結(jié)果如圖5。納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極(免疫傳感器)的DPV峰電流隨孵育時(shí)間增加在60分鐘內(nèi)快速下降，到70分鐘時(shí)略微回升(圖5)。孵育時(shí)間再增加電流響應(yīng)不再降低。因此，選擇60分鐘作為免疫反應(yīng)的最佳孵育時(shí)間。2、孵育溶液中抗體濃度的影響
納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極，浸在50 μ L加入不同體積抗體的PBS 溶液中，在37 °C孵育60 min, PBS清洗后，在2 mM K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安 (DPV)掃描，結(jié)果如圖6。由圖6可知當(dāng)在溶液中抗體體積由0 μ L增加至5 μ L時(shí)，DPV 峰值電流顯著下降。隨著進(jìn)一步增加抗體濃度，在15-20 μ L范圍內(nèi)，電流減少很小。結(jié)果表明，孵化溶液中抗體量大于15 μ L后抗體的吸附量不再增加，表明結(jié)合位點(diǎn)基本上達(dá)到飽和。對于競爭的免疫反應(yīng)，選擇一個(gè)有足夠高的信號并小于飽和濃度的濃度。因此，選擇 10 μ L為最佳的抗體量。
實(shí)施例4建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
以Kfe(CN)6為探針，通過DPV掃描，利用抗體特異結(jié)合己烯雌酚的能力，可以實(shí)現(xiàn)對己烯雌酚的檢測。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(孵育液)，標(biāo)準(zhǔn)溶液為一組總量為50 μ L、含有濃度不一的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)液、10 μ L己烯雌酚抗體的PBS溶液(ρΗ=7. 4)。將納米金/石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極浸入孵育溶液，溶液中游離的己烯雌酚與固定在電極表面的己烯雌酚競爭與溶液中己烯雌酚抗體的反應(yīng)。經(jīng)過37°C下60 min孵育后，用PBS沖洗。沖洗后的電極為工作電極，在2 mM K3 [Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流，如圖7所示。結(jié)果表明，隨著己烯雌酚濃度在孵育液中的增加，DPV峰電流增大。定義納米金/ 石墨烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極在只含10 μ L抗體的PBS緩沖溶液(空白)中孵育后的響應(yīng)電流為Itl，在含有游離己烯雌酚的孵育液孵育后的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加 Δ I ( Δ I=Ix-I0)與己烯雌酚濃度在0. 5到1500ng/mL范圍內(nèi)成正比。繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。線性回歸方程為 Y=O. 78035+0. 00785Χ。以大于噪音信號3倍的電流信號對應(yīng)的濃度為最低檢出限，重復(fù)5次以上實(shí)驗(yàn)得出，上述方法的最低檢測限為0. 1 ng/mL。
實(shí)施例5豬肉中己烯雌酚檢測
根據(jù)實(shí)施例4所建立的己烯雌酚檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用本發(fā)明的方法測定豬肉樣品中己烯雌酚含量，定量方法為標(biāo)準(zhǔn)加入法。1)豬肉樣品前處理
稱取1 士0.0050 g豬肉于到10 mL的樣品管中，加入己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)液，和3 mL乙腈-丙酮提取液(V :V，4:1)，混合物超聲振蕩30 min，于2000 r/m下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘?jiān)? mL的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50 ！溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1 mL的pH為7. 4磷酸緩沖溶液，溶解后用于電化學(xué)分析。2)按照步驟1)的方法配制不加入己烯雌酚的空白樣品，和3個(gè)含有不同己烯雌酚濃度的加標(biāo)樣品(標(biāo)準(zhǔn)加入法)，并按照與實(shí)施例4相同的方法對修飾電極進(jìn)行孵育及檢測， 根據(jù)工作曲線得到樣品中己烯雌酚的實(shí)際濃度，所得數(shù)據(jù)結(jié)果及回收率見表1。表 權(quán)利要求
1.一種檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器，包括基底電極，其特征在于所述的基底電極表面沉積納米金后，修飾石墨烯-己烯雌酚-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述的基底電極為玻碳電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述免疫傳感器通過下述方法制得在基底電極表面沉積納米金，將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與己烯雌酚混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和己烯雌酚包被并固定于電極表面，并將電極浸泡在牛血清蛋白溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述免疫傳感器通過下述步驟制得1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液； 準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液；2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min ；3)納米金沉積清洗后的玻碳電極用電化學(xué)方法沉積金納米粒子，于100mg/L的 HAuCl4溶液中，在-0. 2V電勢下恒電位掃描60s ；4)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的己烯雌酚溶液混合，滴涂于步驟3)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；5)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。
5.一種檢測己烯雌酚的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于在基底電極表面沉積納米金，將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與己烯雌酚混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和己烯雌酚包被并固定于電極表面；將電極浸泡在牛血清蛋白溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液； 準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液；2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min ；3)納米金沉積清洗后的玻碳電極用電化學(xué)方法沉積金納米粒子，于100mg/L的 HAuCl4溶液中，在-0. 2V電勢下恒電位掃描60s ；4)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的己烯雌酚溶液混合，滴涂于步驟3)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；5)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。
7.一種基于權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器檢測己烯雌酚的方法，包括以下步驟1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的含有不同濃度游離己烯雌酚的PH為 7. 4的磷酸緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含有相同濃度的己烯雌酚抗體；2)建立工作曲線將免疫傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，孵育后用磷酸緩沖溶液沖洗免疫傳感器，在K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ici,含有游離己烯雌酚的標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加Δ I (Δ I=Ix-I0)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中己烯雌酚濃度C成正比，繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到Δ I-C線性回歸方程；3)己烯雌酚測定將待測樣品配制為含有與步驟1)相同濃度己烯雌酚抗體的磷酸緩沖溶液，按照與步驟2)相同的方法對免疫傳感器進(jìn)行孵育和差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；根據(jù)響應(yīng)電流的增加Δ I和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到己烯雌酚含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測己烯雌酚的方法，其特征在于，所述&K3[Fe(CN)6]溶液的濃度為2 mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測己烯雌酚的方法，其特征在于，免疫反應(yīng)條件為37°C下孵育60 min。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測己烯雌酚的方法，其特征在于，所述的步驟3)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定。
全文摘要
一種檢測己烯雌酚的非標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。所述的免疫傳感器，包括基底電極，在基底電極表面沉積納米金后，修飾石墨烯-己烯雌酚-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。其制備方法是在基底電極表面沉積納米金后，利用殼聚糖將石墨烯和己烯雌酚包被并固定于電極表面。所述的免疫傳感器基于免疫反應(yīng)的競爭模式，利用K3Fe(CN)6為探針，以差分脈沖伏安法監(jiān)測免疫反應(yīng)，可用于己烯雌酚檢測。本發(fā)明的傳感器具有高靈敏度和專一性，檢測方法簡單，適用范圍廣泛，檢測限可達(dá)到0.1ng/ml，線性范圍0.5~1500ng/ml，具有快速現(xiàn)場檢測、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號G01N27/30GK102262125SQ20111021284
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者張芹, 王傳現(xiàn), 趙波, 邵科峰, 陳園園, 陳昌云, 顏妍 申請人:南京師范大學(xué)