專利名稱：尿液中尿酸檢測(cè)免疫膠體金試紙條及制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種免疫膠體金試紙條，用于檢測(cè)尿液中尿酸的含量。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)其自身健康水平日益關(guān)注。生物分子尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，分子式為C5H14N4O3，麗168. 11，不溶于水，也難溶于酸。尿酸是一種含有嘌呤結(jié)構(gòu)的化合物，也是嘌呤的最重要衍生物。尿酸含量與體內(nèi)核酸的分解代謝速度、腎的排泄功能和食物中核酸的含量有關(guān)，血或尿中尿酸含量的升高可作為診斷痛風(fēng)病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、腎功能減退和由于中毒而產(chǎn)生的肝臟疾病等的主要指標(biāo)。因此，近年來(lái)尿酸的檢測(cè)和分析在疾病的臨床診斷和治療方面的應(yīng)用日益廣泛。目前已報(bào)道的尿酸測(cè)定方法重量法、滴定法、還原法和酶法等。重量法和滴定法操作繁瑣，而且準(zhǔn)確度低，不適于尿酸的精確測(cè)定。臨床上通常采用還原法和酶比色法。還原法的檢測(cè)原理是，尿酸在堿性條件下被磷鎢酸氧化成尿素，磷鎢酸被還原成鎢藍(lán)，其生成量與尿酸含量成正比。此法的檢測(cè)缺點(diǎn)是，血樣中的抗壞血酸易干擾檢測(cè)效果，樣品必須事先進(jìn)行脫蛋白處理，需要昂貴設(shè)備和專業(yè)分析人員。酶法常用于醫(yī)院的自動(dòng)生化分析儀，適于大批量試樣的分析作業(yè)，但是血液分析前經(jīng)離心分離為血清或血漿，要求專業(yè)人員和專門的試劑，不適于家庭中使用。此外，這些方法絕大多數(shù)屬血尿酸檢測(cè)方法，病人樣本采集有疼痛且有感染危險(xiǎn)。技術(shù)方案針對(duì)上述尿酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用現(xiàn)狀，本發(fā)明基于抗體識(shí)別和納米尺寸效應(yīng)的免疫膠體金技術(shù)，結(jié)合試紙的廉價(jià)和便捷優(yōu)勢(shì)，建立一種能夠便捷直觀地測(cè)定尿液中尿酸含量的免疫膠體金速測(cè)試紙條。此試紙條無(wú)需儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，避免了取血的痛苦和可能的感染危險(xiǎn)，檢測(cè)快速現(xiàn)象直觀，是一種非常適合病人家庭和小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的高效尿液尿酸檢測(cè)方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測(cè)尿液中尿酸的免疫膠體金試紙，包括背板及硝酸纖維素膜，尿酸-OVA抗原作為試紙檢測(cè)線T線，羊抗兔抗體作為試紙質(zhì)控線C線，C線與T線均噴涂于硝酸纖維素膜上，并在硝酸纖維素膜的T線側(cè)疊加粘貼膠體金標(biāo)墊，膠體金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜的C線側(cè)分別疊加粘貼樣品墊和吸收墊。所述的膠體金標(biāo)墊由特異識(shí)別尿酸的兔源抗體所修飾。硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊及吸收墊，依次粘貼在涂有膠層的白色塑料背板上，壓緊后切割成條狀。所述試紙可直接用于尿液中尿酸的檢測(cè)。所述試紙的制備方法，包括以下步驟(I)通過(guò)尿酸半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，獲得尿酸-BSA人工抗原；(2)將尿酸-BSA人工抗原免疫兔子，免疫后取兔血獲得抗血清并純化抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗體對(duì)尿酸分子的特異性，得到尿酸抗體；(3)利用膠體金標(biāo)記上述尿酸抗體，制備膠體金抗體探針液，通過(guò)浸泡玻璃棉膜，得到膠體金墊；(4)將尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗體，分別噴涂于硝酸纖維素膜上；(5)將硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊以及吸收墊，依次粘貼在涂有膠層的白色塑料背板上，壓緊后切割成條狀。本發(fā)明優(yōu)選以下技術(shù)方案尿酸免疫膠體金速測(cè)試紙條(圖1)，是在一塊涂有膠層的塑料背板上粘貼噴有尿酸-OVA (雞卵清蛋白)包被抗原(T線)和羊抗兔抗體(C線)的硝酸纖維素膜，并在硝酸纖維素膜的T線側(cè)疊加粘貼特異識(shí)別尿酸兔源抗體修飾的膠體金墊，膠體金墊和硝酸纖維素膜的C線側(cè)分別疊加粘貼樣品墊和吸收墊，切割成條狀。尿液中尿酸免疫膠體金速測(cè)試紙條制造方法的全過(guò)程包括以下步驟I)采檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，顆粒直徑為15 ±3. 5nm ；2)將尿酸半抗原通過(guò)水溶性碳化二亞胺(EDC)法將尿酸分子與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，獲得尿酸-BSA人工抗原；所述的尿酸半抗原的特征是，在尿酸分子中一個(gè)羥基位點(diǎn)添加一個(gè)戊酸的改造分子；3)將尿酸-BSA人工抗原免疫雄性新西蘭大白兔，免疫后取兔血獲得抗血清并純化抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗體對(duì)尿酸分子的特異性；4)1. 3mg尿酸抗體與50mL膠體金溶液混合，制備膠體金抗體探針。將玻璃棉膜浸泡與此探針溶液中，37°C干燥,得到膠體金墊；5)采用單向噴點(diǎn)儀將尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗體，噴在硝酸纖維素膜上，37°C干燥；6)將硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊以及吸收墊，依次粘貼在涂有膠層的白色塑料背板上，壓緊后切割成條狀。


圖1尿酸抗體膠體金速測(cè)試紙條的構(gòu)造圖；圖2尿酸抗體膠體金速測(cè)試紙條的檢測(cè)原理圖；其中I尿酸抗體膠體金，2尿酸-0VA，3羊抗兔抗體，4硝酸纖維素膜，5樣品墊，6膠體金標(biāo)墊，7T線，8C線，9吸收墊，10背板，11尿酸。
具體實(shí)施例實(shí)施例1膠體金的制備本發(fā)明中膠體金的制備過(guò)程如下采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒。取O. 01%氯金酸IOOmL,置于燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入I %檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止。冷卻后于棕色瓶中，4°C保存。實(shí)施例2尿酸-BSA人工抗原和尿酸-OVA包被抗原的制備本發(fā)明中尿酸-BSA人工抗原的制作過(guò)程如下200mg BSA、IOOmg尿酸半抗原和IOOmg碳化二亞胺(EDC)分別溶于5mL、2mL和3mL的PBS中，然后向BSA溶液中邊攪拌邊慢慢滴加2mL的尿酸半抗原溶液和2mL的EDC溶液，于4°C冰浴下遮光攪拌反應(yīng)4h，再向混和溶液中滴加剩下的ImL EDC溶液，繼續(xù)于4°C冰浴下遮光攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后以4000r/min離心5min，取上清液裝入透析袋，于O. Olmol/L、pH7. 4的磷酸緩沖液中4°C下透析5d，每天更換2次透析液。透析完畢分裝，-20°C下冷凍保存。本發(fā)明中尿酸-OVA包被抗原的制作過(guò)程同尿酸-BSA人工抗原的制作過(guò)程。實(shí)施例3尿酸抗體的制備及純化本發(fā)明中尿酸抗體的制備過(guò)程如下尿酸抗血清的制備選3只3月齡、體重1. 5 2. Okg的健康雄性新西蘭大白兔，免疫前I周，于兔耳緣靜脈采血留作陰性對(duì)照。將一定量的尿酸-BSA人工抗原同等量的弗氏完全佐劑充分乳化后進(jìn)行第I次基礎(chǔ)免疫，于兔背部多點(diǎn)注射，每兔注射ImL ;半月后再 進(jìn)行第2次基礎(chǔ)免疫，劑量與第I次基礎(chǔ)免疫相同。以后每2個(gè)星期進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，劑量加倍，于兔背部和大腿肌肉處交叉進(jìn)行。從第4次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫后I星期，于兔耳緣靜脈采血測(cè)抗體效價(jià)。當(dāng)效價(jià)達(dá)到要求時(shí)對(duì)兔子進(jìn)行心臟取血，于4°C下靜置過(guò)夜，3000r/min離心5min,取血清分裝,于_20°C下保存。尿酸抗體的粗制備取5mL尿酸抗血清加5mL生理鹽水，逐滴加入2. 5mL飽和(MM)2SO4溶液，使(MM)2SO4飽和終濃度達(dá)到20%，邊加邊攪拌，充分混勻后靜置30min。3000r/min,離心20min，棄去沉淀。將上清夜轉(zhuǎn)至小燒杯中繼續(xù)加飽和飽和(MM)2SO4溶液，使其飽和終濃度為50%，攪拌3h。3000r/min，離心20min，棄上清。沉淀用5mL生理鹽水溶解，再加逐滴加入2. 5mL飽和(MM)2SO4溶液，使其終濃度為33%，充分混勻后靜置30min。3000r/min,離心20min，棄上清，重復(fù)一次。2. 5mL生理鹽水溶解沉淀并透析除鹽(48h，中間換液3次)。以11^BaCl2檢測(cè)透析液至無(wú)SO廣。離心去沉淀，上清液即為粗提尿酸IgG抗體。尿酸抗體的純化采用protein G蛋白親和純化柱(Amersham Bioscience公司)進(jìn)一步純化抗體。粗提抗體于20mmol/L PBS (pH7. O)緩沖液中透析過(guò)夜。以此緩沖液平衡protein G柱(流速為lmL/min),將透析后的粗提抗體載入柱中，以O(shè). lmol/L甘氨酸溶液(pH 2.7)洗滌柱子，收集樣品并加入等體積lmol/L Tris-HCl (pH9. 0)。15% PEG 20000濃縮至原體積。實(shí)施例4膠體金尿酸抗體探針的制備本發(fā)明中膠體金尿酸抗體探針的制備過(guò)程如下量取膠體金50mL，將膠體金調(diào)節(jié)pH7. 3，攪拌下加入尿酸抗體1. 3mg,繼續(xù)攪拌30min，加入 20% 的 PEG 終止反應(yīng)，10000r/min 離心 lOmin，沉淀物用 0. 02mol/L Na2B4O7 溶液(含1% BSA,0.01% NaN3)稀釋，4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例5速測(cè)試紙條的組裝本發(fā)明中尿酸抗體膠體金速測(cè)試紙條的組裝過(guò)程如下硝酸纖維素膜的處理由25mmX 30cm硝酸纖維素膜切割而成，分為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線),兩線距離為5mm。將濃度為lmg/mL的尿酸-OVA包被抗原液放于X_only單向噴點(diǎn)儀貯存池A，將濃度為lmg/mL的羊抗兔抗體液放于貯存池B，開機(jī)后將尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗體分別點(diǎn)射于膜中央，自然干燥密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 樣品墊由17mmX30cm的纖維素膜切割而成，經(jīng)緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,O. 25% Triton X-100,0. 15mmol/L NaCl, pH 8. O)浸泡，室溫干燥，密封保存。金標(biāo)墊由8mm X 30cm的玻璃棉膜切割而成，將金標(biāo)適體和金標(biāo)質(zhì)控序列用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃棉上，37°C干燥，密封，4°C保存。吸收墊由20mmX 30cm的纖維素膜切割而成。背板為涂有膠層的白色塑料板。組裝及切割將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次貼在背板上，相互之間存在2mm重疊，放入CM 4000切割機(jī)槽內(nèi)，切割成長(zhǎng)為60mm寬為5mm的試紙條(圖1)，注明日期和批次，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例6速測(cè)試紙條的使用使用人可自行采集尿液(尿液量> 100 UL即可)，將速測(cè)試紙條的樣品墊端分別浸入尿液中，靜置5 lOmin，觀察速測(cè)試紙條上的紅色T線是否出現(xiàn)，出現(xiàn)紅色T線表明尿中尿酸含量正常，不出現(xiàn)紅色T線表明尿中尿酸含量超標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)尿液中尿酸的免疫膠體金試紙，包括背板及硝酸纖維素膜，其特征在于尿酸-OVA抗原作為試紙檢測(cè)線T線，羊抗兔抗體作為試紙質(zhì)控線C線，C線與T線均噴涂于硝酸纖維素膜上，并在硝酸纖維素膜的T線側(cè)疊加粘貼膠體金標(biāo)墊，膠體金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜的C線側(cè)分別疊加粘貼樣品墊和吸收墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于所述的膠體金標(biāo)墊由特異識(shí)別尿酸的兔源抗體所修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊及吸收墊，依次粘貼在涂有膠層的白色塑料背板上，壓緊后切割成條狀。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的膠體金試紙，其特征在于所述試紙可直接用于尿液中尿酸的檢測(cè)。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述試紙的制備方法，包括以下步驟 (1)通過(guò)尿酸半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，獲得尿酸-BSA人工抗原； (2)將尿酸-BSA人工抗原免疫兔子，免疫后取兔血獲得抗血清并純化抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗體對(duì)尿酸分子的特異性，得到尿酸抗體； (3)利用膠體金標(biāo)記上述尿酸抗體，制備膠體金抗體探針液，通過(guò)浸泡玻璃棉膜，得到膠體金墊； (4)將尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗體，分別噴涂于硝酸纖維素膜上； (5)將硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊以及吸收墊，依次粘貼在涂有膠層的白色塑料背板上，壓緊后切割成條狀。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)尿液中尿酸含量的試紙及其制造方法。這種試紙采用尿酸抗體作為特異性識(shí)別元件，采用金納米顆粒作為試紙條顯色試劑，其中尿酸-OVA抗原作為試紙檢測(cè)線(T線)，羊抗兔抗體作為試紙質(zhì)控線(C線)，C線與T線均噴涂于硝酸纖維素膜上，并在硝酸纖維素膜的T線側(cè)疊加粘貼膠體金標(biāo)墊，膠體金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜的C線側(cè)分別疊加粘貼樣品墊和吸收墊。本發(fā)明提供的試紙能隨時(shí)快速檢測(cè)尿液中尿酸濃度。
文檔編號(hào)G01N33/544GK102998443SQ20111027013
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者邱洪斌, 張強(qiáng), 沙靖全, 高志剛, 關(guān)寶生 申請(qǐng)人:佳木斯大學(xué)