專利名稱：黃曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒及其制法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢驗檢疫領域，特別涉及檢測黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮的試劑盒， 另外還涉及試劑盒的制法。
背景技術：
真菌毒素是真菌產生的對人類和動物等有致病影響的一類次生代謝產物。真菌毒素種類繁多，目前已知的就多達200多種，主要包括黃曲霉毒素(AF)，玉米赤霉烯酮(ZEN， 又稱F-2毒素)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，赭曲霉毒素，伏馬菌素(FBI，FB2)等。在這些毒素中，黃曲霉毒素是上世紀六十年代初發(fā)現的，是世界上報道最早并且是迄今研究最為深入的一種真菌毒素，而后幾種毒素則不僅發(fā)現相對較晚，在檢測技術研究方面也相對滯后。真菌毒素廣泛存在于農副產品，食品和動物飼料中。農作物在生長，收割，加工及運輸中都會暴露或接觸到產毒真菌，從而受到侵染，導致農產品和飼料品質降低，嚴重時還會影響到農作物的產量。全世界每年由于霉變污染真菌毒素引起的農產品和工業(yè)原料的損失達數百億美元。誤食被真菌毒素污染的食品后可引起中毒，如胃腸道癥狀惡心，嘔吐，腹脹，腹痛等；肝、腎、神經、血液等系統的損害肝功異常，血尿，蛋白尿，中性粒細胞減少或缺乏等；嚴重者可導致癌癥。食品安全是當今世界一個重要的主題，真菌毒素的研究與食品安全息息相關，已經越來越受到全世界的重視。在真菌毒素的檢測方法方面，各國研究人員取得了很大的成就，但還沒有建立起一個完善的真菌毒素檢測技術體系，因此也還不能保證完全檢出和杜絕被毒素污染的產品進入餐桌或進出口。真菌毒素的檢測方法很多，概括起來有生物鑒定法、物理化學法及免疫分析法等。生物鑒定法檢測結果直觀，但其專一性差，靈敏度低，一般只作為化學分析法的佐證。傳統的用于檢測真菌毒素的物理化學方法有薄層層析法 (TLC)，氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。其中，TLC法比較經濟，對設備和人員要求較低，但其精確度低、操作過程復雜、分析結果的可重復性和再現性差；GC法的變異系數較大；HPLC法的靈敏度和特異性好，但操作煩瑣，儀器設備要求高，檢測成本高，結合使用免疫親和柱，雖可增加使用的方便性，但檢測費用更高，一般只適合于科研機構或確證試驗。新近發(fā)展起來的真菌毒素物理化學檢測方法有近紅外光譜分析法，高效液相聯合電噴質譜法，氣相色譜聯合質譜法和表面等離子體共振法等方法。這些方法具有較高的準確性，靈敏度和特異性，但都需要應用貴重的分析儀器，而且操作復雜；樣品提取凈化步驟、樣品制備和前處理要求較高而使檢測成本增加；測定時間長，單位時間內檢測樣品數量有限并且需要專業(yè)技術人員來完成操作。近年來，免疫檢測技術作為一種新技術已在農業(yè)和生物科學上有了一定的應用， 而且表現出了具有滿足各類檢測要求的無限發(fā)展前景。目前，免疫檢測技術在真菌毒素快速檢測領域的應用主要集中在酶聯免疫吸附測定法(ELISA)等快速分析法方面，已有相應的國家標準和試劑盒，技術專利發(fā)布。ELISA檢測技術是一種較理想的檢測方法，但在重復性，定量性和靈敏度方面還有亟待改進和提高的地方。液相芯片(又稱多功能懸浮點陣儀)檢測技術是20世紀90年代中期美國Luminex 公司開發(fā)出的芯片技術，此技術將流式檢測技術與芯片技術有機地結合在了一起，它既能為后基因組時代科學研究提供強大的技術支持，又能提供高通量的新一代分子診斷技術平臺。液相芯片系統的核心技術是該系統由許多直徑約為5. 6微米的羧基化微球構成。這些微球在制備過程中摻入了兩種不同的紅色熒光素分子，根據這兩種紅色分類熒光素的比例不同，微球被分為100種；然后通過共價方式，將針對不同檢測物的寡核苷酸或蛋白質探針吸附到100種微球上，并在連有探針的微球上結合另一種綠色熒光素報告分子；檢測時，雙色激光將同時對紅色分類熒光和綠色報告熒光進行檢測，以區(qū)分不同的分析反應并確定微球上結合的目的分子數量。液相芯片檢測技術被認為是現階段最佳的檢測技術，其優(yōu)點有1)高通量性可以對一個樣本中的多種不同目的分子同時進行檢測，在35飛0 min內可對96個不同樣本進行檢測；2)在保持高通量檢測的同時，液相芯片技術將固相芯片中的“液相-固相”反應體系改變?yōu)榻咏锵到y內部環(huán)境的完全液相反應體系，有利于保持蛋白質的天然構象，從而更有利于探針和被檢測物的反應；3)靈活性大不僅適用于各種蛋白質分析，也適用于核酸分析，同時還可根據需要調節(jié)每次檢測所需要的微球數量、調整檢測體系設計；4)信噪比好，敏感性高每個微球上都以共價結合的方式包被了許多抗原、抗體或核酸分子，因參與反應的分子多，產生的信號就強，加上使用熒光檢測，所以敏感性大大高于現有的任何檢測方法，只需要微量的檢測樣品即可進行檢測；5)重復性好一方面液相芯片反應發(fā)生在均相液體環(huán)境中，穩(wěn)定性較好，另一方面每個指標所在的反應體系中有1000-5000個相同的微球，檢測時，抽取其中的100-500個微球進行讀數，最終的數據是取其平均值，因此使誤差減小到了最小；6)檢測速度快液相芯片反應在懸浮的液相中進行，而反應后通常不需要清洗就可以直接讀數，因此檢測時間較短，所用時間從幾小時縮短到了十幾分鐘。液相芯片具有廣闊的應用領域，蛋白質定量研究、蛋白質功能分析研究和蛋白質表達譜分析等均可應用。目前該技術的主要應用有1)細胞因子的檢測液相芯片技術可自行選擇所需要檢測的細胞因子/趨化因子的種類和數目，在短時間內對微量樣本中的多種待測物進行檢測；2)免疫分析液相芯片利用50 μ L血清、血漿或組織培養(yǎng)物上清樣本， 就可以對人、大鼠、小鼠的蛋白質進行分析，4小時即可完成；3)單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測液相芯片檢測技術檢測線粒體DNA的SNP，得到的結果與傳統方法的一致，與傳統方法比較，該技術操作簡單，快速，重復性好；4)免疫球蛋白分型液相芯片技術可在1小時內得到免疫球蛋白分型結果；5)疾病的診斷。液相芯片技術集“高通量、靈敏、快速和準確”于一體，但在抗體對的匹配，交聯條件的最優(yōu)化，多種反應混合交叉反應的避免和數據處理等方面還存在不足。目前液相芯片檢測技術在真菌毒素檢測方面未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，而且可以同時檢測兩種毒素，檢測靈敏度高。本發(fā)明的另一目的是提供試劑盒的制法，方法簡單，易于操作實施。
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本發(fā)明為實現上述目的所采用的技術方案是一種黃曲霉毒素Bl、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，試劑盒內分別裝有緩沖液、黃曲霉毒素Bl-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶聯微球、生物素標記AFBl多克隆抗體和/或ZEN單克隆抗體、不同濃度倍比稀釋 AFBl標準品和/或不同濃度倍比稀釋^N標準品。所述緩沖液可以選用0.IM PBS, pH 7. 4 或 50 mM HEPES, pH 7. 4 或 20 mM MOPS, pH 7. 2 或 50 mM MES, pH 6. 5。所述微球可以選用Luminex 1_100號羧基化微球。所述AFBl多抗臨界飽和濃度為0-6. Ong/ μ L ；ZEN單抗臨界飽和濃度為 0-2. 0μ g/mL。本發(fā)明一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片二重檢測試劑盒的制法
第一步微球偶聯偶聯操作參照Luminex偶聯操作說明書進行，取觀號微球和36號微球各ΙΟΟμ ，分別偶聯AFBl-BSA和ZEN-BSA各IOOPg ；
偶聯質控取28號和36號微球各ΙΟμ ，分別偶聯生物素標記兔抗羊IgG各10μβ ； A 計算微球得率取上述懸浮微球，4PL /管，用微球保存液稀釋至125PL，采用血球計數板在光學顯微鏡下進行微球計數；每個離心管取3份樣品進行計數，并取其平均值，用該平均值根據計算公式(1)和(2)計算偶聯微球得率，偶聯微球得率符合Luminex操作要求； 偶聯微球數量(個)=(平均值/4) XlO4X (125/4) Χ0. 1···公式(1) 偶聯微球得率=[偶聯微球數量/ (6. 25Χ105)]Χ100%……··公式(2) B 檢測偶聯微球質量包括空白質控、陰性質控、偶聯質控檢測， 空白質控取原始觀號和36號微球各10μ ，分別加入到1. 5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入微球封閉液，25μ 7管，混勻，37°C避光孵育30min ；
陰性質控取偶聯AFBl-BSA的28號微球以及^N-BSA偶聯36號微球各10μ ，分別加入到1. 5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入4gg/mL SAPE, 25μ /管，混勻，37 °C避光孵育30min ；
偶聯質控取偶聯生物素標記兔抗羊IgG的28號和36號微球各10μ ， 分別加入到1.5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入4Pg/mL SAPE， 25μ /管，混勻，37°C避光孵育30min ；分別取75μ1上述30min孵育產物，加入液相芯片系統中進行測試；
判斷標準液相芯片偶聯實驗結果應同時滿足以下三個條件1)空白質控MFI低于50 ； 2)陰性質控MFI低于100 ；3)偶聯質控MFI要求高于1000，并遠大于Cutoff值，偶聯微球質量符合質量判斷標準，備用； 第二步標記抗體生物素
嚴格按照Pierce生物素標記試劑盒(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)操作說明書進行，質量控制要求， A500H\A ^ 0. 9-1. 3 ； A500H\A\B ^ 2. 0-3. 0 ；
抗體生物素標記符合EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit質量標準，備用； 第三步確定抗體臨界飽和濃度
在1. 5mL的離心管中按表3依次加入36#100偶聯微球、28#100偶聯微球、生物素標記ZEN單克隆抗體、生物素標記AFBl多克隆抗體，最后用PBS補足體積至ΙΟΟμ ；每個反應體系重復配制3個；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4Pg/mL SA-PE ；向每個離心管里加25μ ^gML SA-PE ；混勻，37°C避光孵育30min ；取上述反應液，75μ1/反應體系，加入液相芯片中測試；用EXCEL軟件對實驗結果求平均值，并將抗體濃度和其對應的熒光信號值繪制散點圖，根據散點圖呈現趨勢，選取線性關系較好的點進行直線擬合，求其R2，最R2對應的抗體濃度即為臨界飽和濃度。 本發(fā)明AFBl和ZEN液相芯片多重定量檢測方法，包括建立標準曲線和樣品添加回收試驗
(1)標準曲線的建立
在1. 5ml的離心管中按表1依次加入36#100微球、28#100微球、AFBl標準溶液和ZEN 標準溶液、生物素標記AFBl多克隆抗體、生物素標記ZEN單克隆抗體，最后用PBS補足體積至IOOPL ；每個反應體系重復配制3個；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4gg/mL SA-PE ；向離心管中加入4Pg/mL SA-PE，25PL/管；混勻，37°C避光孵育30min ； 取上述反應液，75μ1/反應體系，加入液相芯片中測試；
表1.標準曲線反應體系
權利要求
1.一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是試劑盒內分別裝有緩沖液、黃曲霉毒素Bl-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶聯微球、生物素標記AFBl多克隆抗體和/或ZEN單克隆抗體、不同濃度倍比稀釋AFBl標準品和/或不同濃度倍比稀釋 ZEN標準品。
2.根據權利要求1所述的一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是所述緩沖液選用0. IM PBS, pH 7. 4 或 50 mM HEPES, pH 7. 4 或 20 mM MOPS, pH 7. 2 或 50 mM MES, pH 6. 5。
3.根據權利要求1所述的一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是所述微球選用=Luminex 1-100號羧基化微球。
4.根據權利要求1一 3任一所述的一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是緩沖液中懸浮有分別偶聯黃曲霉毒素Bl-BSA和玉米赤霉烯酮-BSA的微球，黃曲霉毒素Bl-BSA多抗臨界飽和濃度為0-6. Ong/ μ L ；玉米赤霉烯酮-BSA單抗臨界飽和濃度為0-2. 0μ g/mL。
5.一種黃曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片二重檢測試劑盒的制法第一步微球偶聯偶聯操作參照Luminex偶聯操作說明書進行，取觀號微球和36號微球各ΙΟΟμ ，分別偶聯AFBl-BSA和ZEN-BSA各IOOPg ；偶聯質控取28號和36號微球各ΙΟμ ，分別偶聯生物素標記兔抗羊IgG各10μβ ； A 計算微球得率取上述懸浮微球，4PL /管，用微球保存液稀釋至125PL，采用血球計數板在光學顯微鏡下進行微球計數；每個離心管取3份樣品進行計數，并取其平均值，用該平均值根據計算公式(1)和(2)計算偶聯微球得率，偶聯微球得率符合Luminex操作要求； 偶聯微球數量(個)=(平均值/4) XlO4X (125/4) Χ0. 1···公式(1) 偶聯微球得率=[偶聯微球數量/ (6. 25Χ105)]Χ100%……··公式(2) B 檢測偶聯微球質量包括空白質控、陰性質控、偶聯質控檢測， 空白質控取原始觀號和36號微球各10μ ，分別加入到1. 5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入微球封閉液，25μ 7管，混勻，37°C避光孵育30min ；陰性質控取偶聯AFBl-BSA的28號微球以及^N-BSA偶聯36號微球各10μ ，分別加入到1. 5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入4gg/mL SAPE, 25μ /管，混勻，37 °C避光孵育30min ；偶聯質控取偶聯生物素標記兔抗羊IgG的28號和36號微球各10μ ， 分別加入到1.5 mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μ ，分別加入4Pg/mL SAPE， 25μ /管，混勻，37°C避光孵育30min ；分別取75μ1上述30min孵育產物，加入液相芯片系統中進行測試；判斷標準液相芯片偶聯實驗結果應同時滿足以下三個條件1)空白質控MFI低于50 ； 2)陰性質控MFI低于100 ；3)偶聯質控MFI要求高于1000，并遠大于Cutoff值，偶聯微球質量符合質量判斷標準，備用； 第二步標記抗體生物素嚴格按照Pierce生物素標記試劑盒(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)操作說明書進行，質量控制要求， A500H\A ^ 0. 9-1. 3 ；A500H\A\B ^ 2. 0-3. 0 ；抗體生物素標記符合EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit質量標準，備用；第三步確定抗體臨界飽和濃度在1. 5mL的離心管中按表3依次加入36#100偶聯微球、28#100偶聯微球、生物素標記 ZEN單克隆抗體、生物素標記AFBl多克隆抗體，最后用PBS補足體積至ΙΟΟμ ；每個反應體系重復配制3個；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4Pg/mL SA-PE ；向每個離心管里加25μ ^gML SA-PE ；混勻，37°C避光孵育30min ；取上述反應液，75μ1/反應體系，加入液相芯片中測試；用EXCEL軟件對實驗結果求平均值，并將抗體濃度和其對應的熒光信號值繪制散點圖，根據散點圖呈現趨勢，選取線性關系較好的點進行直線擬合，求其R2，最R2對應的抗體濃度即為臨界飽和濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢驗檢疫領域。一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，試劑盒內分別裝有緩沖液、黃曲霉毒素B1-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶聯微球、生物素標記AFB1多克隆抗體和/或ZEN單克隆抗體、不同濃度倍比稀釋AFB1標準品和/或不同濃度倍比稀釋ZEN標準品。本發(fā)明試劑盒采用競爭法原理和液相芯片技術平臺，不僅能同時檢測兩種毒素，而且大大提高了檢測靈敏度。本試劑盒特點主要有以下幾點樣品提取操作簡單，回收率(>75%)；高靈敏度(0.03ng/mL)；黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片二重檢測；適用于大批量樣品的高通量檢測。
文檔編號G01N33/532GK102401832SQ201110253830
公開日2012年4月4日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權日2011年8月31日
發(fā)明者劉淑艷, 宋慧君, 蔣丹, 馬惠蕊 申請人:劉淑艷, 宋慧君, 蔣丹, 馬惠蕊