專利名稱：一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖品種對病原體的免疫響應(yīng)，具體涉及一種能識別草魚血清中抗體IgM的單鏈抗體。
背景技術(shù)：
草魚是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖品種之一，檢測病原體的感染和通過疫苗免疫途徑防治病原體的感染，是草魚高產(chǎn)的重要保障。IgM存在于大多數(shù)真骨魚類血清中，也存在于草魚中，是個體發(fā)育過程中最早出現(xiàn)的抗體，也是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體。病原體的感染與IgM表達水平具有明顯的響應(yīng)關(guān)系，因此檢測草魚血清中IgM的水平， 可以提示草魚新近是否發(fā)生感染?？贵w是研究蛋白表達水平與誘導(dǎo)信號相互關(guān)系的有力工具，可應(yīng)用于研究草魚對病原體的免疫應(yīng)答、疫苗效價測定。噬菌體抗體展示技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種基因工程抗體表達和篩選的新技術(shù)，它是將抗體片段基因通過與噬菌體的外殼蛋白基因融合，而將抗體表達于噬菌體顆粒的表面。由于表達的抗體具有生物活性并可與其相應(yīng)的抗原相識別，因此可根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性進行篩選、富集克隆帶有目的抗體的噬菌體。該技術(shù)將噬菌體表面表達的抗體的基因型與表現(xiàn)型聯(lián)系在一起，把抗原抗體結(jié)合的特異性同噬菌體的可擴增性聯(lián)系起來，成為一種高效的篩選體系。由于該技術(shù)的宿主細胞是大腸桿菌，因此大大優(yōu)于依賴于動物的多克隆抗體和依賴于雜交瘤細胞的單克隆抗體的制備過程，使得特異性抗體的篩選和生產(chǎn)更加簡便高效，并能大量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3，該單鏈抗體C1B3通過噬菌體展示技術(shù)制備。本發(fā)明的優(yōu)點在于，提供一種檢測草魚免疫反應(yīng)的工具，減少了檢測的成本，可以針對病原體的感染，檢測草魚血清中的IgM的水平。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 編碼單鏈抗體C1B3基因的DNA序列如下
GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCC CTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAA AGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCA TCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTAT TACTGTGCAAGAGAGACGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTGTCGACAGGTGGAGG CGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGA CTCCAGGAGAAACAGTCAGTCTTTCCTGTAGGGCCAGCCAGAGTATTTACAAGAACCTACACTGGTATCAACAGAAA TCACATCGGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCTGATTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAG TGGATCAGGGACAGATTACACTCTCAGTATCAACAGTGTGAAGCCCGAAGATGAGGGAATATATTACTGTCTTCAAG GTTACAGCACACCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG
3TATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATT TACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAG
單鏈抗體C1B3的預(yù)測氨基酸序列為
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFII SRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARETGYYFDYWGQGTTLTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPATLSVTP GETVSLSCRASQSIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYASDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLSINSVKPEDEGIYYCLQGY STPYTFGGGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA.
一種識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3的制備方法
(1)從健康小鼠的骨髓干細胞、外周血淋巴細胞和脾臟細胞中提取mRNA；
(2)將得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用對應(yīng)于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物，通過PCR技術(shù)將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增；
(3)用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接；組成單鏈抗體基因，然后與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體Pcantab 5E連接，電轉(zhuǎn)移至大腸桿菌E. coli NM522中，獲得鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA文庫；
(4)進行10次電轉(zhuǎn)移，合并10次電轉(zhuǎn)移得到的cDNA文庫，該cDNA文庫的效價為 1. 2 X IO9 ；
(5)從草魚血清中提取IgM，用硫酸銨鹽析法和ftOteinA柱層析的方法純化IgM，并將草魚IgM吸附在塑料管壁上；
(6)用吸附在塑料壁上的草魚IgM對步驟(4)中得到的效價為1.2X109的鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA抗體文庫進行三輪淘選，得到cDNA抗體文庫的菌液；
(7)將菌液涂抹在氨芐抗性的平板上，37°C培養(yǎng)至長出單菌落；
(8)選取單菌落，用ELISA方法鑒定可特異識別草魚IgM的單鏈抗體陽性克隆株，陽性克隆中OD45tlnm值最高的命名為C1B3菌株；
(8)對C1B3菌株進行DNA測序；
(9)用C1B3菌株誘導(dǎo)表達可溶性單鏈抗體，該單鏈抗體即為本發(fā)明的一種識別草魚 IgM的單鏈抗體C1B3。本發(fā)明的優(yōu)點和效果
通過噬菌體展示技術(shù)得到的單鏈抗體C1B3，可以特異性識別草魚IgM。相對于多克隆抗體和雜交瘤制備的單克隆抗體，本發(fā)明的抗體制備過程更為簡單，并可以通過細菌的發(fā)酵大量生產(chǎn)，減少人力物力消耗。利用本發(fā)明單鏈抗體C1B3為識別工具，以草魚呼腸孤病毒(GCRV)為病原體為例，感染草魚，成功檢測到病毒感染后草魚IgM誘導(dǎo)表達水平的變化。 其應(yīng)用前景為用草魚的抗血清為一抗，以本發(fā)明的單鏈抗體為二抗，可用于其他各種病原體誘導(dǎo)草魚IgM水平變化的檢測，因此可以將其開發(fā)為一種魚病的免疫學(xué)檢測試劑盒，用于草魚對病原體免疫響應(yīng)的檢測，以及人工疫苗效價的鑒定。目前未見通過IgM水平的變化來檢測草魚對病原體免疫反應(yīng)的方法，而針對草魚人工疫苗的效價鑒定目前只能依賴于哺乳動物的免疫反應(yīng)檢測，不能精確的反應(yīng)草魚自身的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的單鏈抗體C1B3的主要優(yōu)點在于提供了一種檢測草魚免疫反應(yīng)的工具，減少了檢測的成本，可以針對病原體的感染，檢測草魚血清中的IgM的水平。


圖1為ELISA對單鏈抗體C1B3與草魚IgM特異性結(jié)合的分析圖。圖2為ELISA對感染草魚出血病毒后血清中IgM水平變化的分析圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。 一種識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3的制備方法
(1)從健康小鼠的骨髓干細胞、外周血淋巴細胞和脾臟細胞中提取HiRNA；
(2)將得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用對應(yīng)于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物，通過PCR技術(shù)將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增；
(3)用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接；組成單鏈抗體基因，然后與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體Pcantab 5E連接，電轉(zhuǎn)移至大腸桿菌E. coli NM522中，獲得鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA文庫；
(4)進行10次電轉(zhuǎn)移，合并10次電轉(zhuǎn)移得到的cDNA文庫，該cDNA文庫的效價為 1. 2 X IO9 ；
(5)從草魚血清中提取IgM，用硫酸銨鹽析法和ftOteinA柱層析的方法純化IgM，并將草魚IgM吸附在塑料管壁上；
(6)用吸附在塑料壁上的草魚IgM對步驟(4)中得到的效價為1.2X109的鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA抗體文庫進行三輪淘選，得到cDNA抗體文庫的菌液；
(7)將菌液涂抹在氨芐抗性的平板上，37°C培養(yǎng)至長出單菌落；
(8)選取單菌落，用ELISA方法鑒定可特異識別草魚IgM的單鏈抗體陽性克隆株，陽性克隆中OD45tlnm值最高的命名為C1B3菌株；
(8)對C1B3菌株進行DNA測序；
(9)用C1B3菌株誘導(dǎo)表達可溶性單鏈抗體，該單鏈抗體即為本發(fā)明的一種識別草魚 IgM的單鏈抗體C1B3。用一種識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3檢測草魚IgM的濃度 一、單鏈抗體C1B3特異性識別草魚IgM
la.將草魚IgM和BSA (牛血清白蛋白)分別梯度稀釋包被96孔板，4°C過夜； lb.倒掉包被的IgM溶液和BSA溶液，以4%PBSM (每100毫升PBS加入4克脫脂奶粉溶)37°C封閉1小時；
Ic.用PBS洗1次，再加入可溶性單鏈抗體C1B3，于37 °C保溫1小時； Id.用PBST (0. 1毫升吐溫20加入100毫升PBS溶液中)洗3次，再用PBS洗3次， 每孔再加入 100 微升 HRP/Anti E-Tag conjugate (HRP/Anti E-Tag con jugate 用 PBSM 稀釋，體積比為 1 :10000,HRP/Anti E-Tag conjugate 產(chǎn)品來源于 Amersham Biosciences 公司)，37 °C保溫1小時；
Ie. 用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔再加入100 微升TMB (3，3，5，5，-tetramethylbenzidine, Serva 公司)底物溶液，顯色 15 分鐘，每孔加入 25 微升2摩爾/升中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀分別測定每孔的OD45tlnm值。若檢測所得的OD45tlnm值隨IgM濃度的增加而增加，且BSA測定的結(jié)果不隨包被濃度的增加而增加，說明單鏈抗體C1B3能夠特異性的識別草魚IgM，可以用于對草魚IgM含量的檢測。如圖1所示，單鏈抗體CIB3與實驗組草魚IgM的結(jié)合隨著草魚IgM量的增加而增加，而對照組BSA與單鏈抗體C1B3的結(jié)合不隨濃度的增加而增加，說明本發(fā)明的單鏈抗體 CIB3與草魚IgM是特異性結(jié)合的，可以用于檢測草魚IgM的含量。二、用單鏈抗體C1B3檢測草魚出血病病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)
2a.在實驗組草魚的腹腔注射草魚出血病病毒，在對照組草魚的腹腔注射生理鹽水，每隔M小時對抽實驗組草魚和對照組草魚各取一次血樣，共抽取6次； 2b.用實驗組和對照組的草魚血清包被96孔板，4°C過夜； 2c.倒掉包被溶液，以4%PBSM 37°C封閉1小時； 2d.用PBS洗1次，加入可溶性單鏈抗體C1B3，于37 °C保溫1小時； 2e. 用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔再加入100微升HRP/Anti E-Tag conjugate, 37 °C保溫 1 小時；
2f.用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔加入TMB底物溶液，顯色15分鐘，每孔加入 2摩爾/升H2SO4中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值。當(dāng)檢測所得的OD45tlnm值顯著增加時，說明感染了草魚出血病病毒的草魚出現(xiàn)了免疫反應(yīng)，IgM水平升高；當(dāng)草魚未感染草魚出血病病毒，或者草魚感染的草魚出血病病毒還沒有擴增到較高的含量時，沒有引發(fā)草魚的免疫反應(yīng)時，IgM含量沒有變化，檢測所得的 OD45tlnm值沒有顯著變化。如圖2所示，腹腔注射草魚出血病病毒的實驗組草魚，從第五天開始，血清中IgM 的含量顯著性增加，而對照組草魚血清中IgM的含量一直無顯著性差異，說明實驗組草魚在感染了草魚出血病病毒后第4天開始引發(fā)免疫反應(yīng)，IgM水平開始上升，在第5天具有明顯的變化，而對照組草魚IgM的水平一直沒有顯著地變化。該實驗證明了單鏈抗體CIB3能夠用于草魚出血病病毒感染后引發(fā)的免疫反應(yīng)的檢測。
權(quán)利要求
1.一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3，其特征在于，編碼單鏈抗體C1B3基因的DNA 序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCC CTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAA AGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCA TCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTAT TACTGTGCAAGAGAGACGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTGTCGACAGGTGGAGG CGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGA CTCCAGGAGAAACAGTCAGTCTTTCCTGTAGGGCCAGCCAGAGTATTTACAAGAACCTACACTGGTATCAACAGAAA TCACATCGGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCTGATTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAG TGGATCAGGGACAGATTACACTCTCAGTATCAACAGTGTGAAGCCCGAAGATGAGGGAATATATTACTGTCTTCAAG GTTACAGCACACCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG TATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATT TACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAG單鏈抗體C1B3的預(yù)測氨基酸序列為MAEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFII SRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARETGYYFDYWGQGTTLTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPATLSVTP GETVSLSCRASQSIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYASDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLSINSVKPEDEGIYYCLQGY STPYTFGGGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA。
2.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3的制備方法，其特征在于，該制備方法包含如下步驟(1)從健康小鼠的骨髓干細胞、外周血淋巴細胞和脾臟細胞中提取mRNA；(2)將得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用對應(yīng)于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物，通過PCR技術(shù)將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增；(3)用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接；組成單鏈抗體基因，然后與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體Pcantab 5E連接，電轉(zhuǎn)移至大腸桿菌E. coli NM522中，獲得鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA文庫；(4)進行10次電轉(zhuǎn)移，合并10次電轉(zhuǎn)移得到的cDNA文庫，該cDNA文庫的效價為 1. 2 X IO9 ；(5)從草魚血清中提取IgM，用硫酸銨鹽析法和ftOteinA柱層析的方法純化IgM，并將草魚IgM吸附在塑料管壁上；(6)用吸附在塑料壁上的草魚IgM對步驟(4)中得到的效價為1.2X109的鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA抗體文庫進行三輪淘選，得到cDNA抗體文庫的菌液；(7)將菌液涂抹在氨芐抗性的平板上，37°C培養(yǎng)至長出單菌落；(8)選取單菌落，用ELISA方法鑒定可特異識別草魚IgM的單鏈抗體陽性克隆株，陽性克隆中OD45tlnm值最高的命名為C1B3菌株；(8)對C1B3菌株進行DNA測序；(9)用C1B3菌株誘導(dǎo)表達可溶性單鏈抗體，該單鏈抗體即為本發(fā)明的一種識別草魚 IgM的單鏈抗體C1B3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3，并給出了編碼單鏈抗體C1B3基因的DNA序列及其蛋白質(zhì)氨基酸預(yù)測序列，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖品種對病原體的免疫響應(yīng)。該單鏈抗體C1B3通過噬菌體展示技術(shù)制備。本發(fā)明的優(yōu)點是，提供一種檢測草魚免疫反應(yīng)的工具，減少了檢測的成本，可以針對病原體的感染，檢測草魚血清中的IgM的水平。附圖為ELISA對單鏈抗體C1B3與草魚IgM特異性結(jié)合的分析圖。
文檔編號G01N33/569GK102268091SQ20111022349
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者廖蘭杰, 張曉華, 戴和平, 汪亞平, 羅紹祥, 陳叢林 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所