專利名稱：一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。
背景技術(shù)：
遺傳疾病長(zhǎng)期以來一直在困擾著人類，遺傳性視網(wǎng)膜退化是一個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞迅速大量死亡的過程，迅速地導(dǎo)致失明。在世界范圍已經(jīng)開展和正在進(jìn)行著大量的研究工作，但是對(duì)于這種疾病的分子生物學(xué)機(jī)制、尤其有關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞迅速死亡的進(jìn)程了解并不深刻；為了更深入地了解并進(jìn)而防治這些疾病，大量先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)正被用于臨床前瞻性地診斷和治療。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I在細(xì)胞增殖、凋亡過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，其水平的變化直接而準(zhǔn)確地反映了細(xì)胞異常死亡或無序增殖的過程。據(jù)研究表明，異 常高水平的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I已在多種遺傳病變組織中、多種腫瘤組織和細(xì)胞株中檢測(cè)到；在國(guó)外諸多以阻斷轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I作用為目標(biāo)的藥物正處于研發(fā)中。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I將在遺傳病和其他疾病、例如腫瘤等的研究中得到進(jìn)一步的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，首先從視網(wǎng)膜組織中分離細(xì)胞核蛋白樣品，用放射性同位素32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段，并與核蛋白提取物反應(yīng)，然后通過電泳遷移率漂移試驗(yàn)檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白/DNA復(fù)合物，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行定量分析，最后將轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白/DNA復(fù)合物定量分析結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)到的細(xì)胞死亡過程相對(duì)照，從而確定視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程。該方法具體包含如下步驟I)從視網(wǎng)膜組織中分離具有細(xì)胞核蛋白；2)放射性同位素32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段，標(biāo)記后的寡核苷酸片段與核蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；3)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離結(jié)合反應(yīng)物；4)抽干凝膠并曝光感光屏或X光膠片；5)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白與32P標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段結(jié)合后，其復(fù)合物帶有放射性，能曝光感光屏或X膠片而顯現(xiàn)出清晰的條帶，測(cè)定條帶的位置和相對(duì)密度，即可獲得有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I水平的數(shù)據(jù)；6)將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I水平提升的速率和樣式與免疫組織化學(xué)手段所顯示的細(xì)胞死亡進(jìn)程作比對(duì)，從而確定視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程。步驟I)所述的從視網(wǎng)膜組織中分離具有細(xì)胞核蛋白的方法為在勻漿緩沖系統(tǒng)中將組織勻漿，低速離心，取出沉淀物，充分懸浮于洗滌緩沖液中，再次離心，取出沉淀物，沉淀物充分懸浮于提取緩沖液中，充分提?。桓咚匐x心提取物，取上清液。其中，所述的勻漿緩沖系統(tǒng)配方為蔗糖O. 25M，pH7. 5-8. O的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸15mM，氯化鉀60mM，氯化鈉15mM，pH 8. O的乙二胺四乙酸5mM，pH 8. O的乙二醇二乙醚二胺四乙酸ImM,精胺O. 15mM,精脒O. 15mM, 二硫蘇糖醇ImM,苯甲基磺酰氟O. 5mM蛋白酶抑制劑，25微升/毫升；所述的洗滌緩沖液配方為pH 7.3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂I. 5mM,氯化鉀10mM，二硫蘇糖醇ImM，蛋白酶抑制劑25微升/毫升；所述的提取緩沖液配方為pH 7. 3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂O. 75mM,氯化鉀O. 5mM, 二硫蘇糖醇ImM，·磷酸鈉O. ImM，甘油12. 5%，蛋白酶抑制劑25微升/毫升。步驟2)的具體方法是用含有放射性同位素32P的單核苷酸標(biāo)記特定的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段SEQ ID No. 1，獲得帶有放射線標(biāo)記的片段；混合標(biāo)記片段、核蛋白樣品和結(jié)合緩沖液，在室溫下反應(yīng)。步驟3)所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)選采用中性的非變性凝膠電泳系統(tǒng)。所述的感光屏優(yōu)選采用對(duì)放射性敏感的特殊感光屏。步驟5)測(cè)定條帶的位置和相對(duì)密度優(yōu)選采用應(yīng)用美國(guó)GE公司ImageQuantworkstation。有益效果本發(fā)明建立在首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I (Activator Protein-1, AP-1)在遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中的異?；罨c視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的相關(guān)性的基礎(chǔ)上。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為闡明遺傳性視網(wǎng)膜退化的分子生物學(xué)機(jī)制提供了極其重要的信息。通過本發(fā)明方法判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程，特別是遺傳性視網(wǎng)膜退化中視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程，為臨床診斷遺傳性視網(wǎng)膜退化提供參考數(shù)據(jù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品用量小、結(jié)果明確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。


圖I檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子AP-I水平的EMSA結(jié)果，顯示在遺傳病病變組織(視網(wǎng)膜)細(xì)胞死亡過程中不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄因子AP-I的水平。A采自正常動(dòng)物的對(duì)照樣品(受保護(hù)的右眼)；B采自正常動(dòng)物的試驗(yàn)樣品(受光照的左眼)；C光照后I小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；D光照后I小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼；E光照后4小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；F光照后4小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼；G光照后24小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；
H光照后24小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼。光照后I小時(shí)從單個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物米集A、B樣品，光照后4小時(shí)米集C、D樣品，24小時(shí)后采集E、F。結(jié)果顯示，光照I小時(shí)后轉(zhuǎn)錄因子AP-I水平在A和B中無明顯差別，細(xì)胞死亡過程尚未開始。樣品D中AP-I水平較樣品C增高數(shù)倍，此時(shí)細(xì)胞以最高速率大量死亡。AP-I在樣品E、F中又回復(fù)至相同水平，因?yàn)榧?xì)胞死亡的過程已經(jīng)結(jié)束。圖2顯示數(shù)字化的轉(zhuǎn)錄因子AP-I水平的差異，白色區(qū)域標(biāo)記對(duì)照組織樣品中轉(zhuǎn)錄因子AP-I水平，黑色為試驗(yàn)樣品中轉(zhuǎn)錄因子AP-I水平。這是對(duì)圖I的結(jié)果的數(shù)字化的描述。A采自正常動(dòng)物的對(duì)照樣品(受保護(hù)的右眼);B采自正常動(dòng)物的試驗(yàn)樣品(受光照的左眼)； C光照后I小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；D光照后I小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼；E光照后4小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；F光照后4小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼；G光照后24小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受保護(hù)的右眼；H光照后24小時(shí)后采自試驗(yàn)動(dòng)物受光照的左眼。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)背景說明(圖I、圖2):實(shí)驗(yàn)中使用了帶有遺傳缺陷的動(dòng)物(犬類)，在視紫色素基因(Opsin)第四密碼子上發(fā)生突變(ACG —AGG)，引起了視紫色素蛋白第四個(gè)氨基酸的改變(由蘇氨酸變成精氨酸，Threonine — Arginine)。這一改變導(dǎo)致視紫色素蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常。很微弱的光照就會(huì)使得這些動(dòng)物的視網(wǎng)膜退化，大量的視網(wǎng)膜細(xì)胞會(huì)迅速死亡。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左眼受到微弱的光照，而右眼則被遮擋，予以保護(hù)的情況下，免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明左眼視網(wǎng)膜細(xì)胞在I小時(shí)后開始死亡，3-5小時(shí)期間大量細(xì)胞迅速死亡(70%細(xì)胞在此時(shí)間段內(nèi)死亡)，12小時(shí)細(xì)胞死亡過程基本停止，因?yàn)?5%以上視網(wǎng)膜細(xì)胞已經(jīng)死亡。受保護(hù)的右眼中沒有發(fā)生視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。實(shí)施例II)提取有相當(dāng)純度和數(shù)量的核蛋白樣品是本方法的基礎(chǔ)。在200毫克組織樣品中加入I. 5毫升緩沖液，以最高速度勻漿40秒；整個(gè)勻漿過程在冰浴中進(jìn)行，每勻漿10秒，須停機(jī)冷卻10秒。2)勻漿后低速離心(2000g，10分鐘，4°C )收集沉淀物，將其充分懸浮于I毫升洗滌液中，室溫下輕微震蕩I分鐘。3)再次離心(4000g，10分鐘，4°C )，收集沉淀物并將其充分懸浮于200微升提取緩沖液中；室溫下輕微搖動(dòng)震蕩過夜。4)高速離心(15，OOOg, 30分鐘，4°C )，收集上清液；在沉淀物中加入100微升提取緩沖液，充分懸浮后，室溫下輕微搖動(dòng)震蕩60分鐘，取出上清液，與以上上清液合并；分裝，低溫儲(chǔ)存(_80°C )。5)用含32P的單核苷酸(32P-ATP)在T4多聚核苷酸激酶系統(tǒng)中標(biāo)記特定的AP-1結(jié)合順序(5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'，SEQ ID No. I)寡核苷酸片段(購(gòu)自 PR0MEGA公司)。6)混合32P標(biāo)記寡核苷酸片段和組織核蛋白樣品于EMSA緩沖系統(tǒng)(購(gòu)自PR0MEGA)中，室溫下靜置30分鐘。7)用中性TBS緩沖系統(tǒng)配制6%聚丙烯酰胺凝膠；在每個(gè)結(jié)合反應(yīng)樣品中加入凝膠樣品緩沖液，充分混合后加至凝膠中，進(jìn)行電泳分離。8)真空凝膠干燥器將電泳凝膠抽干，曝光X光膠片或感光屏(phosphorescenceimager screen, GE Healthcare),顯示放射性標(biāo)記的帶有AP-1結(jié)合順序寡核苷酸的片段與AP-I蛋白復(fù)合物位置，測(cè)定其相對(duì)密度；即可比較AP-I水平。9)在測(cè)得了 AP-I水平后，明確地顯示了其與組織細(xì)胞死亡過程(速率、數(shù)量等等)的密切的相關(guān)性。其中，勻漿緩沖系統(tǒng)配方為蔗糖0.25M，pH7. 5-8. O的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 15mM，氯化鉀60mM，氯化鈉15mM，pH 8. O的乙二胺四乙酸5mM，pH 8. O的乙二醇二乙醚二胺四乙酸ImM,精胺O. 15mM,精脒O. 15mM, 二硫蘇糖醇ImM,苯甲基磺酰氟O. 5mM蛋白酶抑制劑,25微升/暈升。洗滌緩沖液配方為pH 7.3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸或N-(2_羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂I. 5mM,氯化鉀10mM，二硫蘇糖醇1禮，蛋白酶抑制劑25微
升/暈升°提取緩沖液配方為pH 7. 3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N_(2_羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂0. 75mM,氯化鉀0. 5mM, 二硫蘇糖醇ImM，磷酸鈉0. ImM,甘油12. 5%，蛋白酶抑制劑25微升/毫升。上述蛋白酶抑制劑均為MERCK公司產(chǎn)品-Protease Inhibitor Cocktail SetIII。
權(quán)利要求
1.一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于首先從視網(wǎng)膜組織中分離細(xì)胞核蛋白樣品，用放射性同位素32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段，并與核蛋白提取物反應(yīng)，然后通過電泳遷移率漂移試驗(yàn)檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白/DNA復(fù)合物，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行定量分析，最后將轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白/DNA復(fù)合物定量分析結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)到的細(xì)胞死亡過程相對(duì)照，從而確定視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于該方法具體包含如下步驟 1)從視網(wǎng)膜組織中分離具有細(xì)胞核蛋白； 2)放射性同位素32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段，標(biāo)記后的寡核苷酸片段與核蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)； 3)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離結(jié)合反應(yīng)物； 4)抽干凝膠并曝光感光屏或X光膠片； 5)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I蛋白與32P標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段結(jié)合后，其復(fù)合物帶有放射性，能曝光感光屏或X膠片而顯現(xiàn)出清晰的條帶，測(cè)定條帶的位置和相對(duì)密度，即可獲得有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I水平的數(shù)據(jù)； 6)將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I水平提升的速率和樣式與免疫組織化學(xué)手段所顯示的細(xì)胞死亡進(jìn)程作比對(duì)，從而確定視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟I)所述的從視網(wǎng)膜組織中分離具有細(xì)胞核蛋白的方法為在勻漿緩沖系統(tǒng)中將組織勻漿，低速離心，取出沉淀物，充分懸浮于洗滌緩沖液中，再次離心，取出沉淀物，沉淀物充分懸浮于提取緩沖液中，充分提??；高速離心提取物，取上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于所述的勻漿緩沖系統(tǒng)配方為蔗糖O. 25M，pH7. 5-8. O的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸15mM，氯化鉀60mM，氯化鈉15mM，pH 8. O的乙二胺四乙酸5mM，pH 8.0的乙二醇二乙醚二胺四乙酸ImM，精胺O. 15mM,精脒O. 15mM, 二硫蘇糖醇ImM,苯甲基磺酰氟O. 5mM蛋白酶抑制劑，25微升/毫升；所述的洗滌緩沖液配方為pH 7. 3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂I. 5mM,氯化鉀10mM，二硫蘇糖醇ImM，蛋白酶抑制劑25微升/毫升；所述的提取緩沖液配方為pH 7. 3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸10mM，氯化鎂O. 75mM,氯化鉀O. 5mM, 二硫蘇糖醇ImM，磷酸鈉O. ImM，甘油12. 5%，蛋白酶抑制劑25微升/毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟2)的具體方法是用含有放射性同位素32P的單核苷酸標(biāo)記特定的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I結(jié)合順序寡核苷酸片段SEQ ID No. 1，獲得帶有放射線標(biāo)記的片段；混合標(biāo)記片段、核蛋白樣品和結(jié)合緩沖液，在室溫下反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟3)所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用中性的非變性凝膠電泳系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于采用對(duì)放射性敏感的特殊感光屏。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-I判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟5)測(cè)定條帶的位置和相對(duì)密度采用應(yīng)用美國(guó)GE公司ImageQuantworkstation。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1判斷視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。首先從視網(wǎng)膜組織中分離細(xì)胞核蛋白樣品，用放射性同位素32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1結(jié)合順序寡核苷酸片段，并與核蛋白提取物反應(yīng)，然后通過電泳遷移率漂移試驗(yàn)檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1蛋白/DNA復(fù)合物，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行定量分析，最后將轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1蛋白/DNA復(fù)合物定量分析結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)到的細(xì)胞死亡過程相對(duì)照，從而確定視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程。通過本發(fā)明方法判斷遺傳性視網(wǎng)膜退化中視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡進(jìn)程，為臨床診斷遺傳性視網(wǎng)膜退化提供參考數(shù)據(jù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品用量小、結(jié)果明確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102928603SQ20111022574
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者顧烽, 劉軍, 王平, 顧大年, 李則孝 申請(qǐng)人:劉軍, 顧烽, 王平