專利名稱：檢測β-興奮劑類藥物的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化學發(fā)光檢測試劑盒及方法，具體涉及一種檢測尿液、動物組織(肌肉、肝臟)、飼料中β -興奮劑殘留量的磁顆?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術：
沙丁胺醇(Salbutamol)和克倫特羅(Clenbuterol)均屬于β_受體激動藥，臨床主要用于治療支氣管哮喘；此類藥物還可以作為牛、羊、豬、禽的等的促生劑，曾一度被廣泛應用于獸禽生產(chǎn)。但由于興奮劑容易在動物肝臟中積聚殘留，并可以通過食物鏈進入人體，嚴重危害人體的健康，所以歐共體國家已將此類藥物劃為禁用。因此加強對動物食品中β_興奮劑殘留的檢測是必要的。檢測β興奮劑殘留量的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等方法。I、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精度高、假陽性率低的特點。HPLC法的主要缺點是儀器價格昂貴，操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復雜。2、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)靈敏度很高，假陽性率低。該方法的主要缺點是樣品需要衍生化這樣復雜的前期處理。雖然經(jīng)過衍生化處理的樣品能在質(zhì)譜中給出更多的結構信息，但是衍生化會產(chǎn)生多個不同的產(chǎn)物并導致樣品的部分丟失，造成實驗結果的偏差。3、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)，樣品不需要衍生化處理，可對尿液、血液、肝臟、毛發(fā)和眼球樣品進行檢測。LC-MS/MS聯(lián)用，可進一步提高信噪比，所以可用于對陽性結果的確認手段。但是，無論LC-MS還是LC-MS/MS，儀器檢測法與GC-MS —樣，并未能解決儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理復雜，對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求高等問題。4、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測，最早應用于傳染病、腫瘤標志物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領域推廣應用，目前依托ELISA技術的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測領域的主導產(chǎn)品，同時也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測法基于抗原-抗體的特異性反·應，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術的發(fā)展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在I)非均相反應檢測過程中為分離游離物與結合物，需要多步洗板過程，耗時費力，難以提高操作的自動化程度。2)酶催化反應借助酶催化底物顯色，測定反應液吸光度值。反應的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種檢測β-興奮劑類藥物的化學發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進行β -興奮劑類藥物的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應速度。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種β -興奮劑類藥物的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種β -興奮劑類藥物檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。
所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的β -興奮劑類藥物半抗原。所述的異魯米諾衍生物是ABEI、AHEI或ΑΒΕΝ。所述的試劑盒還包括標準品，質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標記物是FITC標記β -興奮劑類藥物單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測β -興奮劑類藥物的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復合物沉淀；4)上述清洗步驟重復2-4次；5) 4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算β_興奮劑類藥物的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發(fā)明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結果匯總、質(zhì)量控制、結果儲存和結果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于 2-4% 人血清白蛋白，O. 1-0. 2 % 吐溫-20，O. 2 % NaN3, pH7. 2-7.6的PBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的β -興奮劑類藥物半抗原，其保存于含ΡΗ7. 2-7. 6,0. 1-0. 3%吐溫-20，O. 2% NaN3的PBS緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標記物是FITC標記的β -興奮劑類藥物單克隆抗體，其保存于ΡΗ7. 2-7. 6，含5-8%牛血清白蛋白，O. 2-0. 4% NaN3的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
β -興奮劑類藥物標準品溶液(0ng/ml,0. 01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml, I. Ong/ml)，標準品稀釋液為pH7. 4,0. 3% NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量
為質(zhì)量百分含量。β-興奮劑類藥物質(zhì)控品溶液濃度分別為0.02ng/ml，0.8ng/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 4,0.3% NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的濃縮洗液為PH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4%吐溫-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. 1-0. 2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下I)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測β -興奮劑類藥物，對其他藥物無交叉。
2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對β -興奮劑類藥物的檢測靈敏度可達O. Olng/ml ο3)本發(fā)明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。
具體實施例方式實施例一試劑盒具體組分的制備I) β -興奮劑類藥物半抗原的合成以克倫特羅為中間體，用琥珀酸酐進行?；磻?，改造克倫特羅分子結構中的醇羥基，制備成β-興奮劑類藥物半抗原2) β -興奮劑類藥物人工抗原的制備將β_興奮劑類藥物半抗原與牛血清白蛋白采用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到免疫原。3)單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。4)發(fā)光標記物的制備取4.5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應3-4h。取上述制備的興奮劑類藥物半抗原15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將β -興奮劑類藥物單克隆抗體稀釋成I %質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過SephadexG-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。6)分離試劑制備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是O. 15eq/g;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗漆兩次,磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分 別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置于磁分離架上磁分離4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4V偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應15min或100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA,O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復溶于含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測β -興奮劑類藥物的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的興奮劑類藥物單克隆抗體的熒光標記物ABEI標記的β -興奮劑類藥物半抗原的發(fā)光標記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑β -興奮劑類藥物標準品溶液(0ng/ml,0. 01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml, I. Ong/ml)，標準品稀釋液為pH7. 4,0. 3% NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。β-興奮劑類藥物質(zhì)控品溶液濃度分別為0.02ng/ml，0.8ng/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 4,0.3% NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。濃縮洗液為ρΗ7· 6,0. 4%吐溫-20,0. 2% NaN3,0. lmol/L PBS緩沖液。所述百分
含量為質(zhì)量百分含量。實施例三實際樣品中β -興奮劑類藥物的檢測I、樣本前處理(一 )尿液取20 μ I清亮尿樣直接測定(如尿樣渾濁必須通過過濾或3000g以上，15°C離心IOmin直至清亮)，暫不使用的樣本應冷凍保存，樣品稀釋倍數(shù)1
( 二)動物組織稱取3. 0±0. 05g均質(zhì)樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入15ml乙腈-HCl溶液混合，用振蕩器充分振蕩IOmin ；10-15°C,3000g以上離心10分鐘；取5ml上清液加入5mlO. IM HCl溶液混勻后加入6ml正己烷充分混合2min ；10-15°C 3000g以上離心5min，去除正己烷相，加Iml IM NaOH混合后加入6ml三氯甲烷，充分振蕩lOmin，10_15°C 5000g離心lOmin。取下層相,減壓抽干或氮氣吹干,取Iml再加Iml復溶液溶解于干燥殘留物,取20 μ I進行分析，樣本稀釋倍數(shù)1。(三)飼料用研缽研碎飼料樣本，稱取2. 0±0. 05g研碎的樣本，再向樣品中加甲醇-乙醇6ml混合物，取上清液2ml加入二氯甲烷8ml混勻，靜置分層，取下層50°C減壓蒸干，用Iml復溶液溶解干燥殘留物，取20 μ I進行分析，樣本稀釋倍數(shù)100。
2、用試劑盒檢測與結果分析分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ I，混勻后在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復合物沉淀；所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中β -興奮劑類藥物的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU結合標準曲線法計算β -興奮劑類藥物的濃度。激發(fā)底物I是NaOH，激發(fā)底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10-20遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強堿溶液腐蝕底物泵。本發(fā)明采用6個β_興奮劑類藥物標準品(0ng/ml,0. 01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml, O. 3ng/ml, I. Ong/ml)進行曲線測繪。儀器根據(jù)所述方法檢測得到一條RLU值與β-興奮劑類藥物濃度相關的定標曲線，此后測量中，每一個樣本中的β_興奮劑類藥物濃度與標準曲線相比較得出樣本中的β_興奮劑類藥物含量。實施例四試劑盒質(zhì)量的測定I、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為O. O lng/ml 02、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重復性，常用變異系數(shù)表示。按照實施例三的樣本提取方法，以O. 02ng/g(ml)、0. 04ng/g(ml)兩個濃度的β -興奮劑類藥物對豬肉、尿液樣本進行添加，以2ng/g、4ng/g兩個濃度的β -興奮劑類藥物對飼料樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結果見下表。表I準確度和精密度測定ng/g(ml)
權利要求
1.一種檢測β-興奮劑類藥物的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的β_興奮劑類藥物半抗原。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標記物是ΑΒΕΙ、AHEI 或 AffiN。
6.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標準液、質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標記物是FITC標記的β-興奮劑類藥物單克隆抗體。
8.一種利用權利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測β_興奮劑類藥物的方法，包括下列步驟 1)分別吸取20μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫15min ； 2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ 1，混勻后在37°C溫育5min ； 3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ I沖洗復合物沉淀； 4)上述清洗步驟重復2-4次； 5)4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中β-興奮劑類藥物的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算β -興奮劑類藥物的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測β-興奮劑類藥物的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標記物是異魯米諾發(fā)光標記物標記的β-興奮劑類藥物半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的β-興奮劑類藥物單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中β-興奮劑類藥物的方法，本方法對β-興奮劑類藥物檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N21/76GK102928414SQ201110227578
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權日2011年8月9日
發(fā)明者何方洋, 周德剛, 馮月君, 馮才茂, 何麗霞, 楊昌松 申請人:北京勤邦生物技術有限公司