專利名稱：膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜、建立方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥，特別是膀胱癌。本發(fā)明還涉及代謝組學(xué)，特別是基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)的代謝組學(xué)。本發(fā)明為早期診斷膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依據(jù)，并提供了膀胱癌患者尿液中特異性代謝物譜以及相關(guān)特異性生物標(biāo)記物。并且本發(fā)明還提供了建立膀胱癌患者尿液中特異性代謝物譜以及篩選相關(guān)特異性生物標(biāo)記物的方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌是臨床上常見的腫瘤之一，世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位[1]。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童，但是主要發(fā)病年齡為中年以后，并且其發(fā)病隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。在我國(guó)，男性膀胱癌發(fā)病率居全身腫瘤的第八位，女性排在十二位以后，發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國(guó)家。近年來(lái)，我國(guó)部分城市腫瘤發(fā)病率報(bào)告顯示成升高趨勢(shì)，膀胱癌男性發(fā)病率為女性的3 4倍[2]。目前對(duì)于膀胱癌的診斷缺乏比較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)并且現(xiàn)有的診斷方法如癥狀觀察(血尿)、超聲檢查、CT檢查、細(xì)胞學(xué)檢查以及膀胱鏡等都具有一定的缺陷，例如，癥狀的觀察則主觀性太強(qiáng)，超聲檢查、CT檢查、細(xì)胞學(xué)檢查以及膀胱鏡等均為侵入式診斷，給患者帶來(lái)額外的痛苦；現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的尿液中單一的腫瘤標(biāo)志物診斷則存在敏感性和特異性差，假陽(yáng)性率較高等缺點(diǎn)，開發(fā)一種無(wú)創(chuàng)、特異性、準(zhǔn)確的膀胱癌診斷方法具有重要的意義[3、4]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)科，研究生物體在內(nèi)在或者外在因素影響后其內(nèi)源性代謝物種類、數(shù)量以及變化規(guī)律。代謝組學(xué)對(duì)有機(jī)體的整個(gè)代謝譜進(jìn)行分析，探尋代謝物與生理病理變化之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而為疾病診斷提供依據(jù)。Pasikanti等采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析了尿液中的代謝物譜，其代謝組學(xué)的方法具有100%的靈敏度，可用于膀胱癌的早期診斷和疾病分期[5]。然而，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析僅能夠分析極性較低的代謝物，并且該方法需要衍生化步驟，操作繁瑣，重現(xiàn)性較差，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有膀胱癌診斷方法的有創(chuàng)傷性，侵入性等缺點(diǎn)，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一種代謝組學(xué)技術(shù)為膀胱癌早期診斷提供依據(jù)，該方法具有靈敏度高，特異性好，無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，對(duì)尿液僅需簡(jiǎn)單處理，成本低廉，適合大規(guī)模篩查，并且同樣具有良好的特異性和靈敏度，具有非常好的應(yīng)用前景。本發(fā)明為早期診斷膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依據(jù)。通過(guò)尋找膀胱癌患者尿液中特異性代謝物譜以及相關(guān)特異性生物標(biāo)記物，建立檢測(cè)該生物標(biāo)記物的方法。本發(fā)明運(yùn)用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)成批分析正常人群和膀胱癌患者群的尿液樣本的代謝物譜，并用模式識(shí)別進(jìn)行分析比較正常人群與膀胱癌患者群的代謝物譜，確定特異性液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)，定性或者定量分析膀胱癌患者得特異性代謝物譜數(shù)據(jù)， 為后續(xù)理論研究和臨床診斷提供依據(jù)。本發(fā)明提供了一種代謝組學(xué)技術(shù)在膀胱癌疾病中的應(yīng)用，其步驟為(1)樣本的收集與處理收集臨床病人或者模型動(dòng)物的尿液樣本；樣本經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取，有機(jī)溶劑包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈等；或者經(jīng)過(guò)蛋白沉淀，蛋白沉淀方法包括加入有機(jī)溶劑(例如甲醇、乙醇、丙酮、 乙腈、異丙醇)、各類酸堿鹽沉淀、加熱沉淀、過(guò)濾/超濾、固相萃取，離心等方法單獨(dú)或者綜合的方式進(jìn)行處理；樣本進(jìn)行干燥或者不進(jìn)行干燥再利用各種有機(jī)溶劑(例如甲醇，乙腈，異丙醇，氯仿等，優(yōu)選為甲醇、乙腈)或者水(單獨(dú)或者組合，不含鹽或者含鹽)溶解；樣本不進(jìn)行衍生化或者利用試劑(例如三甲基硅烷，氯甲酸乙酯，N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺等)進(jìn)行衍生化處理。(2)液相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定(HPLC-MQ 采用基于液相色譜和質(zhì)譜的方法得到尿液中的代謝物譜，代謝物譜經(jīng)過(guò)處理得到各個(gè)峰的峰高或者峰面積以及質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間
等數(shù)據(jù)。(3)模式識(shí)別分析尿液中代謝物譜上述數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，可以為 R、MATLAB、SPSS、SIMCA-P等，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)、聚類分析等方法建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)步驟O)中產(chǎn)生的代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與膀胱癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。(4)生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)了一組尿液中的生物標(biāo)記物用于膀胱癌疾病的診斷或者為膀胱癌早期診斷提供依據(jù)。機(jī)體內(nèi)源性小分子是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，疾病的狀態(tài)與機(jī)體功能的變化必然會(huì)引起內(nèi)源性小分子在體內(nèi)代謝的變化，研究表明，正常人與膀胱癌病人的代謝譜存在明顯的差異，并且處于不同病理期膀胱癌患者的代謝譜同樣存在著明顯的差異，代謝組學(xué)技術(shù)有助于膀胱癌等疾病的診斷。1.檢測(cè)尿液中的代謝物譜和相關(guān)的生物標(biāo)記物，與目前常用膀胱鏡檢查、細(xì)胞學(xué)檢查等侵入性方法相比，具有無(wú)創(chuàng)，方便快捷的特點(diǎn)。2.準(zhǔn)確反映膀胱癌患者與正常人的代謝譜差異，特異性高。不希望受任何理論的限制，發(fā)明人指出這些生物標(biāo)志物是存在于人體中的內(nèi)源性化合物。通過(guò)本發(fā)明所述的方法對(duì)受試者尿液的代謝物譜進(jìn)行分析，代謝物譜中的質(zhì)量數(shù)值指示相應(yīng)生物標(biāo)志物的存在及在代謝物譜中的對(duì)應(yīng)位置。同時(shí)，膀胱癌患者的所述生物標(biāo)志物在其代謝物譜中表現(xiàn)出一定的含量范圍值。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明一方面提供了一種建立受試者尿液代謝物譜的方法，包括以下步驟(1)樣本的收集與處理收集受試者的尿液樣本，經(jīng)處理去除蛋白質(zhì)等大分子；
(2)液相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定采用基于液相色譜和質(zhì)譜的方法得到尿液中的代謝物譜，并對(duì)代謝譜進(jìn)行分析。本發(fā)明另一方面提供了一種建立膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜的方法，包括以下步驟(1)樣本的收集與處理收集臨床病人與正常人的尿液樣本，經(jīng)處理去除蛋白質(zhì)等大分子；(2)液相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定采用基于液相色譜和質(zhì)譜的方法得到尿液中的代謝物譜，并對(duì)代謝譜進(jìn)行分析；(3)模式識(shí)別分析尿液中代謝物譜上述數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)步驟O)中產(chǎn)生的代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與膀胱癌患者代謝物譜的差異， 從而確定特異性代謝物譜。在本發(fā)明所述的一種建立受試者尿液代謝物譜的方法或一種建立膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜的方法中，步驟(1)中的處理包括樣本經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃??；或者經(jīng)過(guò)蛋白沉淀；樣本進(jìn)行干燥或者不進(jìn)行干燥，再利用單獨(dú)或者組合的有機(jī)溶劑或者水進(jìn)行溶解，所述水不合鹽或者含鹽，鹽包括氯化鈉，磷酸鹽，碳酸鹽等；樣本不進(jìn)行衍生化或者利用試劑進(jìn)行衍生化處理。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(1)有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取中，所述有機(jī)溶劑包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(1)蛋白沉淀中，包括但不限于加入有機(jī)溶劑、各類酸堿鹽沉淀、加熱沉淀、過(guò)濾/超濾、固相萃取、離心方法單獨(dú)或者組合的方式進(jìn)行處理，其中所述有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(1)中優(yōu)選地包括使用蛋白沉淀方法進(jìn)行處理，優(yōu)選地使用乙醇進(jìn)行蛋白沉淀。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(1)樣本進(jìn)行干燥或者不進(jìn)行干燥，再利用有機(jī)溶劑或者水溶解中，所述有機(jī)溶劑包括甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿，優(yōu)選為甲醇、乙腈。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(1)樣本利用試劑進(jìn)行衍生化處理中，所述試劑包括三甲基硅烷，氯甲酸乙酯，N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟O)中代謝物譜經(jīng)過(guò)處理得到原始數(shù)據(jù)， 所述原始數(shù)據(jù)優(yōu)選地是各個(gè)峰的峰高或者峰面積以及質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間等數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟O)中，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)和峰匹配， 優(yōu)選地采用XCMS軟件進(jìn)行所述峰檢測(cè)和峰匹配。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(3)中的多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件包括R、 MATLAB, SPSS、SIMCA-P，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)、聚類分析方法或這些方法的一種或多種建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)選地使用XCMS軟件行峰檢測(cè)和峰匹配，采用R軟件采用O-PLS-DA對(duì)正常組代謝物譜和膀胱癌組代謝物譜進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，建立O-PLS-DA數(shù)學(xué)模型；本發(fā)明另一方面包括使用本發(fā)明所提供的種建立膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜的方法建立的膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述代謝物譜的用途，其用于判斷所述受試者是否患有膀胱癌，其中包括以下步驟將受試者樣本根據(jù)本發(fā)明所述的方法進(jìn)行分析，并將結(jié)果與本發(fā)明所述的膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜進(jìn)行比較，優(yōu)選地利用多元統(tǒng)計(jì)模型歸類進(jìn)行比較，從而判斷所述受試者是否患有膀胱癌。本發(fā)明還包括篩選尿液中的生物標(biāo)記物的方法，除了上述步驟(1)-03)外，其進(jìn)一步包括以下步驟用于篩選膀胱癌患者尿液中的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物用于膀胱癌疾病的診斷或者為膀胱癌早期診斷提供依據(jù)采用主成分分析方法和OPLS-DA對(duì)正常組代謝物譜和膀胱癌組代謝物譜進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，優(yōu)選地采用SIMCA-P+12. 0. 1軟件，進(jìn)一步通過(guò)VIP值和 S-plot篩選潛在的生物標(biāo)志物。在本發(fā)明所述篩選尿液中的生物標(biāo)記物的方法中，根據(jù)模式識(shí)別模型OPLS-DA的 VIP值篩選潛在標(biāo)志物，在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的變量，并進(jìn)一步根據(jù)荷載圖和S-plot圖進(jìn)一步選擇具有較大偏差和相關(guān)性的變量，以及結(jié)合P值小于0. 05的變量。本發(fā)明還包括根據(jù)上述篩選尿液中的生物標(biāo)記物的方法，得到的膀胱癌的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物是在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的變量，并在荷載圖和S-plot 圖中具有較大偏差和相關(guān)性的變量，以及結(jié)合P值小于0. 05的變量。本發(fā)明所述的生物標(biāo)志物優(yōu)選地包括表1所示21種生物標(biāo)記物中的一種或多種， 優(yōu)選地至少包括表1中的CHO8N,并且包括表1中的至少1種，2種，3種，4種，5種，6種，7 種，8種，9種，10種，15種，或21種。本發(fā)明另一方面還涉及使用本發(fā)明所述的生物標(biāo)志物用于診斷膀胱癌的用途，其中受試者尿液經(jīng)本發(fā)明所述的種建立受試者尿液代謝物譜的方法進(jìn)行分析，并根據(jù)所得受試者尿液代謝物譜確定本發(fā)明所述的生物標(biāo)志物。本發(fā)明進(jìn)一步包括所述的生物標(biāo)志物在制備用于診斷膀胱癌的試劑盒中的用途。


圖1.膀胱癌患者組(a)和正常人組(b)質(zhì)譜總離子流圖.圖2. K-O-PLS-DA模型。PZC-train為正常組訓(xùn)練集，PZC-test正常組預(yù)測(cè)集； PGC-train為膀胱癌組訓(xùn)練集，PGC-test膀胱癌組預(yù)測(cè)集。圖3.主成分分析得分圖。菱形代表正常組，正方形代表膀胱癌組。圖4.主成分分析荷載圖。帶框三角形代表VIP值大于3的變量。圖5. OPLS-DA得分圖。菱形代表正常組，正方形代表膀胱癌組。圖6. S-plot圖。帶框三角形代表VIP值大于3的變量。
實(shí)施例實(shí)施例11. 1樣本收集收集志愿者的晨尿，立即置于-80°C低溫冰箱中儲(chǔ)存。正常組共收集34份尿液樣本，膀胱癌組共收集48份尿液樣本。1. 2樣本的處理冰凍的樣本置于室溫下解凍，取尿液樣本500 μ L至于2. OmL離心管中，加入甲醇500 μ L稀釋，IOOOOrpm離心5min，備用。
1. 3液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀器設(shè)備HPLC-MS-LTQ Orbitrap Discovery (Thermo, Germany)色譜條件色譜柱C18柱(150_Χ2. 1_，5μπι)；流動(dòng)相A :0. 1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B 0. 甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0 3min，5%B，3 36min，5% 80%B，36 40min， 80% 100% B, 40 45min，100% B, 45 50min，100% 5% B, 50 60min，5% B ；流速 0. 2mL/min ；進(jìn)樣體積 20 μ L。質(zhì)譜條件ESI離子源，正離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描質(zhì)量m/z 50 1000。離子源參數(shù)ESI:鞘氣為10，輔氣為5，毛細(xì)管溫度為350°C，錐孔電壓4. 5KV。1. 4數(shù)據(jù)處理采用XCMS 軟件(例如得自 http //metlin. scripps. edu/xcms/)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)和峰匹配，采用R軟件采用O-PLS-DA(Orthogonalprojections to latent structures discriminant analysis)對(duì)正常組代謝物譜(圖lb)和膀胱癌組代謝物譜(圖 la)進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，建立O-PLS-DA數(shù)學(xué)模型。1. 5比較和確定特征性代謝物譜通過(guò)比較正常組與膀胱癌組的尿液代謝物譜圖，建立膀胱癌患者尿液代謝物譜 (圖1)，并通過(guò)K-O-PLS-DA模型，對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)，有助于膀胱癌疾病的診斷。初步研究結(jié)果，正常和膀胱癌組在tp方向上能夠被較好的區(qū)分；通過(guò)選取80%正常組與膀胱癌組代謝物譜數(shù)據(jù)采用K-O-PLS-DA建模作為訓(xùn)練集(PZC-train和PGC-train)，該模型能夠 100%準(zhǔn)確預(yù)測(cè)20%剩余測(cè)試樣本的分組(PZC-test和PGC-test)，具有較高的準(zhǔn)確度和特異性，具有良好的開發(fā)為診斷方法的前景，從而為膀胱癌疾病的診斷提供依據(jù)(圖2)。實(shí)施案例22. 1樣本收集收集志愿者的晨尿，立即置于-80°C低溫冰箱中儲(chǔ)存。正常組共收集34份尿液樣本，膀胱癌組共收集48份尿液樣本。2. 2樣本的處理冰凍的樣本置于室溫下解凍，取尿液樣本500 μ L至于2. OmL離心管中，加入甲醇500 μ L稀釋，IOOOOrpm離心5min，備用。2. 3液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀器設(shè)備HPLC-MS-LTQ Orbitrap Discovery (Thermo, Germany)色譜條件色譜柱C18柱(150_Χ2. 1_，5μπι)；流動(dòng)相A :0. 1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B 0. 甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0 3min，5%B，3 36min，5% 80%B，36 40min， 80% 100% B，40 45min，100% B，45 50min，100% 5% B，50 60min，5% B ；流速 0. 2mL/min ；進(jìn)樣體積 20 μ L。質(zhì)譜條件ESI離子源，正離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描質(zhì)量m/z 50 1000。離子源參數(shù)ESI:鞘氣為10，輔氣為5，毛細(xì)管溫度為350°C，錐孔電壓4. 5KV。
2. 4數(shù)據(jù)處理采用XCMS軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)前處理，得到二維矩陣數(shù)據(jù)，T-test 統(tǒng)計(jì)代謝物峰的顯著性差異；采用SIMCA-P+12. 0. 1軟件采用主成分分析方法(PCA)禾口 OPLS-DA(Orthogonal partial least squaresproject to latent structures-discriminant analysis)對(duì)正常組代謝物譜(圖lb)和膀胱癌組代謝物譜進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，結(jié)合VIP和S-plot圖篩選出潛在的生物標(biāo)志物。2. 5代謝譜分析和潛在的生物標(biāo)志物2. 5. 1 主成分分析(PCA)PCA是一種無(wú)師監(jiān)督模式識(shí)別方法，可以直觀地在多維空間上描述樣本間的差異。 從圖2可知，在PCA模型中，兩組在第一主成分方向上基本分開，表明正常組和膀胱癌組的尿液代謝譜存在明顯的區(qū)別。膀胱癌組樣本分布在正常組的兩端，表明膀胱癌組樣本自身存在明顯的差異，見圖3、4。2. 5. 2正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)采用OPLS-DA方法來(lái)區(qū)分正常組和膀胱癌組，進(jìn)一步通過(guò)VIP值和S-plot篩選潛在標(biāo)志物。從圖4可知，正常組和膀胱癌組在t[l]方向上得到明顯的區(qū)分。如圖5所示， S-plot圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)變量，S-plot圖表明變量與模型的相關(guān)性。帶框三角形標(biāo)記的變量為VIP大于3的變量，它們具有較大的偏差并且與模型有良好的相關(guān)性，見圖5、6。2. 5. 3潛在生物標(biāo)記物 根據(jù)模式識(shí)別模型OPLS-DA的VIP值篩選潛在標(biāo)志物，在OPLS-DA模型中提取VIP 值大于3的變量，并進(jìn)一步根據(jù)荷載圖和S-plot圖進(jìn)一步選擇具有較大偏差和相關(guān)性的變量，以及結(jié)合P值小于0. 05的變量，共得到21個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，如表1所示。表1潛在的生物標(biāo)記物
權(quán)利要求
1.一種建立受試者尿液代謝物譜的方法，包括以下步驟(1)樣本的收集與處理收集受試者的尿液樣本，經(jīng)處理去除蛋白質(zhì)等大分子；(2)液相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定采用基于液相色譜和質(zhì)譜的方法得到尿液中的代謝物譜，并對(duì)代謝譜進(jìn)行分析。
2.一種建立膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜的方法，包括以下步驟(1)樣本的收集與處理收集臨床病人與正常人的尿液樣本，經(jīng)處理去除蛋白質(zhì)等大分子；(2)液相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定采用基于液相色譜和質(zhì)譜的方法得到尿液中的代謝物譜，并對(duì)代謝譜進(jìn)行分析；(3)模式識(shí)別分析尿液中代謝物譜上述數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)步驟O)中產(chǎn)生的代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與膀胱癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(1)中的處理包括樣本經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃??；或者經(jīng)過(guò)蛋白沉淀；樣本進(jìn)行干燥或者不進(jìn)行干燥，再利用單獨(dú)或者組合的有機(jī)溶劑或者水進(jìn)行溶解，所述水不含鹽或者含鹽，鹽包括但不限于氯化鈉，磷酸鹽，碳酸鹽；樣本不進(jìn)行衍生化或者利用試劑進(jìn)行衍生化處理。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(1)有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取中，所述有機(jī)溶劑包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(1)蛋白沉淀中，包括但不限于加入有機(jī)溶劑、各類酸堿鹽沉淀、加熱沉淀、過(guò)濾/超濾、固相萃取、離心方法單獨(dú)或者組合的方式進(jìn)行處理， 其中所述有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(1)中優(yōu)選地包括使用蛋白沉淀方法進(jìn)行處理，優(yōu)選地使用乙醇進(jìn)行蛋白沉淀。
7.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(1)樣本進(jìn)行干燥或者不進(jìn)行干燥，再利用有機(jī)溶劑或者水溶解中，所述有機(jī)溶劑包括甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿，優(yōu)選為甲醇、乙腈。
8.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(1)樣本利用試劑進(jìn)行衍生化處理中，所述試劑包括三甲基硅烷，氯甲酸乙酯，N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺。
9.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟( 中代謝物譜經(jīng)過(guò)處理得到原始數(shù)據(jù)，所述原始數(shù)據(jù)優(yōu)選地是各個(gè)峰的峰高或者峰面積以及質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間數(shù)據(jù)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟( 中，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)和峰匹配，優(yōu)選地采用XCMS軟件進(jìn)行所述峰檢測(cè)和峰匹配。
11.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(3)中的多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件包括R、MATLAB、 SPSS、SIMCA-P，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判別分析 (PLS-DA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)、聚類分析方法或者這些方法的一種或多種建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)選地使用XCMS軟件行峰檢測(cè)和峰匹配，采用R軟件采用O-PLS-DA對(duì)正常組代謝物譜和膀胱癌組代謝物譜進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，建立O-PLS-DA數(shù)學(xué)模型；
12.根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)所述的方法建立的膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述代謝物譜的用途，其用于判斷所述受試者是否患有膀胱癌，其中包括將受試者樣本根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法進(jìn)行分析，并將結(jié)果與權(quán)利要求12所述的膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜進(jìn)行比較，優(yōu)選地利用多元統(tǒng)計(jì)模型歸類進(jìn)行比較。
14.權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟用于篩選膀胱癌患者尿液中的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物用于膀胱癌疾病的診斷或者為膀胱癌早期診斷提供依據(jù)采用主成分分析方法和OPLS-DA對(duì)正常組代謝物譜和膀胱癌組代謝物譜進(jìn)行差異性變量進(jìn)行模式識(shí)別分析，優(yōu)選地采用SIMCA-P+12. 0. 1軟件，進(jìn)一步通過(guò)VIP值和S-plot篩選潛在的生物標(biāo)志物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中根據(jù)模式識(shí)別模型OPLS-DA的VIP值篩選潛在標(biāo)志物，在 OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的變量，并進(jìn)一步根據(jù)荷載圖和S-plot圖進(jìn)一步選擇具有較大偏差和相關(guān)性的變量，以及結(jié)合P值小于0. 05的變量。
16.通過(guò)權(quán)利要求14或15所述的方法篩選的膀胱癌的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物是在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的變量，并在荷載圖和S-plot圖中具有較大偏差和相關(guān)性的變量，以及結(jié)合P值小于0. 05的變量。
17.權(quán)利要求16所述的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物優(yōu)選地包括表1所示21種生物標(biāo)記物中的一種或多種，優(yōu)選地至少包括表1中的CH08N，并且包括表1中的至少1種，2種，3 種，4種，5種，6種，7種，8種，9種，10種，15種，或21種。
18.權(quán)利要求16或17所述的生物標(biāo)志物用于診斷膀胱癌的用途，其中受試者尿液經(jīng)權(quán)利要求1所述的方法進(jìn)行分析，并根據(jù)所得受試者尿液代謝物譜確定權(quán)利要求16或17所述的生物標(biāo)志物。
19.權(quán)利要求16或17所述的生物標(biāo)志物在制備用于診斷膀胱癌的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜、建立方法及用途，特別是一種建立膀胱癌患者尿液中特異性代謝物譜的方法，以及篩選相關(guān)特異性生物標(biāo)記物的方法。本發(fā)明通過(guò)代謝組學(xué)，特別是基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)的代謝組學(xué)，建立了膀胱癌患者尿液特異性代謝物譜。本發(fā)明為早期診斷膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依據(jù)，并提供了膀胱癌患者尿液中特異性代謝物譜以及相關(guān)特異性生物標(biāo)記物。本發(fā)明所提供的方法具有無(wú)創(chuàng)，方便快捷的特點(diǎn)，并且能夠準(zhǔn)確反映膀胱癌患者與正常人的代謝譜差異，特異性高。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102323351SQ20111023020
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者成軍, 欒合密, 黃穎瑜 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司