專利名稱：檢測雌二醇的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學發(fā)光檢測試劑盒及其測試方法，具體的涉及一種檢測動物組織、飼料、尿液等樣品中雌二醇的磁顆?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
雌二醇(Estradiol，E2)是應(yīng)用廣泛的甾類同化 激素，被大量用于促進反芻類動物的生長，因其可以促進動物及提高畜禽瘦肉比，在禽獸養(yǎng)殖業(yè)曾經(jīng)應(yīng)用。但由于雌二醇可在動物組織內(nèi)高殘留，通過食物鏈危害人類健康，是女性兒童提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化；男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常或引起病變；并導(dǎo)致女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升，且雌二醇存在明顯的致癌性，歐美等發(fā)達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。中華人民共和國國務(wù)院第226號文件，《飼料和飼料添加劑管理條例》中規(guī)定雌二醇在飼料中不得檢出。目前，雌二醇的檢測方法常見的有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。I、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精度高、假陽性率低的特點。HPLC法的主要缺點是儀器價格昂貴，操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復(fù)雜。2、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)靈敏度很高，假陽性率低。該方法的主要缺點是樣品需要衍生化這樣復(fù)雜的前期處理。雖然經(jīng)過衍生化處理的樣品能在質(zhì)譜中給出更多的結(jié)構(gòu)信息，但是衍生化會產(chǎn)生多個不同的產(chǎn)物并導(dǎo)致樣品的部分丟失，造成實驗結(jié)果的偏差。3、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測，最早應(yīng)用于傳染病、腫瘤標志物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領(lǐng)域推廣應(yīng)用，目前依托ELISA技術(shù)的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測領(lǐng)域的主導(dǎo)產(chǎn)品，同時也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測法基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術(shù)操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在I)非均相反應(yīng)檢測過程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過程，耗時費力，難以提高操作的自動化程度。2)酶催化反應(yīng)借助酶催化底物顯色，測定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測雌二醇藥物的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進行雌二醇藥物的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種雌二醇藥物的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種雌二醇藥物檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的雌二醇半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。 所述的試劑盒還包括標準品,質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標記物是FITC標記雌二醇單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測雌二醇的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5) 4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標準曲線法計算雌二醇的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發(fā)明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結(jié)果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于含有3_6 %牛血清白蛋白，O. 2_0. 4 %吐溫-20，O. 2 %疊氮化鈉，PH7. 0-7. 4的磷酸鹽緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的雌二醇半抗原，其保存于含PH7. 2-7. 6，O. 1-0. 3%吐溫-20，O. I %疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液中。所述百分含
量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標記物是FITC標記的雌二醇單克隆抗體，其保存于PH7. 2-7. 6，含3-5%牛血清白蛋白，O. 2-0. 4%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。雌二醇標準品溶液(Ong/ml, O. 03ng/ml, O. lng/ml, O. 3ng/ml, I. Ong/ml, 3. Ong/ml),標準品稀釋液為pH7. 2,0. 3%疊氮化鈉,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。雌二醇質(zhì)控品溶液濃度分別為O. 05ng/ml，2. Ong/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 2，O. 3%疊氮化鈉，O. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的濃縮洗液為pH7. 1-7. 5,0. 2-0. 4 %吐溫-20，O. 2-0. 4 %疊氮化鈉，O. l-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下I)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對雌二醇的檢測靈敏度可達O. 03ng/ml。2)本發(fā)明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。
具體實施例方式實施例I試劑盒具體組分的制備
I)雌二醇半抗原的合成將雌二醇和溴代丁酸乙酯通過反應(yīng)合成雌二醇半抗原。2)雌二醇人工抗原的制備將雌二醇半抗原與血藍蛋白采用水溶性碳化二亞胺法進行偶聯(lián)得到免疫原。3)單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。4)發(fā)光標記物的制備取4. 5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應(yīng)3-4h。取上述制備的雌二醇半抗原15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應(yīng)過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將雌二醇單克隆抗體稀釋成I %質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過SephadexG-25或G_50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。6)分離試劑制備
a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是O. 15eq/g;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗漆兩次,磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置于磁分離架上磁分離4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. O,MES清洗2_3次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4V偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應(yīng)的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應(yīng)15min或100μ 1， ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復(fù)溶于含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20, O. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測雌二醇的磁顆粒化學發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的雌二醇單克隆抗體的熒光標記物ABEI標記的雌二醇半抗原的發(fā)光標記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑雌二醇標準品溶液(Ong/ml, O. 03ng/ml, O. lng/ml, O. 3ng/ml, I. Ong/ml, 3. Ong/ml),標準品稀釋液為pH7. 2,0. 3%疊氮化鈉,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。雌二醇質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 05ng/ml,2. Ong/ml，質(zhì)控品稀釋液ρΗ7· 2,0.3%疊氮化鈉，0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。濃縮洗液為pH7. 2,0. 3%吐溫-20，0. 3%疊氮化鈉，0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。實施例三實際樣品中雌二醇的檢測I、樣本前處理(一 )組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，力口入IOml乙腈-0. IM氫氧化鈉溶液，用振蕩器振蕩10min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;取Iml上清液至IOml干凈的玻璃試管中，于50 6(TC水浴氮氣流下吹干；用0. 5ml三氯甲烷溶解；加入2ml IM氫氧化鈉溶液進行反萃取，劇烈充分振蕩5min，3000g以上，室溫(20-25°C )離心lOmin，取Iml上清液加入100 μ I 6Μ磷酸溶液混勻；加入5ml乙腈-三氯甲烷混合液，用振蕩器振蕩10min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心lOmin，去全部上層，取全部下層有機相至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；用Iml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；取50μ I水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)10。( 二)尿液前處理方法
取2ml尿液到離心管中，3000g以上，室溫(20-25 V )離心lOmin，直至清亮；移取Iml清亮尿液樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10 μ I Glucuronidase/Arylsulfatase (葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)，在37°C水解3h ;加入5ml三氯甲燒用振蕩器振蕩10min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;取下層有機相Iml至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；用Iml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；取50 μ I水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)5。(三)飼料前處理方法稱取2. 0±0. 05g飼料樣本，加入8ml乙腈，用振蕩器振蕩lOmin，3000g以上，15°C離心IOmin ;取2ml上清液至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；力口入O. 5ml氯仿，用渦旋儀渦動20s，加入2ml IM氫氧化鈉溶液，用渦旋儀渦動30s，3000g以上，15°C離心5min ;取1ml，加入100 μ I 6Μ磷酸溶液，用渦旋儀渦動IOs ;樣本溶液與復(fù)溶 工作液按I : 39的體積比進行稀釋(25 μ I樣本提取液+975 μ I復(fù)溶工作液)，用渦旋儀渦動混勻；取50μ I水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)160。2、用試劑盒檢測與結(jié)果分析分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；所得分離好的復(fù)合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中雌二醇的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU結(jié)合標準曲線法計算雌二醇的濃度。激發(fā)底物I是NaOH，激發(fā)底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10-20遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應(yīng)的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應(yīng)超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強堿溶液腐蝕底物泵。本發(fā)明采用6 個雌二醇標準品(Ong/ml,O. 03ng/ml,0. lng/ml,0. 3ng/ml, I. Ong/ml, 3. Ong/ml)進行曲線測繪。儀器根據(jù)所述方法檢測得到一條RLU值與雌二醇濃度相關(guān)的定標曲線，此后測量中，每一個樣本中的雌二醇濃度與標準曲線相比較得出樣本中的雌二
醇含量。實施例四試劑盒質(zhì)量的測定I、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為0. 03ng/ml。2、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。按照實施例三的樣本提取方法，以0. 6ng/g(ml)、1. 2ng/g(ml)兩個濃度的雌二醇對雞肉樣本進行添加，以0. 3ng/g、0. 6ng/g兩個濃度的雌二醇對尿液樣本進行添加回收，以3. 2ng/g、6. 4ng/g兩個濃度的雌二醇對飼料樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結(jié)果見下表。表I準確度和精密度測定ng/g (ml)
權(quán)利要求
1.一種檢測雌二醇的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的雌二醇半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標記物是ABEI、AHEI 或 AffiN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標準液、質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標記物是FITC標記的雌二醇單克隆抗體。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測雌二醇的方法，包括下列步驟 ·1)分別吸取20μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加·20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ； ·2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ 1，混勻后在37°C溫育·5min ； ·3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ I沖洗復(fù)合物沉淀； ·4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次； ·5)4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中雌二醇的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標準曲線法計算雌二醇的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測雌二醇的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標記物是異魯米諾發(fā)光標記物標記的雌二醇半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的雌二醇單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中雌二醇的方法，本方法對雌二醇檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N33/543GK102928415SQ20111022758
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者馮才偉, 羅曉琴, 馮才茂, 余厚美, 劉福林, 崔廷婷 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司