專利名稱：水蛭素在特定條件下失活后檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及水蛭素在特定條件下失活后檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中華人民共和國《中國藥典》2010年版，第一部記載“水蛭(HIRUD0)”，本品為水蛭科動(dòng)物螞蟥 Whitmania pigra Whitman、/K蛭 Hirudo nipponica Whitman 或柳葉螞蟥 Whitmania wranulata Whitman的干燥全體，夏、秋二季捕捉，用沸水燙死，曬干或低濕干燥。炮制水蛭洗凈、切段、干燥。燙水蛭取凈水蛭段，照燙法用滑石粉澆至微鼓起。功能與主治破血，逐瘀，通經(jīng)。用于血瘀經(jīng)閉，跌撲損傷。國外醫(yī)學(xué)輸血及血液分冊1993年第16卷第6期記載中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所，郭娟綜述王荷碧審?！爸亟M水蛭素的研究進(jìn)展”Haycraft于1884年發(fā)現(xiàn)醫(yī)用水蛭提取物中有抗凝物質(zhì)。50年代末，Markwardt首次分離出純品，命名為水蛭素(Hirudin)，并知其為凝血酶特異抑制劑，是一種理想的抗凝、抗血栓制劑。80年代初得知其結(jié)構(gòu)和氨基酸順序。因天然水蛭素提取步驟繁瑣，且飼養(yǎng)水蛭困難，水蛭來源匱乏，難于得到足夠量的純品，使研究與臨床應(yīng)用受到限制。近年來，基因工程技術(shù)的發(fā)展彌補(bǔ)了這一缺陷，利用化學(xué)合成、cDNA文庫、PCR方法獲得基因克隆，表達(dá)獲得重組水蛭素，從而較深入地研究了水蛭素的藥理學(xué)、藥效學(xué)和毒性等，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試用，加快了水蛭素應(yīng)用于臨床的進(jìn)程。水蛭素的結(jié)構(gòu)天然水蛭素是不含多糖，由65或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，分子量約7，000，富含二羧基氨基酸，無六印、11討和Trp，有三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵位于肽鏈 N-端，對分子構(gòu)型起穩(wěn)定作用；C-端有較多的酸性氨基酸殘基，且有一硫酸化Tyr;肽鏈中部有一個(gè)由I^0-Lys47-Pr0組成的特殊結(jié)構(gòu)，其在水蛭素與凝血酶相互作用中起一定的作用。水蛭素在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定，室溫下可穩(wěn)定保存6個(gè)月以上，80°C下15分鐘不被破壞。PH升高(或下降)則穩(wěn)定性下降。在0. lmol/L NaOH或0. lmol/L HCl可穩(wěn)定存在15 分鐘。胰蛋白酶和α-糜蛋白酶不破壞水蛭素的活性。番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶可使之失活。水蛭素溶于水和0.9% NaCl溶液。不溶于乙醇、丙酮。水蛭素抗凝原理為(國外醫(yī)學(xué)輸血及血液分冊1993年第16卷第6期記載中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所，郭娟綜述王荷碧審校“重組水蛭素的研究進(jìn)展”)重組水蛭素與 α_凝血酶形成穩(wěn)定特異的復(fù)合物，此時(shí)凝血酶全部蛋白酶水解功能被封閉，故水蛭素不僅能防止纖維蛋白原的凝固作用，而且能阻斷凝血酶催化的止血反應(yīng)，諸如因子V、 及XIII 的激活，凝血酶誘發(fā)的血小板反應(yīng)，防止了凝血酶原活化的正反饋而導(dǎo)致的凝血酶生成。同時(shí)水蛭素不干擾凝血因子的生物合成，對抗凝血酶III (AT- III)亦無影響。依水蛭素活性在血中的濃度高低比例，能在需要的時(shí)間內(nèi)完全抑制血液凝固作用。凝固作用的變化如凝血酶時(shí)間(TT)、部分凝血活酶時(shí)間(APTT)及凝血酶原時(shí)間(PT)，隨水蛭素不同濃度而變化。凝血酶是一種多樣細(xì)胞活性的促效劑，與水蛭素復(fù)合后，它便喪失了對這些細(xì)胞的非止血效應(yīng)。水蛭素與凝血酶的特異性結(jié)合分二個(gè)階段。首先，水蛭素C末端的酸性氨基酸與凝血酶的堿性部位結(jié)合，封閉凝血酶的底物識別位點(diǎn)。其次，該結(jié)合使凝血酶構(gòu)型發(fā)生輕微變化，使水蛭素N端與凝血酶的活性中心結(jié)合，從而抑制凝血酶的催化活性。水蛭素抗凝原理是抑制凝血四項(xiàng)的產(chǎn)生，也就是抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白從而達(dá)到抗凝效果，但在抗凝過程中不破壞凝血因子(水蛭素為抑制凝血因子的形成)如形成一定條件下水蛭素可以被分解，那么血液中的凝血因子被完整釋放后不會影響檢測凝血四項(xiàng)的結(jié)果。凝血四項(xiàng)屬于檢驗(yàn)科臨檢檢查項(xiàng)目之一，歸屬于血栓性疾病檢查。為手術(shù)前必查項(xiàng)目、血栓前檢查項(xiàng)目及監(jiān)控臨床口服抗凝藥物患者。現(xiàn)有檢測凝血四項(xiàng)的方法使用的抗凝劑抗凝原理由于枸櫞酸鈉的抗凝效果較弱，故如需作用于阻止血液凝固，需較大劑量。 為采血管內(nèi)加入了定量液態(tài)的枸櫞酸鈉抗凝劑緩沖液?？鼓齽┡c額定采血量按1:9的比例加入，用于凝血機(jī)制項(xiàng)目的檢查(如PT、APTT)。其原理為抗凝劑與血液中的鈣結(jié)合，形成可溶性鈣螯合物而使血液不凝固。因此凝血四項(xiàng)測定過程中必須加入適量的鈣使血液恢復(fù)凝固過程，抗凝時(shí)去鈣和實(shí)驗(yàn)時(shí)的復(fù)鈣決定了抗凝比例實(shí)質(zhì)是抗凝劑與血漿的比例，而不是與全血的比例。推薦的血凝測定要求的抗凝劑濃度是3.洲或3. 8%，相當(dāng)于0. 109或 0. 129mol/L0對于血液凝固實(shí)驗(yàn)來講，如果血液比例過低，APTT時(shí)間會延長，凝血酶原時(shí)間 (PT)結(jié)果亦會顯著改變，因此抗凝劑與額定采血量的比例是否準(zhǔn)確，是決定該類產(chǎn)品品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。而上述對檢測凝血四項(xiàng)傳統(tǒng)方法具有缺陷，其表現(xiàn)為1、抗凝劑對結(jié)果的影響 實(shí)驗(yàn)證明同一個(gè)患者如果抗凝劑量加入不合適，凝血酶原時(shí)間(PT)、分別為11. 7秒和18. 7 秒，這對臨床診斷和治療是有很大影響的，主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況，其中INR常用于監(jiān)測口服抗凝劑。延長見于先天性凝血因子II ννπχ缺乏及纖維蛋白原缺乏，后天凝血因子缺乏主要見于維生素K缺乏、嚴(yán)重的肝臟疾病、纖溶亢進(jìn)、DIC、口服抗凝劑等；縮短見于血液高凝狀態(tài)和血栓性疾病等。2、采用傳統(tǒng)方法的實(shí)驗(yàn)手冊上載明，做凝血實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中，抗凝劑的比例是1份量抗凝劑加9份量的血液，但這只是表面現(xiàn)象，實(shí)際內(nèi)涵是1份量抗凝劑作用于9份血細(xì)胞比積正常標(biāo)本內(nèi)的血漿而言。換言之，比積血液經(jīng)抗凝處理后，通過離心可以把血液分為兩大部分，血漿和血細(xì)胞。如果將血液放在一個(gè)特殊的試管中(溫氏管)按規(guī)定的時(shí)間和速度進(jìn)行離心，最終使得紅細(xì)胞完全壓實(shí)在試管的底端，紅細(xì)胞之間互相接觸密切，盡可能排除所有血漿，此時(shí)血漿會全部被擠出到血細(xì)胞的上面，這時(shí)紅細(xì)胞所占全血的百分比就是我們所要得到的紅細(xì)胞壓積，即壓實(shí)的紅細(xì)胞所占的體積數(shù)(或百分比)， 也叫紅細(xì)胞比積或紅細(xì)胞比容。測定紅細(xì)胞壓積還可用毛細(xì)管法和血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法測定。 紅細(xì)胞壓積通常縮寫為HCT或Ht，測定單位現(xiàn)在多用每升血液中紅細(xì)胞占有多少升來表達(dá) (L/L)。紅細(xì)胞壓積的測定有助于了解紅細(xì)胞的增多與減少，當(dāng)各種原因所致的紅細(xì)胞絕對值增高時(shí)，紅細(xì)胞壓積也會有相應(yīng)的增加。血液濃縮時(shí)紅細(xì)胞壓積可達(dá)50%以上，臨床上常用于了解脫水病人的血液濃縮程度，作為計(jì)算補(bǔ)液量的參考。紅細(xì)胞壓積降低與各種貧血有關(guān)，因紅細(xì)胞體積大小的不同，紅細(xì)胞壓積的改變并不與紅細(xì)胞數(shù)量平行，需同時(shí)測定紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，并用于計(jì)算紅細(xì)胞各項(xiàng)平均值才有參考價(jià)值。決定了血漿量，而血漿量決定抗凝劑的用量。研究表明，同一個(gè)人如果比積為46%(正常)、10% (貧血)、80%(紅細(xì)胞增多)，同樣都是一種抗凝劑1:9量抗凝，活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的結(jié)果分別為 33秒、M秒、60秒，主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，常用于監(jiān)測肝素用量。增高見于血漿因子通、因子IX和因子XI水平減低如血友病A、血友病B及因子XI缺乏癥；降低見于高凝狀態(tài)如促凝物質(zhì)進(jìn)入血液及凝血因子的活性增高等情況?？梢娭辉诳鼓齽?yīng)用的小問題上就會給臨床造成檢測結(jié)果的偏差，會影響醫(yī)生對病情的判斷，造成誤診，遇到這種情況必須進(jìn)行校正抗凝劑用量。通過調(diào)整抗凝劑用量來達(dá)到控制結(jié)果準(zhǔn)確性的目的詳見

圖1。3、 臨床檢驗(yàn)要求當(dāng)做血液凝血四項(xiàng)時(shí)患者紅細(xì)胞比容(Hct)小于0. 2或大于0. 5時(shí)，抗凝劑的用量應(yīng)做適當(dāng)調(diào)整。它所指的是傳統(tǒng)109mmol/L枸櫞酸鈉溶液做抗凝劑0. ^il,采血1. 8ml, 調(diào)整抗凝劑的量ml= (100-Hct) X血液ml X0. 00185。這樣患者必須抽1份血常規(guī)(EDTA抗凝劑)測定值紅細(xì)胞比容小于0. 2或大于0. 5時(shí)，再計(jì)算出此患者做凝血四項(xiàng)所需要的枸櫞酸鈉抗凝劑的量后，再抽1份血檢測。這樣不但給患者造成二次抽血的痛苦，也給繁忙的非?？漆t(yī)院帶來困難，對急診搶救是不利的，同時(shí)也證明傳統(tǒng)方法用枸櫞酸鈉做抗凝劑，具有抗凝力弱、抗凝劑體積大等重要缺陷。叢教授闡述(叢玉隆，解放軍總醫(yī)院主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，我國著名的實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)專家《定向點(diǎn)金-臨床實(shí)驗(yàn)室》2008/4號刊載的文章名為IS015189與分析前質(zhì)量管理的文章節(jié)選)臨床通常使用以下的兩種方法確定在收集高比積血標(biāo)本時(shí)所用枸櫞酸鹽的體積
⑴使用公式計(jì)算用量抗凝劑用量=0.00185X血量(ml) X (100-病人紅細(xì)胞壓積)； ⑵根據(jù)Hct變化，抗凝劑用量按下圖2所示加入。這些是特別值得注意的，貧血病人以及一切低HCT病人的標(biāo)本，如果按平常的1 :9 比例抗凝，實(shí)際上血漿和抗凝劑和血漿的比例縮小了，抗凝劑受到了稀釋，得出的結(jié)果是不可靠的，在檢測前需進(jìn)行抗凝劑校正。另外由于水蛭素所具有的獨(dú)特的抗凝原理所限制，其與凝血酶的特異性結(jié)合，抑制纖維蛋白原凝固，還會阻斷凝血酶催化的止血反應(yīng)?；谝陨蠁栴}，水蛭素?zé)o法用于檢測凝血四項(xiàng)，血液中添加單獨(dú)水蛭素抗凝劑后檢測的數(shù)據(jù)全部為0。
英文名稱中文名稱結(jié)果參考范圍單位PT凝血酶原時(shí)間10670-120%PT-INRPT-INR00. 8-1. 5PT-sec血漿凝血酶原時(shí)間011-14.5secAPTT活化部分凝血活酶時(shí)間028-44secFIB血漿纖維蛋白原02-4g/1TT血漿凝血酶時(shí)間014-21sec具體數(shù)據(jù)如上所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次公開了水蛭素在特定條件下失活后檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用。其中制備失活水蛭素的失活劑是番木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或酶蛋白酶；水蛭素與番木瓜蛋白酶的重量份數(shù)比為1:1-1 5 ；水蛭素與枯草桿菌蛋白酶的重量份數(shù)比為為1:1-1 :5，水蛭素與酶蛋白酶的重量份數(shù)比為1:1-1 :5。本發(fā)明的具體方案如下首先，采用水蛭素失活主要的方法有(1) 二硫鍵被氧化(2)水蛭素C-端被破壞(3) 80°C高溫滅活等等方法，本發(fā)明所采用的失活水蛭素可以是上述(1)- (3)任何一種方法制備失活水蛭素。優(yōu)選本發(fā)明所使用的水蛭素的失活劑是“番木瓜蛋白酶”“枯草桿菌蛋白酶”或“酶蛋白酶”。其次，水蛭素與番木瓜蛋白酶的重量份數(shù)比可以為1:1，1:2，1:3，1:4，1:5等；水蛭素與枯草桿菌蛋白酶的重量份數(shù)比可以為1:1，1:2，1:3，1:4，1:5等；水蛭素與酶蛋白酶的重量份數(shù)比可以為1:1，1:2，1:3，1:4，1:5等。根據(jù)添加抗凝劑的種類、比例不同水蛭素加入失活劑后，需靜置1-5分鐘，使水蛭素與失活劑發(fā)生反應(yīng)。并用《中國藥典》2010年版中藥部分77-78頁記載一水蛭素的檢測方法，檢測水蛭素按上述比例加入番木瓜蛋白酶、 酶蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶后，是否失活，檢測值為零，即水蛭素失活。最后，水蛭素+失活劑的操作方法為
(1)使用含有水蛭素作為抗凝劑的采血管或者采血針，抽取患者血液5ml (也可根據(jù)臨床實(shí)際需要確定抽血量)，先檢測除凝血四項(xiàng)以外的其他檢測項(xiàng)目例如血常規(guī)、生化檢測、 血糖檢測等等(順序不限，或根據(jù)實(shí)際情況確定先后順序)，最后檢測凝血四項(xiàng)。(2)將檢測凝血四項(xiàng)的設(shè)備就緒，做好相關(guān)輔助工作后，將含有失活劑的溶液迅速倒入水蛭素作為抗凝劑的采血管或集血樣瓶內(nèi)，并在1-5分鐘內(nèi)上機(jī)測試凝血四項(xiàng)結(jié)果 (注如實(shí)際情況無法做到1-5分鐘內(nèi)上機(jī)測試，需加入一定量的抗凝劑以推遲血液凝固)。本發(fā)明中出現(xiàn)的Hct指的是紅細(xì)胞比容是指一定容積全血中紅細(xì)胞所占的百分比。又稱紅細(xì)胞比容(比積/壓積)對抗凝劑用量血漿的影響。APTT 主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，常用于監(jiān)測肝素用量。增高見于血漿因子通、因子IX和因子XI水平減低如血友病A、血友病B及因子XI缺乏癥；降低見于高凝狀態(tài) 如促凝物質(zhì)進(jìn)入血液及凝血因子的活性增高等情況；
PT:主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況，其中INR常用于監(jiān)測口服抗凝劑。延長見于先天性凝血因子ιιννπχ缺乏及纖維蛋白原缺乏，后天凝血因子缺乏主要見于維生素K缺乏、嚴(yán)重的肝臟疾病、纖溶亢進(jìn)、DIC、口服抗凝劑等；縮短見于血液高凝狀態(tài)和血栓性疾病等；
FIB:主要反映纖維蛋白原的含量。增高見于急性心肌梗死減低見于DIC消耗性低凝溶解期、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎、肝硬化；
TT:主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時(shí)間。增高見于DIC纖溶亢進(jìn)期，低(無)纖維蛋白原血癥，異常血紅蛋白血癥，血中纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDh)增高；降低無臨床意義。本發(fā)明公開的失活水蛭素在檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用所具有的積極效果在于 (1)本發(fā)明解決了單獨(dú)使用水蛭素?zé)o法檢測凝血四項(xiàng)的問題。能夠解決傳統(tǒng)抗凝劑枸
櫞酸鈉添加不合適造成的PT時(shí)間的多少，造成誤診，延誤病情，影響治療。(2)本發(fā)明具有杜絕了使用枸櫞酸鈉所帶來的弊病，也減輕了由于使用枸櫞酸鈉與血細(xì)胞比積的比例問題，使得臨床檢驗(yàn)人員無需再進(jìn)行檢測數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)和測量Hct值。 也從根本上解決了由于抗凝劑添加不當(dāng)所引起的誤診、錯(cuò)診，延誤患者的治療時(shí)間，拖延病情，同時(shí)，也避免特殊患者還需要再抽取一次血液來檢測血常規(guī)(EDTA抗凝劑)測定值紅細(xì)胞比容。另外，有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，約有20%的非患病者是由于錯(cuò)誤的診斷，錯(cuò)誤的用藥，被人為的“檢查”出疾病，這種情況也能夠從根本上減少發(fā)生的幾率。同時(shí)解決了單獨(dú)使用水蛭素?zé)o法檢測凝血四項(xiàng)的問題，使得水蛭素作為抗凝劑可以檢測目前已知的全部血液檢測項(xiàng)目，真正做到只抽取患者一管(約5ml)血液，即可作出全部的血液學(xué)臨床檢測。(3)臨床檢測上解決了 1、診斷期將由于抗凝劑本身的不足所帶來的檢測誤差或者錯(cuò)誤所導(dǎo)致的誤診風(fēng)險(xiǎn)降至最低。2、治療期由于能夠快速的、精確的檢測醫(yī)生所需血液的各項(xiàng)指標(biāo)，醫(yī)生能夠準(zhǔn)確判斷患者使用治療藥物的劑量、根據(jù)使用效果增減藥物劑量。3、 對于檢驗(yàn)人員大量減少檢驗(yàn)人員的工作量，檢驗(yàn)人員無需再顧慮枸櫞酸鈉與血細(xì)胞比積的比例問題是否影響檢測數(shù)據(jù)，也無需再反復(fù)驗(yàn)證檢測數(shù)據(jù)是否符合患者的實(shí)際情況，更不需要再次計(jì)算患者的Hct，利用抗凝劑修正公式再次計(jì)算。4、減少患者痛苦和醫(yī)療開支、 減少醫(yī)療垃圾等。(4)采用本發(fā)明的方法對血細(xì)胞比積升高或降低者有更大的檢測意義。比如做PT 檢測Rbc、Hct小于0. 2或大于0. 5時(shí)不與糾正的話，一個(gè)標(biāo)本兩種測定值11. 7s、18. 7s (正常 ll_14、5s)
權(quán)利要求
1.水蛭素在特定條件下失活后檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中制備失活水蛭素的失活劑是番木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或酶蛋白酶；水蛭素與番木瓜蛋白酶的重量份數(shù)比為1:1-1 5 ；水蛭素與枯草桿菌蛋白酶的重量份數(shù)比為1:1-1 5 ；水蛭素與酶蛋白酶的重量份數(shù)比為1:1-1 :5。
全文摘要
本發(fā)明公開了水蛭素在特定條件下失活后檢測凝血四項(xiàng)方面的應(yīng)用，其中制備失活水蛭素的失活劑主要是番木瓜蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶或酶蛋白酶；水蛭素與番木瓜蛋白酶的重量分?jǐn)?shù)比為1:1-1:5；水蛭素與枯草桿菌蛋白酶的重量分?jǐn)?shù)比為為1:1-15；水蛭素與酶蛋白酶的重量分?jǐn)?shù)比為1:1-15。本發(fā)明首次采用水蛭素失活后檢測凝血四項(xiàng)，解決了單獨(dú)使用水蛭素?zé)o法檢測凝血四項(xiàng)的問題。能夠解決傳統(tǒng)抗凝劑枸櫞酸鈉添加不合適造成的PT時(shí)間的多少，造成誤診，延誤病情，影響治療等情況。
文檔編號G01N33/86GK102262161SQ20111023442
公開日2011年11月30日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者劉晨, 劉金雪 申請人:天津市百利康泰生物技術(shù)有限公司