專利名稱：基于場效應(yīng)晶體管的病毒性疾病診斷裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用場效應(yīng)集晶體管快速診斷人或動物病毒性傳染病的裝置和檢測方法。
背景技術(shù)：
禽流感病毒、SARS病毒等具有極強(qiáng)傳染能力的病毒性疾病在全球的大范圍蔓延極大地威脅了人類和動物的生命健康。如禽流感(Avian influenza, Al)是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類傳染病，被國際獸醫(yī)局和世界衛(wèi)生組織(WHO)列為A類烈性傳染病。禽流感病毒呈世界性分布，幾乎所有的野生及家養(yǎng)禽類都可感染，人們認(rèn)為禽是流感病毒基因天然的和巨大的貯存庫，是A型流感病毒新亞型起源的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。不同毒株毒力有很大差別，無致病力及低致病力的禽流感病毒在世界廣泛存在和流行，其中有一部分高致病力的病毒如H5W型可引起多起瘟疫，威脅著人類的健康。禽流感等傳染性病毒引起的疾病的快速準(zhǔn)確診斷具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，所以開發(fā)一種能夠?qū)崟r準(zhǔn)確地檢測人類或動物是否被病毒感染且易于集成化、自動化的檢測裝置和方法顯得尤為重要。所以我們發(fā)明設(shè)計了一種集成了場效應(yīng)晶體管生物芯片和針對病毒的高特異性抗體的病毒檢測儀，可以用來檢測人或者動物是否被病毒感染及感染的程度。對于由病毒引起的傳染性疾病，一般生物醫(yī)學(xué)的檢測方法是病毒分離法、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測方法。其中，病毒分離法需要做雞胚實(shí)驗(yàn)，將疑似病人或動物的血液注射入雞胚，培養(yǎng)3至5天，觀察雞胚胎是否死亡。此方法診斷速度慢，不適合快速、靈敏地對大規(guī)模流行性疾病進(jìn)行現(xiàn)場檢測。免疫學(xué)病毒檢測法一般檢測的對象是患者體內(nèi)的病毒或者抗體的含量，由于病毒在人或動物的血液、體液中的含量極其微少，直接檢測出病毒顆粒非常困難，一般需要等待人或動物在體內(nèi)產(chǎn)生對病毒的抗體，通過檢測相應(yīng)的抗體來實(shí)現(xiàn)疾病的檢測。同樣，不能實(shí)現(xiàn)早期、直接檢測。對于分子生物學(xué)的檢測法一般是需要提取病毒RNA，做反轉(zhuǎn)錄-PCR，才能檢測到病毒的含量。以上這些傳統(tǒng)方法大多對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，需要特定儀器，且過程繁瑣，試劑、設(shè)備昂貴，不利于實(shí)時、快速、現(xiàn)場檢測傳染病
ο禽流感等病毒感染哺乳動物細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)完成病毒的組裝、復(fù)制，然后再將新生的分泌到細(xì)胞外，感染其他正常細(xì)胞。根據(jù)這些病毒生活周期的規(guī)律，可以在感染早期通過檢測人或動物體液中的微量病毒顆粒實(shí)現(xiàn)對疾病的早期檢測，從而突破了傳統(tǒng)檢測方法的局限。在本診斷方法的優(yōu)點(diǎn)在于利用基于納米材料或其他有機(jī)材料等構(gòu)建的場效應(yīng)晶體管生物芯片，能夠直接、超靈敏的檢測到人或動物血液、體液中微量的病毒顆粒，從而突破了傳統(tǒng)檢測方法的束縛，且裝置構(gòu)建簡單、便攜，可實(shí)現(xiàn)快速、現(xiàn)場檢測人或動物是否被病毒感染。具有實(shí)時靈敏、快速便攜、高通量、集成化、自動化等特點(diǎn)，是檢診斷人或者動物是否被病毒感染的極佳方法。采用場效應(yīng)晶體管生物傳感原理研制的便攜式病毒檢測儀具有實(shí)時、靈敏、準(zhǔn)確檢測人或動物是否被病毒感染的作用，是疾病預(yù)防、監(jiān)控、檢測和病毒學(xué)研究中的高效檢測方法和儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是構(gòu)建一套能夠快速實(shí)時、靈敏準(zhǔn)確的現(xiàn)場診斷人或動物是否被病毒性傳染病感染的裝置和方法。本方法能夠解決現(xiàn)有的傳統(tǒng)方法的不足之處，更簡單廉價、快速便攜診斷病毒性傳染疾病。利用生物學(xué)的免疫反應(yīng)捕獲病毒，快速準(zhǔn)確，具有特異性；結(jié)合場效應(yīng)晶體管這一物理學(xué)器件進(jìn)行疾病檢測，使得本裝置更易于集成化、自動化、高通量地對樣本進(jìn)行檢測，適合于在流行性傳染病高爆發(fā)的季節(jié)對進(jìn)行數(shù)量巨大的樣本進(jìn)行快速檢測。本發(fā)明提供了一種新型的病毒性感染疾病的檢測方法，其原理是將動物細(xì)胞或人的血液、體液收集在一普通容器中，再將細(xì)胞裂解或者直接檢測體液中所含有的微量病毒顆粒，經(jīng)過一個簡單的純化過程，再通入與場效應(yīng)晶體管檢測芯片整合的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流體通道中。當(dāng)體液流過場效應(yīng)晶體管的半導(dǎo)體溝道材料時，如果含有目標(biāo)病毒顆粒，納米修飾在溝道上的病毒抗體就可以和病毒發(fā)生特異性的結(jié)合，使病毒吸附在溝道上面。由于病毒顆粒表面在溶液中帶有電性，當(dāng)他們吸附在場效應(yīng)晶體管的溝道上時， 會對場效應(yīng)晶體管產(chǎn)生電場的作用，減弱或加強(qiáng)半導(dǎo)體溝道的耗盡，從而影響載流子的遷移速率或者濃度，導(dǎo)致會有電流的增加或者減弱，從而檢測系統(tǒng)檢測到電信號的變化。病毒的含量越高，會使這種電信號越強(qiáng)。且最終輸出的電學(xué)信號易于被電腦快速識別。本裝置和方法采用流動進(jìn)樣、即時檢測，檢測完畢后樣品流出，再通入一定量的緩沖溶液洗滌數(shù)十秒，即可進(jìn)行下一樣品的診斷檢測，是對人或動物體內(nèi)的病毒的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，構(gòu)建了用于病毒檢測的場效應(yīng)晶體管的生物芯片(如圖1)，其構(gòu)建步驟為
(1)將各種材料的納米線或薄膜通過一定方法置于有SiO2絕緣層的硅襯底上，作為場效應(yīng)晶體管的溝道。
(2)通過磁控濺射等方式在溝道的兩側(cè)，構(gòu)建出長1至2厘米、寬5毫米、厚200納米左右的金屬電極，作為場效應(yīng)晶體管源極、漏極。
(3)兩電極距離50至100微米。
(4)構(gòu)建好芯片后，在溝道處滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷) 或GPTMS (γ (2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷))有機(jī)連接試劑，修飾反應(yīng)3小時。
(5)修飾上有機(jī)連接試劑后，在溝道處再滴加含有針對某種特定病毒的抗體蛋白溶液， 反應(yīng)1小時，再通入牛血清白蛋白溶液封閉，緩沖溶液洗滌，即得到具有檢測病毒能力的場效應(yīng)晶體管生物芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，提供了一種的病毒性感染疾病的檢測裝置與方法，其組成和作用為
(1)用于裝納人或動物體液、血液的容器瓶及其連接軟管。容器的下端開一小口，連接上帶有機(jī)械閥門如鐵夾的塑料或硅膠軟管。本部分裝置的作用在于裝容人或動物的體液， 下一步檢測時即可打開控制液流的機(jī)械閥門，讓容器里的體液通過軟管流入與聚二甲硅氧
4烷整合的場效應(yīng)晶體管生物芯片檢測裝置。所有的容器、軟管等裝置均進(jìn)行滅菌、消毒處理，確保不讓其他病原微生物或雜質(zhì)影響檢測結(jié)果。
(2)與軟管相連接的聚二甲基硅氧烷微流體芯通道。它與修飾好病毒抗體的場效應(yīng)晶體管芯片緊密粘合。采用可塑的聚二甲基硅氧烷高分子聚合物材料與場效應(yīng)晶體管芯片緊密貼合的目的在于構(gòu)建出一個可以進(jìn)樣品溶液、流過晶體管溝道、再流出溶液的密閉通道， 這樣易于控制液流方向與線路。流出微流體通道后再連接一燒杯，當(dāng)做廢液池。
(3)場效應(yīng)晶體管生物芯片。在場效應(yīng)晶體管的敏感溝道部分修飾上病毒抗體，再連接外部的測量、檢測設(shè)備，當(dāng)含有病毒的溶液流經(jīng)場效應(yīng)晶體管的溝道部分時，溶液中的病毒分子就會與修飾在溝道上的抗體特異性的結(jié)合，由于病毒顆粒在溶液中帶電性，結(jié)合在溝道上后會對半導(dǎo)體溝道內(nèi)的載流子產(chǎn)生電場的作用，會增強(qiáng)或減弱半導(dǎo)體的耗盡，從而改變場效應(yīng)晶體管源極、漏極間的電學(xué)信號，可以被測量儀器所檢測到。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是構(gòu)建了與場效應(yīng)晶體管生物芯片整合的微流體通道，其構(gòu)建的步驟、方法是其制備方法為，利用半導(dǎo)體光刻工藝，在硅襯底上構(gòu)建一條長數(shù)厘米， 寬100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻膠作用模板，然后將液態(tài)的聚二甲基硅氧烷與一定劑量的固化劑混合后覆蓋于模板上。隨后放入真空干燥箱，真空狀態(tài)，90度下加熱20分鐘后取出。將凝固的聚二甲基硅氧烷塊與模板分離，再與硅襯底緊密貼合即構(gòu)建完成。本病毒性疾病檢測裝置與方法的可行性和靈敏度來源于場效應(yīng)晶體管生物芯片對于患者體液中微量的病毒顆粒的敏感響應(yīng)；本方法的選擇性來源于固定在場效應(yīng)晶體管溝道上的通過一般生物方法制備的針對某種病毒的抗體。通過固定不同種類的抗體，可實(shí)現(xiàn)對不同病毒性疾病的特異性診斷。本方法能實(shí)現(xiàn)快速性、便攜性現(xiàn)場診斷的原因是場效應(yīng)晶體管生物芯片和電子檢測系統(tǒng)易于小型化、集成化、耗能低，且可重復(fù)利用。適合于在缺少常規(guī)病毒檢測實(shí)驗(yàn)設(shè)備的條件下，進(jìn)行快速診斷。本裝置和方法易于自動化、高通量診斷樣本的原因是，場效應(yīng)晶體管輸出的電學(xué)信號易于被電腦識別，且流動進(jìn)樣、即時檢測， 檢測完畢后樣品流出、再通入一定量的洗滌緩沖溶液數(shù)十秒，即可進(jìn)行下一樣品的診斷檢測。本發(fā)明方法與裝置的突出特點(diǎn)與顯著進(jìn)步在于
(1)本發(fā)明基于的場效應(yīng)晶體管生物芯片，構(gòu)建材料靈活多變，可以是有機(jī)薄膜、無機(jī)金屬氧化物材料，構(gòu)建方法和抗體連接的方法都簡單易行。如若使用某些生物相容性好的有機(jī)材料(如石墨烯)作為溝道，抗體蛋白可無需中介直接連接在晶體管上，大大降低診斷時間和成本。
(2)本發(fā)明基于的場效應(yīng)晶體管生物芯片，在檢測時利用聚二甲基硅氧烷微流體通道和SiO2鈍化層對電極和芯片進(jìn)行保護(hù)，有效提高芯片使用率和重復(fù)性。
(3)本方法直接檢測人或者動物血液中的病毒，不僅比檢測人體對病毒產(chǎn)生的抗體更直接、更快速，而且也省去了檢測病毒核酸的PCR步驟。
(4)本方法由于使用納米級的有機(jī)、無機(jī)半導(dǎo)體材料構(gòu)建場效應(yīng)晶體管生物芯片，可實(shí)現(xiàn)靈敏、快速檢測，靈敏度比傳統(tǒng)方法提高IO3到IO6倍，檢測時間在1分鐘內(nèi)就能完成。實(shí)時、快速，無需熒光或其他分子標(biāo)記物。
(5)本方法將場效應(yīng)晶體管與大規(guī)模傳染病的檢測結(jié)合起來，制備出的檢測儀，易于集成化、自動化、便攜化，適合在傳染病爆發(fā)的現(xiàn)場對大量樣本進(jìn)行快速檢測。


圖1是本發(fā)明所述方法場效應(yīng)晶體管生物芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖1標(biāo)記含義見下表
權(quán)利要求
1.一種基于場效應(yīng)晶體管生物芯片的診斷裝置和方法，其特征是以功能化修飾的場效應(yīng)晶體管生物芯片為核心，加上輔助進(jìn)液、出液的PDMS (聚二甲基硅氧烷)微流體通道和電子檢測系統(tǒng)組成，能夠檢測出人或者動物的體液中的微量的病毒。
2.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片，其特征是在硅襯底上利用半導(dǎo)體工藝制造的金屬性的源極電極、漏極電極和連接在源極和漏極電極間的半導(dǎo)體溝道。半導(dǎo)體敏感材料溝道可以是金屬氧化物納米材料如SnO2納米線、TiO2納米線等，也可以是其他半導(dǎo)體材料，如硅納米線、碳納米管、石墨烯納米帶、GaN納米線、有機(jī)物薄膜中的一種或幾種。源極電極和漏極電極上鈍化一層SiO2以適應(yīng)在水溶液中的檢測。
3.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片的導(dǎo)電溝道，其特征在于晶體管的半導(dǎo)體溝道可以是一條或由多條組成的陣列。
4.如權(quán)利1所述的功能化修飾的場效應(yīng)晶體管，其特征在于晶體管的半導(dǎo)體溝道上通過有機(jī)連接劑APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)或GPTMS (γ (2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷)等的中介作用，將各種針對病毒的抗體蛋白連接在半導(dǎo)體敏感溝道上面。
5.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片能夠檢測人或者動物的體液中的特定病毒的含量的原理是，將針對某種病毒的抗體蛋白連接在半導(dǎo)體敏感溝道上面，當(dāng)取待檢測者或待檢測動物的血液、體液，通過微流體通道，流過修飾有抗體的溝道時，抗體可以和病毒發(fā)生特異性的結(jié)合，吸附在溝道上面，由于病毒顆粒表 面在溶液中帶有電性，，當(dāng)它們吸附在半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管的溝道上時，會對場效應(yīng)晶體管產(chǎn)生電場的作用，減弱或加強(qiáng)半導(dǎo)體溝道的耗盡，從而影響載流子的遷移速率或者濃度，最終會有電流的增加或者減弱，從而檢測系統(tǒng)檢測到電信號的變化。
6.如權(quán)利3所述的針對某種病毒的抗體，其來源可用常規(guī)的生物學(xué)制備單克隆抗體的方法制備，再修飾在場效應(yīng)晶體管的溝道上。
7.如權(quán)利1所述的輔助進(jìn)液、出液的PDMS微流體通道，其特征是由PDMS構(gòu)建的，控制液體流動范圍和方向的，與硅襯底緊密貼合的長方體塊狀物，與硅襯底貼合的一面上有長數(shù)厘米，寬50微米到1毫米、深50微米到100微米的凹陷下去的通道，當(dāng)與硅襯底緊密貼合時，即構(gòu)建出了一個介于硅襯底與PDMS塊之間的密閉通道，在通道入口和出口處再各接一塑料或硅膠軟管。整個微流體通道裝置的作用是控制樣品流入檢測裝置，并讓液流緩慢、 有序地流過場效應(yīng)晶體管的溝道部分，再流出至廢液池。
8.如權(quán)利6所述的輔助進(jìn)液、出液的PDMS微流體通道，其制備方法為，利用半導(dǎo)體光刻工藝，在硅襯底上構(gòu)建一條長數(shù)厘米，寬100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻膠作用模板，然后將液態(tài)的PDMS加入一定劑量的固化劑后覆蓋與模板上，隨后放入真空干燥箱，真空狀態(tài)、90度下加熱20分鐘后取出，將凝固的PDMS塊與模板分離，再與硅襯底緊密貼合即構(gòu)建完成。
9.如權(quán)利1所述的電子檢測系統(tǒng)，主要由能在場效應(yīng)晶體管的三個電極端(源極、漏極、柵極)給予電壓的電源裝置和一個電流表構(gòu)成。
全文摘要
一種基于場效應(yīng)晶體管的病毒性傳染疾病的快速診斷裝置，由場效應(yīng)晶體管生物芯片、微流體通道進(jìn)樣封裝系統(tǒng)、電子檢測系統(tǒng)三部分組成。利用半導(dǎo)體制作工藝在硅襯底上構(gòu)建一個源極電極，一個漏極電極和在源、漏兩極間的半導(dǎo)體溝道，在溝道上共價修飾硅烷試劑作為連接分子，連接病毒抗體，然后用聚二甲基硅氧烷制作的微流體通道與硅襯底緊密貼合封裝，最后將源、漏兩電極與一套信號檢測系統(tǒng)相連，可快速、準(zhǔn)確、靈敏地診斷人或動物是否被病毒性疾病感染，是一種便攜式的流行傳染病檢測儀。
文檔編號G01N27/414GK102435654SQ201110259970
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者張恩迪, 徐成, 李秋紅, 王太宏, 許志, 陳立寶 申請人:湖南大學(xué)