專利名稱：用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測(cè)方法(涉及一種應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)雙氰胺含量的方法)，特別是涉及一種用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法(高效液相色譜檢測(cè)法)。
背景技術(shù)：
雙氰胺(DCD)，也稱為二氰二胺，為白色結(jié)晶粉末，因具有抑制土壤硝化細(xì)菌活性， 延緩?fù)寥乐袖@態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的硝化抑制特性，常被用作化肥硝化抑制劑用于生產(chǎn)長(zhǎng)效新型肥料、穩(wěn)定性肥料、肥料增效劑等產(chǎn)品。也可與多種氮肥一起施用，包括尿素、銨鹽、 氮肥水溶液、動(dòng)物廄肥等。國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道表明，尿素和硝酸銨分別配施雙氰胺，能顯著降低土壤硝態(tài)氮含量，并顯著提高土壤銨態(tài)氮含量，可分別使空心菜菜體硝酸鹽降低 63. 6 %和2. 0 %，硝化細(xì)菌數(shù)量分別減少31 %和25 %。秋天將雙氰胺加入牛糞肥中，可抑制肥料的硝化反應(yīng)，減少冬天硝態(tài)氮的淋失。雙氰胺和氮肥配施于柑橘果園，經(jīng)過(guò)三次灌溉以后，配施雙氰胺的土壤僅有20%的氮肥被淋溶。雙氰胺和尿素一起施用于大麥地，21天后 N2O的釋放量降低了 71% 82%。氫醌和雙氰胺組合處理可減少稻田CH4排放總量的1/2。 雙氰胺在施肥條件下3年CO2釋放平均減少了 %。因此，雙氰胺在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，可減緩氮素轉(zhuǎn)化，提高作物氮素利用率；可降低土壤硝態(tài)氮淋失，減少農(nóng)田面源污染；可減少蔬菜硝酸鹽吸收，提高蔬菜食用安全性；可減少農(nóng)田N20、CH4、(X)2排放，符合低碳農(nóng)業(yè)發(fā)展需求。 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，雙氰胺常被用作氮肥伴侶施用于農(nóng)田，在肥料生產(chǎn)上，雙氰胺是當(dāng)前和今后新型肥料開(kāi)發(fā)不可缺少的一種肥料添加劑。應(yīng)用雙氰胺開(kāi)發(fā)的系列產(chǎn)品已受到世界各國(guó)的關(guān)注，尤其是在中國(guó)、美國(guó)和歐洲的市場(chǎng)上。雖然目前國(guó)內(nèi)外將雙氰胺作為硝化抑制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已相當(dāng)廣泛，是一種已被公認(rèn)價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的硝化抑制劑，大多的研究結(jié)果也都支持適量的雙氰胺對(duì)環(huán)境和作物無(wú)毒害作用的結(jié)論，但也有研究表明，雙氰胺易隨水淋失，施用不當(dāng)或過(guò)量時(shí)，容易對(duì)作物造成毒害甚至在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，而對(duì)長(zhǎng)期施用雙氰胺對(duì)農(nóng)田環(huán)境安全的影響目前尚不清楚。 過(guò)量雙氰胺導(dǎo)致的農(nóng)殘為人體食用，以及雙氰胺淋失進(jìn)入水體為人體吸入是否會(huì)影響人類健康目前尚無(wú)確切報(bào)道。雙氰胺微毒或基本無(wú)毒，急性毒性很小。在藥品生產(chǎn)上，雙氰胺作為藥物加工中間體，是國(guó)內(nèi)外藥物成品中必要的檢測(cè)項(xiàng)。雙氰胺作為單氰胺的二聚體，其對(duì)小鼠毒害癥狀與單氰胺三聚體三聚氰胺類似，13000mg/kg劑量的雙氰胺和三聚氰胺給藥后的小鼠出現(xiàn)一致毒害癥狀，均出現(xiàn)不安，跳躍，呼吸急促，隨后在幾十分鐘內(nèi)便死亡。農(nóng)田雙氰胺長(zhǎng)期或過(guò)量施用，使得雙氰胺是否會(huì)像三聚氰胺成為一種潛在的危險(xiǎn)試劑目前不得而知。因此，雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上出現(xiàn)的高量雙氰胺引起的淋失和農(nóng)殘，以及長(zhǎng)期施用雙氰胺或含雙氰胺的肥料受到雙氰胺的污染現(xiàn)象。盡管如此，鑒于雙氰胺具有與三聚氰胺相似的小鼠毒害癥狀，作為藥物的必要檢測(cè)項(xiàng)，以及當(dāng)前雙氰胺在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用情況及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)看，科研人員和生產(chǎn)應(yīng)用者很有必要對(duì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的雙氰胺進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以了解實(shí)際用量，防患于未然。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)土壤和水體中雙氰胺的環(huán)境影響評(píng)價(jià)報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)雙氰胺的測(cè)定，都集中在對(duì)藥物如鹽酸二甲雙胍片、鹽酸苯乙雙胍等中雜質(zhì)雙氰胺的檢測(cè)，其中雙氰胺主要是作為藥物加工中間體使用。這些方法的不足之處在于，色譜柱價(jià)格較高、壽命短，色譜分離時(shí)雙氰胺峰值保留時(shí)間較短，難于與溶劑峰基線分離，專屬性不夠強(qiáng)，色譜條件重現(xiàn)性欠佳等等。此外，更為關(guān)鍵的是應(yīng)用其中某些方法的色譜條件來(lái)檢測(cè)土壤中的雙氰胺含量，未能很好的將雙氰胺色譜峰與其它雜峰分開(kāi)?？傊?，我國(guó)目前針對(duì)長(zhǎng)期施用雙氰胺后在農(nóng)田和水體中降解的監(jiān)測(cè)尚缺乏，因此，很有必要結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況，探索一種適合于土壤和水體中雙氰胺的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，使得成為一種檢測(cè)限低、檢測(cè)靈敏度高、回收率高和快速的高效液相色譜檢測(cè)法。本發(fā)明的創(chuàng)新思路是采用高效液相色譜法對(duì)土壤和水體中雙氰胺含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，都需要摸索和尋找合適的色譜條件，包括色譜柱、流動(dòng)相、流速、進(jìn)樣體積、柱溫、柱壓、 檢測(cè)波長(zhǎng)等。此外，還需要確定一套與提取方法相匹配的檢測(cè)方法，這些都直接關(guān)系到提取和檢測(cè)方法的回收率、準(zhǔn)確性和靈敏度。所以，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明需要探索建立一種適用于土壤和水體中雙氰胺的提取條件和新的色譜條件。鑒于以上創(chuàng)新思路，本發(fā)明所提供的一種用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法， 其特征在于該測(cè)定方法包括如下步驟①.備好雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的土壤樣品和/或水體樣品，對(duì)于定量的土壤樣品是加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾后得到樣品濾液，加水定容，對(duì)于定量的水體樣品則是直接過(guò)濾加水定容；②.樣品測(cè)定將樣品濾液和備好的雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入高效液相色譜中，按照色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；③.結(jié)果計(jì)算通過(guò)雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對(duì)應(yīng)吸收峰面積的線性關(guān)系曲線，查得樣品濾液中雙
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氰胺的濃度，按照# = ~JLJ~ (為固體樣品時(shí))或W =—-"一 (為液體樣品時(shí))公式計(jì)
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算樣品中雙氰胺的含量。式中W-試樣中雙氰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg(固體樣品)，mg/L (液體樣品)；C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的樣液中雙氰胺的濃度，ug/mL ；V, V1-樣液最終定容體積，mL ；ts_分取倍數(shù)；m-試樣質(zhì)量(土壤為烘干土樣質(zhì)量，所含水體不計(jì)質(zhì)量)，g ；V2-試樣體積，mL。上述土壤樣品處理為準(zhǔn)確稱取10. 000-20. OOOg的土壤樣品，加入40mL的超純水， 超聲提取30min，提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL。上述水體樣品處理為準(zhǔn)確吸取20—40mL的水體樣品，在4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL。上述雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液制備為準(zhǔn)確稱取0. OOlg雙氰胺分析純?cè)噭?，用超純水定容?00ml，得Cfe= 100ug/mL，置于4°C冰箱中保存。上述使用儀器為Waters Alliance沈95 二極管陣列檢測(cè)器，色譜條件為色譜柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為四丁基硫酸氫銨((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，動(dòng)流相A與流動(dòng)相B的體積比(流動(dòng)相A 流動(dòng)相B)為5 95，流速為0. 7000mL/min,進(jìn)樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為 14Mpa,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。上述高效液相色譜法在2. 60-3. 30min有一專一的色譜峰，該峰與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的色譜峰一致，為雙氰胺的特征吸收峰。由于目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定雙氰胺主要是針對(duì)藥品中雜質(zhì)雙氰胺的測(cè)定，若應(yīng)用已有技術(shù)的樣品制備、色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定土壤和水體中雙氰胺含量， 其它物質(zhì)可能與雙氰胺色譜峰有重疊，不能準(zhǔn)確檢測(cè)雙氰胺含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明適用于土壤和水體中雙氰胺含量的測(cè)定，且不受其它雜峰的干擾，該方法快速(方法簡(jiǎn)單、易行)、靈敏度高(檢測(cè)的精度高)、檢測(cè)限低、回收率高。使用本發(fā)明的高效液相色譜法測(cè)定土壤和水體中雙氰胺含量，提取過(guò)濾后的固體樣品檢測(cè)限為0. lmg/kg，液體樣品檢出限為0. Oaiig/L，回收率為 93. 13% 99. 42%。
四

圖1為雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；圖2為施用配方肥的土壤樣品色譜圖；圖3為配方肥配施雙氰胺的土壤樣品色譜圖；圖4為含雙氰胺的水體樣品色譜圖。
具體實(shí)施例方式利用高效液相色譜法對(duì)土壤和水體中雙氰胺的含量進(jìn)行檢測(cè)1、儀器設(shè)備Waters Alliance洸95高效液相色譜儀，配有Waters四96 二極管陣列檢測(cè)器。2、選用試劑乙腈(色譜純)；四丁基硫酸氫銨Qmmol/L)準(zhǔn)確稱取0. 679g四丁基硫酸氫銨分析純?cè)噭?，用超純水定容?000ml ；磷酸二氫鈉05mmol/L)準(zhǔn)確稱取3. OOOg磷酸二氫鈉分析純?cè)噭贸兯ㄈ葜?1000ml ；雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取0. OOlg雙氰胺分析純?cè)噭贸兯ㄈ葜?00ml，得C 標(biāo)=100ug/mL，置于4°C冰箱保存。3、操作步驟①.樣品處理準(zhǔn)確稱取10. 000-20. OOOg的土壤樣品，加入一定量的超純水，超聲提取30min，提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL，供高效液相色譜測(cè)定。水體樣品直接吸取20-40mL，在4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL。②.樣品測(cè)定將雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品濾液注入高效液相色譜中，按照色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積。色譜條件為色譜柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為四丁基硫酸氫銨((C4H9) 4NHS04) 和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，動(dòng)流相A與流動(dòng)相B的體積比(流動(dòng)相A 流動(dòng)相B)為 5 95，流速為0. 7000mL/min,進(jìn)樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為14Mpa，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 220nm。③.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制用流動(dòng)相將雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到濃度為1、10、25、 50、75、100ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。雙氰胺濃度在1 lOOug/mL范圍內(nèi)，濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積值呈良好線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)為0. 999。所得線性方程為:y = 134445x-102557(x為濃度，ug/mL ；y為峰面積，
UV * S)4、結(jié)果計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于該測(cè)定方法包括如下步驟①.備好雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的土壤樣品和/或水體樣品，對(duì)于定量的土壤樣品是加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾后得到樣品濾液，加水定容，對(duì)于定量的水體樣品則是直接過(guò)濾加水定容；②.樣品測(cè)定將樣品濾液和備好的雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入高效液相色譜中，按照色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；③.結(jié)果計(jì)算通過(guò)雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對(duì)應(yīng)吸收峰面積的線性關(guān)系曲線，查得樣品濾液中雙氰胺的濃度，按照W = C(為固體樣品時(shí))或W=‘(為液體樣品時(shí))公式計(jì)算樣品中雙氰胺的含量； 式中W-試樣中雙氰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg(固體樣品)，mg/L (液體樣品)； C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的樣液中雙氰胺的濃度，ug/mL ； V, V1-樣液最終定容體積，mL ； ts-分取倍數(shù)；m-試樣質(zhì)量(土壤為烘干土樣質(zhì)量，所含水體不計(jì)質(zhì)量)，g ； V2-試樣體積，mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于所述土壤樣品處理為準(zhǔn)確稱取10. 000-20. OOOg的土壤樣品，加入40mL的超純水，超聲提取30min， 提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于所述水體樣品處理為準(zhǔn)確吸取20-40mL的水體樣品，在4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后定容至50mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于所述雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液制備為準(zhǔn)確稱取0. OOlg雙氰胺分析純?cè)噭?，用超純水定容?00ml，得Cfe = 100ug/mL,于4°C冰箱中保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于上述使用儀器為Waters Alliance沈95 二極管陣列檢測(cè)器，色譜條件為色譜柱采用 Waters XTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為四丁基硫酸氫銨 ((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，動(dòng)流相A與流動(dòng)相B的體積比(流動(dòng)相A 流動(dòng)相B)為5 95，流速為0. 7000mL/min，進(jìn)樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為14Mpa， 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于所述高效液相色譜法在2. 60-3. 30min有一專一的色譜峰，該峰與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的色譜峰一致，為雙氰胺的特征吸收峰。
全文摘要
一種用于土壤和水體中雙氰胺的測(cè)定方法，其特征在于該測(cè)定方法包括如下步驟備好雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的土壤樣品和/或水體樣品，對(duì)于定量的土壤樣品是加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾后得到樣品濾液，加水定容，對(duì)于定量的水體樣品則是直接過(guò)濾加水定容；樣品測(cè)定將樣品濾液和備好的雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入高效液相色譜中，按照色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；結(jié)果計(jì)算通過(guò)雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對(duì)應(yīng)吸收峰面積的線性關(guān)系曲線，查得樣品濾液中雙氰胺的濃度，按照(為固體樣品時(shí))或(為液體樣品時(shí))公式計(jì)算樣品中雙氰胺的含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是方法先進(jìn)快速、易行；檢測(cè)限低(固體樣品檢測(cè)限為0.1mg/kg，液體樣品檢出限為0.02mg/L)；回收率高(93.13％～99.42％)。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102323347SQ201110220090
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者倪沁顏, 廖要要, 張潘丹, 張青, 江枝和, 王煌平, 程廣強(qiáng), 羅濤, 翁伯琦 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所