專利名稱：一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種液態(tài)奶中超微量小分子有毒有害物質(zhì)(如獸藥、環(huán)境激素、生物毒素、農(nóng)藥類、非法添加物等，分子量小于1500)的新型快速通用檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
液態(tài)奶((如生鮮牛奶、鮮牛奶、酸奶)是人們?nèi)粘z取營(yíng)養(yǎng)的一種重要食品，然而液態(tài)奶中含有的小分子有毒有害物質(zhì)如獸藥、環(huán)境激素、生物毒素、農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑、非法添加物等已經(jīng)對(duì)其安全構(gòu)成了不同程度的安全隱患，這些物質(zhì)種類數(shù)量相當(dāng)龐大，理化性質(zhì)差異較大，加上牛奶中含有較高含量的蛋白、脂肪和乳糖等基質(zhì)干擾成分，對(duì)超微含量的小分子有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)構(gòu)成難度。隨著質(zhì)譜尤其是LC-MS/MS的問(wèn)世和不斷發(fā)展，已經(jīng)陸續(xù)有多類別多殘留檢測(cè)方法報(bào)道，2006年Yamada發(fā)表第一篇同時(shí)篩選牛肉、豬肉和雞肉中130種獸藥的LC-MS/MS 方法(文獻(xiàn) 1 Yamada R, Kozono M, Ohmori T, Morimatsu F, Kitayama M (2006) Biosci Biotechnol Biochem 70 :54_65)，由于用到正己烷分層去脂，不適合弱極性化合物檢測(cè)，通用性并不強(qiáng)；Ortelli等采用乙腈提取，上清液進(jìn)行超濾后UPLC-MS檢測(cè)牛奶中150種獸藥(文獻(xiàn) 2 =Ortelli D.，Cognard E.，Jan P. and Edder P.，J. Chrom. B，2009，877 (23) 2363-2374.)，大環(huán)內(nèi)酯類低于10%，喹諾酮類回收率范圍98-807%，四環(huán)素類141-258%， 部分苯逼咪唑類高于436%，回收率不理想；HanM2008)提出來(lái)通用型提取方法(Generic Extraction Method)概念，采用UPLC-MS/MS同時(shí)分析飼料、牛奶、蜂蜜、肉類等基質(zhì)中 172種種農(nóng)藥、生物毒素、植物毒素和獸藥，被認(rèn)為是最早的通用型檢測(cè)方法(文獻(xiàn)3 :Mol HG，Plaza-Bolanos P，Zomer P，de Rijk TC, Stolker AA, Mulder PP. Toward a generic extraction method for simultaneous determination of pesticides mycotoxins， plant toxins, and veterinary drugs in feed and food matrixes. Anal. Chem. 2008, 8(K24)，9450-9459.)，但是該方法中樣品基本上沒(méi)有經(jīng)過(guò)凈化處理，檢測(cè)限不能滿足所有受試的目標(biāo)物，也容易污染儀器。Stolker等分析了牛奶中101種獸藥，樣品采用乙腈提取，Strata-X 小柱凈化(文獻(xiàn) 4 :Stolker Α. Α. Μ. , Rutgers P. , Oosterink Ε. , Lasaroms J. J. P.，Peters R. J. B.，van Rhijn J. Α.，Nielen Μ. W. F.，Anal. Bioanal. Chem.，2008， 391 (6) :2309-2322.)，通過(guò)固相萃取等凈化方式，部分化合物可能在該過(guò)程中損失，同時(shí)前處理時(shí)間又較長(zhǎng)。上述文獻(xiàn)報(bào)道多類多殘留檢測(cè)方法，在通用性和凈化效果方面都存在問(wèn)題。目前，在我國(guó)針對(duì)奶制品中這些有毒有害物現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法數(shù)量雖然較多，但這些方法分為多個(gè)樣品制備方法，操作步驟過(guò)多，檢測(cè)人員精力分散，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)效率低下，可操作性不強(qiáng)，而且項(xiàng)目覆蓋面尚不全面，容易帶來(lái)漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)成本高昂。因此，目前尚未出現(xiàn)真正針對(duì)小分子有毒有害物的通用型檢測(cè)方法。究其原因，無(wú)外乎這些方法的前處理和儀器分析過(guò)程針對(duì)不同理化性質(zhì)的化合物難以兼容，缺乏通用性，因此很難在常規(guī)方法上顯著提高監(jiān)測(cè)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，該方法的前處理和儀器分析過(guò)程針對(duì)不同理化性質(zhì)的化合物兼容性強(qiáng)，檢測(cè)效率高，可操作性強(qiáng)，檢測(cè)限能滿足所有受試的目標(biāo)物并且降低了檢測(cè)成本。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的快速通用檢測(cè)方法，具體包括以下步驟(1)樣品前處理及提取凈化將液體牛奶加入試管中，并在試管中加入保護(hù)劑和乙腈-乙醇混合液，混勻后離心得到第一上清液，將第一上清液加入離心管中，并在離心管中加入乙腈-乙醇混合液，充分混勻后離心得到第二上清液，將第二上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后用乙腈-乙醇-水混合液定容得到樣品液，將樣品液搖勻后，通過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾得到上樣液；(2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備A.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成氯霉素和β2-激動(dòng)劑類分別為20ng/mL，三聚氰胺、雙聚氰胺、納他霉素分別為 2000ng/mL，阻斷劑、甲狀腺抑制劑、喹惡啉類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、β -內(nèi)酰胺、咪唑類、噠唑類、咖啡因、抗寄生蟲(chóng)藥類、阿維菌素類、性激素類、皮質(zhì)激素、喹惡啉類、真菌毒素類、大環(huán)內(nèi)酯類、非留類消炎藥、β -內(nèi)酰胺、鎮(zhèn)定劑、農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑、染料類、雌激素、皮質(zhì)激素、環(huán)境激素和農(nóng)藥類(除草劑)均為200ng/mL，_18°C冷藏；B.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量在4. Oml空白牛奶樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0 μ L，20 μ L，40 μ L，80 μ L，160 μ L， 320yL，按步驟(1)所述的樣品前處理及提取凈化方法進(jìn)行處理，以濃度為橫坐標(biāo)，儀器響應(yīng)值(響應(yīng)值=標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量)為縱坐標(biāo)，做基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為試樣處理液中待測(cè)物濃度定量的依據(jù)；(3)超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定A.高效液相分離液相條件為a)色譜柱 Acquity Waters HSS-T3, 2. ImmX 100mm, 1. 8 μ m ；b)色譜柱溫度40°C ；c)如果質(zhì)譜采用Riml正離子模式進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為將步驟(1)得到的上樣液稀釋4倍后取IOuL ；如果質(zhì)譜采用Rim2正離子模式和Rim3負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為步驟(1) 得到的上樣液IOuL;d)流速0. 4mL/mine)如果質(zhì)譜采用Rim3負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相A1 :2. 5mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B1 :甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記)為=OIminJS-O1^A1 ； 6-10min,0% A1 ；10-10. 5min,0-98% A1 ；10. 5-12min,98% A1 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相B1補(bǔ)足余下的％數(shù)；如果質(zhì)譜采用Runl正離子模式和Run2正離子模式進(jìn)行測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相 A2 0. 甲酸水溶液，流動(dòng)相4 含0. 甲酸的甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記) 為0-2. 3min,98-80 % A2 ；2. 3-8min，80_0 % A2 ；8_10min，0 % A2 ；10-10. 5min，0_98 % A2 ； 10. 5-12min,98% A2 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相化補(bǔ)足余下的％數(shù)；f)流路切換0 0. 55min切換閥打開(kāi)，色譜柱流出液進(jìn)入廢液，0. 56min后開(kāi)始質(zhì)譜采集；B.質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜條件為a)采用電噴霧離子化電離源，毛細(xì)管電壓正離子、負(fù)離子電壓分別為3.5kV和
3.OkV ；b)多通道監(jiān)測(cè)方式MRM ；c)離子源溫度150°C，去溶劑氣溫度450°C ；d)錐孔反吹氣流速50L/h ；去溶劑流速700L/he)碰撞氣體氬氣3. 3X IO"3 mba(毫巴)；g)分組方案極性較強(qiáng)的藥物選擇Riml正離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Runl正離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為88 6 6的比例混合；極性偏弱藥物選擇Rim2正離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Run2正離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為10 :5:5 的比例混合；極性和非極性的藥物選擇Run3負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Rim3負(fù)離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為10 5 5的比例混合；(4)濃度計(jì)算方法樣品中待測(cè)物的含量根據(jù)如下計(jì)算公式(1)得到
Γ η ^ Cx 廠 xlOOO⑴X =........................................ (1)
wxlOOO式中X-試樣中待測(cè)物含量，單位為微克每公斤(μ g/L)；C-試樣處理液中待測(cè)物濃度，根據(jù)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，單位為納克每毫升 (ng/mL)；V-定容體積，單位為毫升(mL)；m-液體牛奶試樣體積，單位為毫升(mL)。所述的液體牛奶、所述的保護(hù)劑和所述的乙腈-乙醇混合液的混合比為
4.OmL 150mg 5mL ；所述的第一上清液與乙腈-乙醇混合液的混合體積比為9 62 ；采用不同有機(jī)溶劑含量的溶劑體系，分兩步分別沉淀除去脂類、蛋白、糖類、鹽分等干擾成分， 快速簡(jiǎn)便通用，無(wú)須固相萃取等手段；所述的乙腈-乙醇混合液中乙腈與乙醇的混合體積比為9 1，可以防止乙腈與水分層；所述的定容液乙腈-乙醇-水混合液中乙腈、乙醇與水的混合體積比為1:1:2。所述的保護(hù)劑為固體EDTA-Nii2,防止四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類等藥物和樣品中的重金屬離子結(jié)合，保障回收率。稱取4. OmL牛奶于15mL試管中，加入150mg EDTA-Na2混勻，再加入5mL乙腈-乙醇混合液混勻30s，0°C冷凍離心IOmin得到第一上清液，取4. 5mL第一上清液于50mL離心管中，加入31mL乙腈-乙醇混合液，充分混勻，0°C冷凍離心IOmin得到第二上清液，將第二上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-乙醇-水混合液定容至1. OmL得到樣品液，搖勻后樣液通過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾得到上樣液。所述的0. 22 μ m微孔濾膜固定在多通道針式過(guò)濾裝置上，該多通道針式過(guò)濾裝置方便過(guò)濾，大大提高過(guò)濾效率。步驟(1)中所述的離心條件為溫度-1 1°C，轉(zhuǎn)速4500轉(zhuǎn)/min，時(shí)間lOmin。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、提取技術(shù)和凈化技術(shù)具有通用性，檢測(cè)對(duì)象覆蓋范圍寬，降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)，小分子有毒有害的有機(jī)物僅通過(guò)一個(gè)前處理方法進(jìn)行處理，加上前處理簡(jiǎn)便快速，與以往多個(gè)方法的檢測(cè)方法相比，檢測(cè)效率得到了根本性的提升，縮短了檢測(cè)周期，與背景技術(shù)中文獻(xiàn)1 相比本方法沒(méi)有用到液液分層凈化，保障通用性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、不需要固相萃取等凈化方式，與采用固相萃取小柱相比，不但保證極性強(qiáng)和極性弱的待測(cè)物的回收率，而且降低了樣品處理的昂貴成本消耗。3、流路切換設(shè)置避免樣液中的鹽分和糖分進(jìn)入質(zhì)譜儀(噴霧室)，彌補(bǔ)了不采用固相萃取小柱的缺陷。4、檢測(cè)分組方案根據(jù)流動(dòng)相與定容溶劑的選擇，Runl正離子模式適合極性較強(qiáng)的藥物，定容溶劑為7jC 乙醇乙腈(88 6 6，(v/v/v))，獲得窄的峰寬，改善線性， Run2適合正離子模式下的極性偏弱藥物，定容溶劑為7jC 乙醇乙腈(10 5 5，(ν/ν/ ν))，線性良好，Run3負(fù)離子模式下適合極性和非極性的藥物，定容溶劑為水乙醇乙腈(10 5 5，(v/v/v))，上述方案確保充分駐留時(shí)間和良好離子化程度，能保證滿足最少采集的數(shù)據(jù)點(diǎn)要求，改善定量的線性，可靠性強(qiáng)，靈敏度高。5、本方法經(jīng)過(guò)283種具體藥物的驗(yàn)證試驗(yàn)，檢測(cè)限范圍在0. 01 5 μ g/L之間，除了棒曲霉毒素、水楊酸、三聚氰胺、雙聚氰胺、雌二醇為5 μ g/L外，其余檢測(cè)限均低于1 μ g/ L ；回收率范圍在60 130%，其中95%以上藥物均在70 110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于25%，其中95 %以上種類RSD均< 10 %，精密度良好，均能滿足目前國(guó)內(nèi)和歐盟限量要求。具體見(jiàn)實(shí)施例中表2-4。本方法與背景技術(shù)中文獻(xiàn)2的方法相比，本方法回收率理想， 精密度良好；與文獻(xiàn)3的方法比較，本方法不僅包含通用型提取方法，同時(shí)還具備通用性凈化方法，檢測(cè)限能達(dá)到0. 01 5μ g/L ；與文獻(xiàn)4的方法相比，快速簡(jiǎn)捷，回收率高，精密度良好。綜上所述，本發(fā)明從小分子化合物一般共性出發(fā)，充分考慮到各種物質(zhì)的溶解性、 熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、極性強(qiáng)弱、共存穩(wěn)定性等，開(kāi)發(fā)出通用型快速前處理技術(shù)(Generic & Rapid sample pr印aration)和UPLC-MS/MS電噴霧儀器測(cè)定技術(shù)，在滿足檢測(cè)限量要求的前提下，能給生產(chǎn)過(guò)程控制和食品檢測(cè)工作帶來(lái)顯著的提高效率和降低檢測(cè)成本的效果。通過(guò)在牛奶中添加283種化合物(項(xiàng)目分布各大類，具有充分的廣泛性)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，檢測(cè)限、回收率和精密度均滿足分析要求。


圖1為本發(fā)明液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法流程圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此，保護(hù)范圍以權(quán)力要求為準(zhǔn)。1、材料1. 1主要試劑和材料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自:Dr. Ehrenstorfer, Sigma, Witega 以及 EU pharmacopoeia ；先將單標(biāo)配制濃度為0. 5mg/mL。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯霉素和β 2_激動(dòng)劑類分別為 20ng/mL，三聚氰胺、納他霉素和甲狀腺抑制劑類分別為2000ng/mL，阻斷劑、甲狀腺抑制劑、 喹惡啉類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、β -內(nèi)酰胺、咪唑類、噠唑類、咖啡因、抗寄生蟲(chóng)藥類、阿維菌素類、性激素類、皮質(zhì)激素、喹惡啉類、真菌毒素類、大環(huán)內(nèi)酯類、非留類消炎藥、 β -內(nèi)酰胺、鎮(zhèn)定劑、農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑、染料類、雌激素、皮質(zhì)激素、環(huán)境激素和農(nóng)藥類(除草劑) 均為200ng/mL，_18°C冷藏；乙腈、甲醇、乙醇、乙酸銨均為色譜純購(gòu)自迪馬公司，其他試劑為分析純，水為二級(jí)水。牛奶樣品采自市售鮮牛奶。1. 2主要儀器超高效液相色譜儀型號(hào)Acquity，美國(guó)waters公司三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀型號(hào)XEV0，美國(guó)waters公司純水儀Milli-Q，法國(guó)Millipore 公司電子天平(感量分別為0. lmg，德國(guó)Sartorius)。冷凍離心機(jī)，3-1 ，德國(guó)sigma真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀R_215，瑞士 Buchi多通道針式過(guò)濾裝置Superb20-40，寧波賽恩斯2、液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)方法(如圖1所示)2. 1通用型快速前處理(提取與凈化)稱取4. OmL牛奶于15mL試管中，加入150mg EDTA-Na2混勻，再加入5mL乙腈-乙醇(90 10(V/V))混勻30s，0°C冷凍離心IOmin得到第一上清液，取4. 5mL第一上清液于 50mL離心管中，加入3ImL乙腈-乙醇(90 10 (V/V))，充分混勻，0°C冷凍離心IOmin得到第二上清液，將第二上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用水乙醇乙腈 (10 5 5，(ν/ν/ν))組成的混合液定容至LOmL得到樣品液，搖勻后樣液通過(guò)固定在多通道針式過(guò)濾裝置的0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾得到上樣液。其中，離心條件為溫度-1 1°C 轉(zhuǎn)速4500轉(zhuǎn)/min，時(shí)間lOmin，保護(hù)劑EDTA-Na2用于防止四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類等藥物和樣品中的重金屬離子結(jié)合，保障回收率，乙醇的加入防止有機(jī)相與水相分層，并增加沉淀效^ ο 2. 2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成和標(biāo)準(zhǔn)曲線A.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成氯霉素和β 2-激動(dòng)劑類20ng/mL，三聚氰胺、納他霉素、甲狀腺抑制劑類2000ng/ mL，阻斷劑、甲狀腺抑制劑、喹惡啉類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、內(nèi)酰胺、咪唑類、噠唑類、咖啡因、抗寄生蟲(chóng)藥類、阿維菌素類、性激素類、皮質(zhì)激素、喹惡啉類、真菌毒素類、大環(huán)內(nèi)酯類、非留類消炎藥、β -內(nèi)酰胺、鎮(zhèn)定劑、農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑、染料類、雌激素、皮質(zhì)激素、環(huán)境激素和農(nóng)藥類(除草劑)均為200ng/mL，_18°C冷藏。B.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量在4. Oml空白牛奶樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0 μ L，20 μ L，40 μ L，80 μ L，160 μ L，
320 μ L，按上述前處理方法進(jìn)行樣品提取和凈化后，以濃度為橫坐標(biāo)，儀器響應(yīng)值(響應(yīng)值 =標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量)為縱坐標(biāo)，做基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為試樣處理液中待測(cè)物濃度定量的依據(jù)。2. 3超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定(UPLC-MS/MS)A.超高效液相分離液相條件為a)色譜柱 Acquity Waters HSS-T3, 2. ImmX 100mm, L 8 μ m ；b)色譜柱溫度40°C ；c)如果質(zhì)譜采用Riml正離子模式測(cè)定，進(jìn)樣量為將步驟(1)得到的上樣液稀釋4 倍后的10 μ L ；如果質(zhì)譜采用Rim2正離子模式和Rim3負(fù)離子模式測(cè)定，進(jìn)樣量為步驟(1) 得到的上樣液IOyL;d)流速0. 4mL/mine)如果質(zhì)譜采用Riml正離子模式和Rim2正離子模式測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相A2 ο. 甲酸水溶液，流動(dòng)相化含0.甲酸的甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記) 為0-2. 3min,98-80 % A2 ；2. 3-8min，80_0 % A2 ；8_10min，0 % A2 ；10-10. 5min，0_98 % A2 ； 10. 5-12min,98% A2 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相化補(bǔ)足余下的％數(shù)；如果質(zhì)譜采用Rim3負(fù)離子模式測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相A1 :2. 5mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B1 甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記)為:0-6min,98-0%A1 ；6-10min,0% A1 ；10-10. 5min,0-98% A1 ；10. 5-12min,98% A1 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相B1補(bǔ)足余下的％數(shù)(如表1所示)；表1.目標(biāo)物的UPLC-MS/MS參數(shù)設(shè)置
權(quán)利要求
1. 一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)樣品前處理及提取凈化將液體牛奶加入試管中，并在試管中加入保護(hù)劑和乙腈-乙醇混合液，混勻后離心得到第一上清液，將第一上清液加入離心管中，并在離心管中加入乙腈-乙醇混合液，充分混勻后離心得到第二上清液，將第二上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后用乙腈-乙醇-水混合液定容得到樣品液，將樣品液搖勻后，通過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾得到上樣液；(2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備A.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液組成氯霉素和β2-激動(dòng)劑類分別為20ng/mL，三聚氰胺、雙聚氰胺、納他霉素分別為 2000ng/mL，阻斷劑、甲狀腺抑制劑、喹惡啉類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺、咪唑類、噠唑類、咖啡因、抗寄生蟲(chóng)藥類、阿維菌素類、性激素類、皮質(zhì)激素、喹惡啉類、真菌毒素類、大環(huán)內(nèi)酯類、非留類消炎藥、β -內(nèi)酰胺、鎮(zhèn)定劑、農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑、染料類、雌激素、皮質(zhì)激素、環(huán)境激素和農(nóng)藥類(除草劑)均為200ng/mL，_18°C冷藏；B.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量在4. Oml空白牛奶樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0 μ L，20 μ L，40 μ L，80 μ L，160 μ L， 320yL，按步驟(1)所述的樣品前處理及提取凈化方法進(jìn)行處理，以濃度為橫坐標(biāo)，儀器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，做基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為試樣處理液中待測(cè)物濃度定量的依據(jù)，其中，響應(yīng)值=標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量；(3)超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定A.高效液相分離液相條件為a)色譜柱Acquity Waters HSS-T3, 2. ImmX 100mm, 1· 8 μ m ；b)色譜柱溫度40°C；c)如果質(zhì)譜采用Riml正離子模式進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為將步驟(1)得到的上樣液稀釋4 倍后取IOyL ；如果質(zhì)譜采用Run2正離子模式和Rim3負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為步驟(1)得到的上樣液IOyL;d)流速0.4mL/mine)如果質(zhì)譜采用Rim3負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相A1:2. 5mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B1 甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記)為:0-6min,98-0% A1 ；6-10min, 0% A1 ；10-10. 5min,0-98% A1 ；10. 5-12min,98% A1 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相B1補(bǔ)足余下的％數(shù)；如果質(zhì)譜采用Runl正離子模式和Rim2正離子模式進(jìn)行測(cè)定，那么選擇流動(dòng)相A2 0. 甲酸水溶液，流動(dòng)相化含0. 甲酸的甲醇；梯度洗脫程序(以體積百分比記) 為0-2. 3min,98-80 % A2 ；2. 3-8min，80_0 % A2 ；8_10min，0 % A2 ；10-10. 5min，0_98 % A2 ； 10. 5-12min,98% A2 ；各洗脫時(shí)間段中均以流動(dòng)相化補(bǔ)足余下的％數(shù)；f)流路切換0 0.55min切換閥打開(kāi)，色譜柱流出液進(jìn)入廢液，0. 56min后開(kāi)始質(zhì)譜采集；B.質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜條件為a)采用電噴霧離子化電離源，毛細(xì)管電壓正離子、負(fù)離子電壓分別為3.5kV和`3.OkV ；b)多通道監(jiān)測(cè)方式MRMc)離子源溫度150°C，去溶劑氣溫度450°C；d)錐孔反吹氣流速50L/h；去溶劑流速700L/he)碰撞氣體氬氣3.3X 10_3毫巴g)分組方案極性較強(qiáng)的藥物選擇Riml正離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Riml正離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為88 6 6的比例混合；極性偏弱藥物選擇Rim2正離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Run2正離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為10 5 5的比例混合；極性和非極性的藥物選擇Run3負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定，Rim3負(fù)離子模式定容溶劑為水、乙醇和乙腈按體積比為10 5 5的比例混合； (4)濃度計(jì)算方法樣品中待測(cè)物的含量根據(jù)如下計(jì)算公式(1)得到 v CxVxIOOO
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的液體牛奶、所述的保護(hù)劑和所述的乙腈-乙醇混合液的混合比為4.OmL 150mg 5mL ；所述的第一上清液與乙腈-乙醇混合液的混合體積比為9 62 ；所述的乙腈-乙醇混合液中乙腈與乙醇的混合體積比為9 1 ；所述的乙腈-乙醇-水混合液中乙腈、乙醇與水的混合體積比為1 1 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的保護(hù)劑為固體EDTA-Na2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于稱取4. OmL牛奶于15mL試管中，加入150mg EDTA-Nei2混勻，再加入5mL乙腈-乙醇混合液混勻30s，0°C冷凍離心IOmin得到第一上清液，取4. 5mL第一上清液于50mL離心管中，加入31mL乙腈-乙醇混合液，充分混勻，0°C冷凍離心IOmin得到第二上清液，將第二上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-乙醇-水混合液定容至1. OmL得到樣品液，搖勻后樣液通過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾得到上樣液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的0. 22 μ m微孔濾膜固定在多通道針式過(guò)濾裝置上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)中所述的離心條件為溫度-1 1°C，轉(zhuǎn)速4500轉(zhuǎn)/min，時(shí)間lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法，特點(diǎn)是具體包括以下步驟將液體牛奶樣品進(jìn)行簡(jiǎn)便通用的提取和凈化，得到上樣液的步驟；配置混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和制作基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，然后通過(guò)超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定液態(tài)奶中小分子有毒有害物質(zhì)，最后進(jìn)行濃度計(jì)算，優(yōu)點(diǎn)是從小分子化合物一般共性出發(fā)，充分考慮到各種物質(zhì)的溶解性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、極性強(qiáng)弱、共存穩(wěn)定性等，開(kāi)發(fā)出通用型快速前處理技術(shù)和UPLC-MS/MS電噴霧儀器測(cè)定技術(shù)，在滿足檢測(cè)限量要求的前提下，能給生產(chǎn)過(guò)程控制和食品檢測(cè)工作帶來(lái)顯著的提高效率和降低檢測(cè)成本的效果。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102419354SQ20111026651
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者馮睿, 彭錦鋒, 曹蘇仙, 湛嘉, 王群威, 鐘鶯鶯, 陳杰 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院