專(zhuān)利名稱(chēng)：敵百蟲(chóng)仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種敵百蟲(chóng)仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種敵百蟲(chóng)的快速靈敏檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
敵百蟲(chóng)(trichlorphOn，0，0-二甲基_(2，2，2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯)是一種有機(jī)磷光譜殺蟲(chóng)劑，1952年由德國(guó)拜耳公司合成并開(kāi)始生產(chǎn)。它具有高效、低毒、低殘留、 水溶性好等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林、園藝、畜牧、衛(wèi)生等方面。也正因?yàn)槠鋺?yīng)用廣泛， 濫用現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，敵百蟲(chóng)對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的損害以及致癌性和致突變性也越來(lái)越引起人們的重視。GB 16319-1996規(guī)定食品中敵百蟲(chóng)最大殘留量不得高于0. 1 mg Kg—1。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品中敵百蟲(chóng)檢測(cè)方法大都采用分光光度法、液相色譜法或液相、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進(jìn)行定性、定量的檢測(cè)，但上述幾種檢測(cè)方法所使用的設(shè)備價(jià)格昂貴且在敵百蟲(chóng)含量較低(痕量)時(shí)很難檢出，通常需要復(fù)雜樣品前處理技術(shù)。而酶聯(lián)免疫法雖然具有高靈敏度和低檢出限，但是其存在生物抗體制備周期長(zhǎng)，保存不當(dāng)易失活等問(wèn)題。分子印跡聚合物作為仿生抗體，不但對(duì)敵百蟲(chóng)具有高選擇性，而且印跡聚合物制備周期短，不存在失活問(wèn)題，因此作為人工抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析，建立仿生免疫吸附檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品及食品中的敵百蟲(chóng)，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的敵百蟲(chóng)檢測(cè)方法存在的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器價(jià)格昂貴、準(zhǔn)確度差、前處理煩瑣等缺陷，提供一種敵百蟲(chóng)的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種敵百蟲(chóng)仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，是按以下步驟完成的
1)將敵百蟲(chóng)(溶于乙腈和水)、功能單體(甲基丙烯酸，MAA)和交聯(lián)劑(二甲基丙烯酸乙二醇酯，EGDMA)按照1:2:2的摩爾比例和一定量偶氮二異丁腈(AIBN)充分混勻，然后96孔酶標(biāo)板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反應(yīng)18h ；用1:9 (ν/ν)冰乙酸-甲醇溶液連續(xù)洗脫他以除去敵百蟲(chóng)，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印跡聚合物膜；
2)以分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將96孔酶標(biāo)板第1行酶標(biāo)孔設(shè)為空白組，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加雙蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶標(biāo)孔設(shè)為對(duì)照組，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗原稀釋液；第3-8行酶標(biāo)孔依次加入100 μ L標(biāo)樣梯度稀釋液(5倍稀釋)，然后立即加入100 μ Ll 3000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗原稀釋液；
3)將上述96孔酶標(biāo)板室溫孵育1h后用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加雙蒸水定容至1L。)洗板五次。再在每孔中加入150 μ L底物液 (底物A :8. 2 g無(wú)水醋酸鈉，2. 5 g β-環(huán)糊精，150 mg過(guò)氧化氫脲，加雙蒸水至1000 mL, 調(diào)pH至5.0，4°C保存；底物B :50 mg 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺溶于5 mL 二甲基亞砜，室溫避光保存。使用前15分鐘，14. 6 mL底物A和0. 45 mL底物B混合成底物液)，室溫下反應(yīng)
330 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol Γ1硫酸，終止反應(yīng)；
4)在雙波長(zhǎng)方式(450-650 nm)下用酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板第1_8行吸光度值A(chǔ) ； 按照下列公式計(jì)算不同濃度敵百蟲(chóng)對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值
權(quán)利要求
1. 一種敵百蟲(chóng)仿生免疫吸附檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟1)將敵百蟲(chóng)溶于乙腈和水后與功能單體甲基丙烯酸MAA和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯EGDMA按照1:2:2的摩爾比例和偶氮二異丁腈AIBN充分混勻，然后96孔酶標(biāo)板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反應(yīng)18h ；用v/vl :9冰乙酸-甲醇溶液連續(xù)洗脫他以除去敵百蟲(chóng)，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印跡聚合物膜；2)以分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將96孔酶標(biāo)板第1行酶標(biāo)孔設(shè)為空白組，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 :68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加雙蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶標(biāo)孔設(shè)為對(duì)照組，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗原稀釋液；第3-8行酶標(biāo)孔依次加入100 μ L標(biāo)樣梯度稀釋液，所述的標(biāo)樣梯度稀釋液濃度分別為50000，10000，2000, 400，80和16 Pg L-1，用PBS稀釋?zhuān)缓罅⒓醇尤?100 μ Ll 3000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗原稀釋液；3)將上述96孔酶標(biāo)板室溫孵育1h后用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加雙蒸水定容至IL ；)洗板五次；再在每孔中加入150 μ L底物液， 室溫下反應(yīng)30 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol L—1硫酸，終止反應(yīng)；所述的底物液由底物A和底物B組成；所述的底物A為8. 2 g無(wú)水醋酸鈉，2. 5 g β -環(huán)糊精，150 mg過(guò)氧化氫脲，加雙蒸水至1000 mL,調(diào)pH至5. 0，4°C保存；所述的底物B為50 mg 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺溶于5 mL 二甲基亞砜，室溫避光保存；使用前15分鐘，14. 6 mL底物A和0.45 mL 底物B混合成所述的底物液；4)在雙波長(zhǎng)方式450-650nm下用酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板第1_8行吸光度值A(chǔ) ；按照下列公式計(jì)算不同濃度敵百蟲(chóng)對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值
全文摘要
本發(fā)明涉及一種敵百蟲(chóng)仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，是以敵百蟲(chóng)分子印跡聚合物膜作為人工抗體代替生物抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理，建立對(duì)敵百蟲(chóng)具有高靈敏度的仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法。該方法的最低檢出限為7μgL-1，大大低于最高殘留限量值，且大大縮短了分析時(shí)間(比傳統(tǒng)生物免疫分析縮短1.0h)，適用于快速檢測(cè)敵百蟲(chóng)。本發(fā)明制備的仿生抗體可以重復(fù)使用50次以上，成本大大降低；并且前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，適用于各種食品中敵百蟲(chóng)的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102288749SQ201110213929
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者喬旭光, 孟玲, 徐志祥 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)