專利名稱：豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，特別是一種豆科黃芪屬多年生草本植物中致毒物檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
豆科黃芪屬多年生草本植物，是一種常見(jiàn)的草本植物，由于這類植物粗蛋白和礦物質(zhì)元素等含量較高，多用作草食動(dòng)物的食物，其中最典型的是沙打旺，其起源于歐亞大陸，包括我國(guó)在內(nèi)的東北亞和北美部分國(guó)家，在我國(guó)，原產(chǎn)于黃河故道，到上個(gè)世紀(jì)末，全國(guó)約有100多萬(wàn)公頃，主要分布在黃土高原地區(qū)。沙打旺營(yíng)養(yǎng)豐富，粗蛋白和礦物質(zhì)元素等含量較高，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的牧草品種。在我國(guó)北方草地畜牧業(yè)占有十分重要的地位。沙打旺，適應(yīng)性強(qiáng)，喜溫耐寒，耐干旱，耐鹽堿，可廣泛地播種于干旱，半干旱的荒漠地區(qū)，在治理水土流失、防風(fēng)固沙和改良土壤等方面亦有重要作用。該牧草具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而， 當(dāng)豆科黃芪屬多年生草本植物染病后，如沙打旺感染黃矮根腐病后，牲畜進(jìn)食后會(huì)出現(xiàn)一系列的中毒反應(yīng)，其主要表現(xiàn)在可使牲畜的肝臟腫大、產(chǎn)生流產(chǎn)等病癥?？梢?jiàn)當(dāng)豆科黃芪屬多年生草本植物染病后其植株中有毒性存在，會(huì)對(duì)采食的牲畜產(chǎn)生毒害或不良作用。這將嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展。雖然業(yè)界對(duì)此已有了解，但豆科黃芪屬多年生草本植物染病后其內(nèi)部有何種有毒物質(zhì)，以及如何檢測(cè)這種有毒物質(zhì)至今尚無(wú)具體的報(bào)道和介紹。因此搞清染病的豆科黃芪屬多年生草本植物中的有毒物質(zhì)，找出一種可以檢測(cè)病株的方法對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展有著積極的意義。但在現(xiàn)有技術(shù)中至今尚為一個(gè)空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可解決現(xiàn)有技術(shù)所未能解決的問(wèn)題，能檢測(cè)出豆科黃芪屬多年生草本植物是否染病并對(duì)采食的動(dòng)物產(chǎn)生病害的方法。本發(fā)明的方法是先將待檢測(cè)植物粉碎后用醇與水的溶液或丙酮進(jìn)行浸取提取， 將所得到的提取液濃縮得到浸膏，再將浸膏用水溶解后用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后檢測(cè)萃取液中化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' -二甲氧基-異黃烷的含量，根據(jù)檢測(cè)得到被檢植物中所含的化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' - 二甲氧基-異黃烷含量的多少確定被檢植物是否屬于染病有毒的病株。本發(fā)明的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，也可以是先將待檢測(cè)植物粉碎后用醇與水的溶液或丙酮進(jìn)行浸取提取，將所得到的提取液濃縮得到浸膏，再將浸膏用水溶解后先將浸膏水溶液用等體積的石油醚萃取，所得的水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后檢測(cè)萃取液中化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' - 二甲氧基-異黃烷的含量，根據(jù)檢測(cè)得到被檢植物中所含的化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' -二甲氧基-異黃烷含量的多少確定被檢植物是否屬于染病有毒的病株。采用這種方法可以克服用乙酸乙酯直接萃取時(shí)植物中的一些雜質(zhì)，例如蠟質(zhì)、小極性的苯的衍生物、色素等，對(duì)檢測(cè)精度的影響。
上述本發(fā)明的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法中可采用氣相色譜法或者紫外分光光度計(jì)法或者高效液相色譜法對(duì)萃取液用進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明優(yōu)選的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法中是采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)時(shí)，待檢測(cè)植物粉碎后用乙醇的水溶液進(jìn)行提取，其中的乙醇水溶液為體積比為60-95%的乙醇水溶液。經(jīng)本發(fā)明相關(guān)的研究表明，豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物質(zhì)是化合物 7,3' - 二羥基-2'，4' -二甲氧基-異黃烷(DDIF)。本發(fā)明相關(guān)的研究表明，未染病的豆科黃芪屬多年生草本植物或多或少也是含有DDIF的，但未染病的豆科黃芪屬多年生草本植物中所含DDIF極少，不會(huì)造成采食的動(dòng)物致病。但當(dāng)豆科黃芪屬多年生草本植物染病后，其內(nèi)部所含的DDIF量會(huì)明顯升高，并足以造成食用的動(dòng)物發(fā)病，甚至中毒。在這一基礎(chǔ)上，本發(fā)明給出以上的對(duì)豆科黃芪屬多年生草本植物中的DDIF檢測(cè)的方法，并給出建議的確定豆科黃芪屬多年生草本植物是否染病有毒的數(shù)值，即當(dāng)被檢植物中的DDIF的含量達(dá)到5%。(質(zhì)量比)以上時(shí)，即可認(rèn)為植物染病，并足以對(duì)所采食的動(dòng)物產(chǎn)生致病作用。關(guān)于這方面的具體內(nèi)容說(shuō)明見(jiàn)后續(xù)的具體實(shí)施方式
內(nèi)容。本發(fā)明可以有效檢測(cè)出豆科黃芪屬多年生草本植物中致毒物-DDIF的含量，同時(shí)提示本發(fā)明可以用于對(duì)其它的草本植物中的DDIF含量進(jìn)行檢測(cè)。


圖1為胚胎細(xì)胞分化圖，其中左圖為正常蟾蜍的胚胎細(xì)胞分裂和早期胚胎發(fā)育圖，右圖為將DDIF稀釋后作用于蟾蜍胚胎細(xì)胞的細(xì)胞圖，其中所用樣本為非洲蟾蜍。圖2為染病的沙打旺植株中萃取液定容至25mL的色譜圖。圖3為正常的沙打旺植株中萃取液定容至2mL的色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解說(shuō)，其中所用的被檢植物為沙打旺。實(shí)施例1 沙打旺病株毒性萃取物的篩選采自甘肅環(huán)縣的沙打旺病株莖部分3公斤，將其全部碾碎后于室溫下用10升90 % 的乙醇水溶液(體積比)冷浸提取三次，合并提取液并通過(guò)減壓蒸餾將其濃縮，晾干后得到總浸膏200克。將浸膏用水溶解后，用等體積的石油醚萃取，所得的水相接著用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，所得的水相再用等體積的正丁醇進(jìn)行萃取，得到四種不同極性萃取物組分石油醚組分、乙酸乙酯組分(35g)、正丁醇組分和水相組分。將以上得到的這四個(gè)組分分別進(jìn)行小鼠飼喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅乙酸乙酯組分在5mg的劑量下可導(dǎo)致小鼠死亡。其他部分沒(méi)有觀察到明顯的毒害小鼠現(xiàn)象。實(shí)施例2 有毒化合物的分離與提純將實(shí)施例1得到的乙酸乙酯萃取物拌以35g硅膠Q00-300目)，自然揮干之后， 用400g硅膠Q00-300目)濕法裝柱進(jìn)行柱層析，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，每200mL 為一流份，得到A G共7個(gè)組分。洗脫的梯度如下A(30:1)，B(15:l)，C(8:l)，W4:l)， E(2:1)，F(xiàn)(1:1)，G(甲醇沖柱)。組份D，經(jīng)TLC檢測(cè)后合并相似組分，得到D1-D9九個(gè)部分， D9部分經(jīng)石油醚-乙酸乙酯體系重結(jié)晶得到化合物，經(jīng)表征證實(shí)這種化合物為7，3 ‘ -二羥基-2'，4' -二甲氧基-異黃烷(DDIF)，其表征如下化合物DDIF的物理和光譜數(shù)據(jù)無(wú)色晶體；熔點(diǎn)145°C ； [a]D20 = -18. 5° (c =0. 5，甲醇)；ESIMS 顯示分子離子峰[M+H]+ 為 m/z = 303 ；1H NMR(400MHz, acetone_d6)， 6. 88 (1H, d, J = 8. 4Hz, H_5)，6· 71 (1H，d, J = 8. 8Hz, H_6 ' ) ,6. 64 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-5' )，6. 37 (1H, dd, J = 8. 4,2. 4Hz, H_6)，6. 30 (1H, d, J = 2. 4Hz, H_8)，4. 17 (1H, dd, J =12. 4，3. 6Hz, H-2a)，3. 91 (1H, d, J = 10. 4Hz, H_2b)，3. 45 (1H, m, H_3)，2. 90 (1H, dd, J =14. 8,3. 6Hz, H-4a) ,2. 78 (1H, dd, J = 16,4. 8Hz, H_2b) ； 13CNMR(1 OOMHz，acetone_d6)， 71. 4 (C-2)，33. 1 (C-3)，32. 4 (C_4)，109. 2 (C_5)，108. 3 (C_6)，156. 3 (C_7)，104. 0 (C_8)， 157. 9(C-9), 114. 6(C-IO),128. 5 (C-l' ),147. 1 (C-2 ' ),140. 7 (C-3' ),148. 7 (C-4 ')， 131. 4(C-5' ), 117. 7(C-6')。實(shí)施例3 :化合物DDIF純品的毒性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例2得到的DDIF純品進(jìn)行小鼠注射實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在100 μ g的劑量下，可以導(dǎo)
致小鼠死亡。將DDIF配置成lOmg/mL的二甲基亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液，并保存在_20°C的冰箱內(nèi)作為供試樣品。將供試樣品稀釋成一系列濃度給非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞給藥，觀察不同濃度的化合物對(duì)胚胎細(xì)胞分裂和早期胚胎發(fā)育的影響。胚胎在室溫條件下培養(yǎng)Mh，用3. 7%甲醛固定成像，記錄胚胎細(xì)胞停止分裂、死亡的個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。通過(guò)胚胎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)化合物 DDIF在1 μ g/mL可以明顯阻止非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞分化，參見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)論DDIF在ΙΟΟμ g的劑量下，可以導(dǎo)致小鼠死亡；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，DDIF在 1 μ g/mL的濃度下，對(duì)非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性，所測(cè)胚胎細(xì)胞均停止分化，死亡。實(shí)施例4 高效液相色譜法檢測(cè)沙打旺病株中化合物DDIF的含量供試樣品的制備分別精密稱取沙打旺病株和正常株莖部分各10g，將其全部碾碎后于室溫下用60-95%的乙醇水溶液冷浸提取三次。合并提取液進(jìn)行減壓濃縮，晾干后得到總浸膏用水溶解，將浸膏水溶液用等體積的石油醚萃取，所得的水相接再用等體積的乙酸乙酯萃取，再分別將病株和正常株的乙酸乙酯萃取物用氯仿/甲醇2 1(體積比)溶解后用葡聚糖凝膠(Sephdex LH-20)過(guò)柱以除去色素，洗脫劑為氯仿/甲醇2 1 (體積比)。將病株和正常株樣品分別溶解于色譜純甲醇中，并分別用容量瓶定容至25mL和2mL， 最后經(jīng)微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，作為供試樣品。將上述供試樣品進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)?. 醋酸水溶液(A)，10%乙腈甲醇溶液(B)，0 10min，54% B ；10 25min，54% 57% B ；25 45min，57% 75% B ；45 50min，75% 85% B ；50 60min，85% 100% B。流速 0. 6;3ml/min，UV 檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm,柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μ L，理論塔板數(shù)按公式N = 16 [VE/ff]2計(jì)算不低于4000，對(duì)照品與周圍的峰的分離度按R = 2^^2)/^+^)]計(jì)算，R大于1.5%，所得色譜圖如圖2、 圖3所示，其中病株樣品用容量瓶定容至25mL，正常株樣品用容量瓶定容至2mL。標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備精密稱取DDIF標(biāo)準(zhǔn)品溶解于色譜純甲醇中，用容量瓶定容至 lmL，最后經(jīng)微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。再將DDIF分別配成0. 02mg/mL， 0. 2mg/mL, 0. 3mg/mL, 0. 5mg/mL, 0. 6mg/mL, 0. 7mg/mL, lmg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相 (儀器及型號(hào)Waters 600-2996)每次分別注射配好的DDIF標(biāo)準(zhǔn)樣品10 μ L，η = 3，按58% B的HPLC條件測(cè)定峰面積的積分值，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量(χ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:y = 2. 20X106x+5236. 44,R2 = 0. 9999 ；線性范圍為 0.01-50 μ g ；將病株和正常株色譜圖中的峰面積代入線性回歸方程即得病株和正常株中DDIF 的含量M 病=11113.89±142.91yg/g(l. 11% )，M 正常=335. 52 士 6. 49 μ g/g(0. 03% )。實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明DDIF為沙打旺病株中含量最大的化合物，并且病株中的含量為正常株中含量的33倍。在進(jìn)行受試植物浸取時(shí)同時(shí)用不同的浸取液體平行處理，即對(duì)相同的植物樣采用 60-95 %的甲醇水溶液冷浸提取和用丙酮浸取，其效果相差無(wú)幾。
權(quán)利要求
1.豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于將待檢測(cè)植物粉碎后用醇與水的溶液或丙酮進(jìn)行浸取提取，將所得到的提取液濃縮得到浸膏，再將浸膏用水溶解后用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后檢測(cè)萃取液中化合物7，3' - 二羥基-2'， 4' -二甲氧基-異黃烷的含量，根據(jù)檢測(cè)得到被檢植物中所含的化合物7，3' -二羥基-2' ,4' -二甲氧基-異黃烷含量的多少確定被檢植物是否屬于染病有毒的病株。
2.權(quán)利要求1所述的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于將萃取液用氣相色譜法或者紫外分光光度計(jì)法或者高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。
3.豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于將待檢測(cè)植物粉碎后用醇與水的溶液或丙酮進(jìn)行浸取提取，將所得到的提取液濃縮得到浸膏，再將浸膏用水溶解后先將浸膏水溶液用等體積的石油醚萃取，所得的水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后檢測(cè)萃取液中化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' - 二甲氧基-異黃烷的含量，根據(jù)檢測(cè)得到被檢植物中所含的化合物7，3' - 二羥基-2' ,4' -二甲氧基-異黃烷含量的多少確定被檢植物是否屬于染病有毒的病株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于將萃取液用氣相色譜法或者紫外分光光度計(jì)法或者高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于所用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的任一豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法，其特征在于待檢測(cè)植物粉碎后用乙醇的水溶液進(jìn)行提取，其中的乙醇水溶液為體積比為60-95%的乙醇水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)豆科黃芪屬多年生草本植物中一種致毒物檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法是先將待檢測(cè)植物粉碎后用醇與水的溶液或丙酮進(jìn)行浸取提取，將所得到的提取液濃縮得到浸膏，再將浸膏用水溶解后用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后檢測(cè)萃取液中化合物7，3′-二羥基-2′，4′-二甲氧基-異黃烷的含量，根據(jù)檢測(cè)得到被檢植物中所含的化合物7，3′-二羥基-2′，4′-二甲氧基-異黃烷含量的多少確定被檢植物是否屬于染病有毒的病株。
文檔編號(hào)G01N1/40GK102353738SQ20111025162
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者南志標(biāo), 李亞, 李彥忠, 陳佳, 陳建軍, 高坤, 魏石磊 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)