專利名稱：促甲狀腺激素(tsh)定量測定試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定人血清中促甲狀腺激素(TSH)含量的試劑盒及其測試方法。
背景技術(shù)：
人促甲狀腺激素(TSH)是由腺垂體嗜堿細胞中的S-細胞分泌的激素。它是一種糖蛋白，分子量為觀，000，能促進甲狀腺激素的制造，還能促進已制造好的甲狀腺激素釋放入血，對甲狀腺本身的生長和新陳代謝也起著重要作用。促甲狀腺激素(TSH)的分泌受血清中T3和T4濃度的負反饋調(diào)節(jié)。由于過量的甲狀腺激素是TSH分泌最重要的生理性抑制因子，因此臨床上常常把TSH當作甲亢最重要的實驗室診斷指標之一。一般認為血液中TSH 濃度降低強烈提示甲狀腺功能發(fā)生亢進。測定血清中TSH的含量，是診斷甲狀腺功能和研究下丘腦-垂體-甲狀腺軸的重要指標之一。在甲狀腺功能評估中，可鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性(垂體性或下丘腦性)甲狀腺功能低下癥，并可作為對甲低癥療效觀察的指標。從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定TSH的方法主要有放免法、ELISA法、化學發(fā)光法等。過去以放免為代表的促甲狀腺激素(TSH)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)和化學發(fā)光技術(shù)?；瘜W發(fā)光技術(shù)興起于上個世紀80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發(fā)展。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相(ELISA板反應(yīng)孔)表面進行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng) ELISA相比具有靈敏度高，檢測用時少的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種促甲狀腺激素(TSH)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進行TSH檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結(jié)果的時間和更簡便的操作方式。本發(fā)明提供了一種人促甲狀腺激素(TSH)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有 TSH磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強劑，稀釋液，校準品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。所述的磁分離試劑含有標記有抗TSH單克隆抗體的磁性微球。所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標記的抗TSH單克隆抗體。所述的反應(yīng)增強劑是含有Tris的緩沖液。所述稀釋液是含有BSA溶液。
所述的校準品及質(zhì)控品是含有一定量的TSH抗原的BSA蛋白溶液。所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的緩沖液。所述的底物溶液為酶促化學發(fā)光底物溶液。本發(fā)明促甲狀腺激素(TSH)的定量測定試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將ftOclin-300量取0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；3、調(diào)節(jié)PH計測量其PH值，調(diào)PH，控制PH在7. 95-8. 05之間；4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2_8°C冷庫貯存。二、磁分離試劑的制備過程1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗TSH單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已經(jīng)標記的磁珠，混勻30秒，上架，
去上清，重復(fù)操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的TSH磁分離試劑； 磁珠保存液配方為0. 1% BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。第二步酶反應(yīng)物制備過程一、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；2、調(diào) PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范圍內(nèi)；3、稱取BSA 3g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾即得。二、堿性磷酸酶ALP與抗TSH單克隆抗體的偶聯(lián)
1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮
至1毫升；2、向步驟1獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗TSH單克隆抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時，再加入0. Iml的％ig/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小時；4、將上述液裝入透析袋中，對0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然后 3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖鹽水透析5個小時去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶(ALP)與TSH單克隆抗體的偶聯(lián)物， 最后將收集到的堿性磷酸酶(ALP)與TSH單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述酶反應(yīng)物稀釋液以 1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。第三步反應(yīng)增強劑配制步驟，配制IL 1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將ftx)clin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解調(diào)PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak33 0. 9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾
器過濾ο第四步稀釋液配制步驟，配制IL 1、稱取 NaC19. Og 和 BSA 60g 于 IL 的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 5ml加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾，貼好標簽于2_8°C冷庫貯存， 有效期為12個月。第五步校準品和質(zhì)控品的配制校準品濃度分別為0. 15,0. 5,1. 5、5、50μ IU/ml ；質(zhì)控品濃度分別為0. 5,5 μ IU/ ml ο第六步清洗濃縮液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；3、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；5、調(diào)PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um濾器過濾即得。第七步底物溶液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。本發(fā)明工作原理本品為夾心法化學發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法。在標本、校準品和質(zhì)控品中加入定量的酶標TSH單抗、結(jié)合著磁性微粒的 TSH單克隆抗體及穩(wěn)定增強劑。37°C孵育后，磁性微粒上結(jié)合的TSH單克隆抗體與酶標單克隆抗體分別與TSH分子的不同表位結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)。在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子， 形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強度，根據(jù)標準曲線即可算出樣品中的TSH 含量。在檢測范圍內(nèi)，發(fā)光強度與樣本中的TSH濃度成正比。本發(fā)明的主要創(chuàng)新之處在于1、本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)。2、本發(fā)明公開了一種新的專用穩(wěn)定增強劑以及清洗液濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠，實驗數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時，并且大大降低了產(chǎn)品成本；3、試劑盒中的磁分離試劑，酶反應(yīng)物，穩(wěn)定增強劑，校準品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
具體實施例方式實施例1、一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程配方見表1，以配制IL為例1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；然后在IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
3、調(diào)節(jié)PH計測量其PH值；用HCl或NaOH調(diào)PH，測量其PH在7. 95-8. 05之間即
符合要求；4、稱取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7. 95-8. 05之間即符合要求，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2-8°C冷庫貯存，磁珠緩沖液有效期為12個月；磁珠緩沖液表權(quán)利要求
1.一種促甲狀腺激素TSH的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含TSH磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強劑，稀釋液，TSH校準品、TSH質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的TSH磁分離試劑含有標記有抗TSH 單克隆抗體的磁性微球；所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標記的抗TSH單克隆抗體；所述的反應(yīng)增強劑是含有Tris的緩沖液；所述稀釋液是含有BSA的溶液；所述的校準品及質(zhì)控品是含有一定量的TSH抗原的BSA溶液；所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的緩沖液；所述的底物溶液為酶促化學發(fā)光底物溶液。
3.如權(quán)利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得一、磁分離試劑的制備過程一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL·1、稱取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；·2、用移液器將I^roclin-SOO量取0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述 IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；·3、調(diào)節(jié)PH,控制PH在7.95-8. 05之間；·4、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；·5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、磁分離試劑的制備過程·1、將1.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗TSH單克隆抗體溶于 PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；·2、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；·3、將步驟2的溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下離心 30min 濃縮至 0. 5ml ；·4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時；·5、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘，然后加入 1. 5ml PH 7.2 0. lmol/L PB 清洗已經(jīng)標記的磁珠，混勻30秒；·6、用100ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入玻璃瓶；·7、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得權(quán)利要求 1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；二、酶反應(yīng)物的制備過程一)、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL ·1、取 Tris 6.06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g、Proclin_300 0. 2ml 和 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；`2、調(diào)PH,控制PH在7.35-7. 45范圍內(nèi);`3、稱取BSA3g倒入上述燒杯中；`4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得； 二)、堿性磷酸酶ALP與抗TSH單克隆抗體的偶聯(lián)`1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；`2、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；`3、向步驟2獲得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗TSH單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，置 4°C下2小時；`4、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；`5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時，然后3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4的 PBS 中；`6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個小時去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶ALP與抗TSH單克隆抗體的偶聯(lián)物；將收集到的堿性磷酸酶ALP與抗TSH單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述步驟一)獲得的酶反應(yīng)物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。三、反應(yīng)增強劑的制備過程，配制IL`1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；`2、取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)PH在7.35-7. 45之間；`3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾即得；四、稀釋液的制備過程，配制IL:`1、稱取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；`2、取0.5ml Proclin-300加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；`3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；五、TSH校準品和TSH質(zhì)控品的配制TSH校準品中TSH抗原的濃度分別為0. 15,0. 5,1. 5、5、50μ IU/ml ；TSH質(zhì)控品中TSH抗原的濃度分別為0. 5,5 μ IU/ml ；六、清洗液濃縮液的制備過程，配制IL`1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；`2、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL器中；`3、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
4、取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；5、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得； 七、底物溶液的制備過程，配制IL 1、取TRIS 2. 35g,NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；2、取600ml純化水于IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)PH在7.95-8. 05之間；3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。4、如權(quán)利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下1)、加15μ 1 TSH校準品、TSH質(zhì)控品、待測標本至對應(yīng)試管底部；2)、加60μ 1酶反應(yīng)物至每一試管中；3)、加60μ 1反應(yīng)增強劑至每一試管中；4)、加30μ 1磁分離試劑至每一試管中；5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；6)、然后放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液；7)、清洗液濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200μ 1稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發(fā)光檢測儀檢測。
5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述待測標本為高值HOOK樣本時，根據(jù)需要使用稀釋液對標本進行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促甲狀腺激素TSH的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含TSH磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強劑，稀釋液，TSH校準品、TSH質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)，并且大大降低了產(chǎn)品成本。
文檔編號G01N33/74GK102426249SQ201110257510
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:內(nèi)蒙古科慧生物科技有限責任公司