專利名稱：蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口腔色素清除模型，具體地涉及一種蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型及其制備方法。
背景技術(shù)：
以往在去除口腔色素的研究中，方法是選取發(fā)生表面著色的天然牙或在離體牙表面形成外源性著色層，通過高濃度的過氧化物進行漂白處理或應(yīng)用美白牙膏、義齒清潔劑等物理、化學(xué)的方法，清除牙面及修復(fù)體表面的著色層?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點在于無法對牙面或修復(fù)體表面色素膜的形成及清除過程進行實時監(jiān)測，而且通過物理、化學(xué)的方法進行著色層的清除，雖然對清除色素有一定的效果，但同時也對牙齒表面的牙釉質(zhì)層造成了不同程度的機械磨損和脫礦，導(dǎo)致難以恢復(fù)的損害。 其主要原因是美白牙膏中的化學(xué)成分(過氧化物)或牙膏中的機械摩擦顆粒，在色素清除過程中會導(dǎo)致牙面發(fā)生物理、化學(xué)性損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服背景技術(shù)以上缺點，提供一種牙和修復(fù)材料表面的著色生物膜體外模型；建立蛋白酶清除色素生物膜的分子生物學(xué)體外模型。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，包括如下步驟(1)自組裝蛋白質(zhì)通過11-巰基-11烷酸溶液修飾、1、3_ 二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(MB)活化石QCM-D或SI3R芯片，再將唾液吸附于QCM-D或sra芯片上，乙醇胺鹽酸溶液封閉，從而形成自組裝的蛋白膜；(2) QCM-D或SI3R監(jiān)測色素-唾液生物膜的形成將待研究的色素吸附于自組裝有蛋白膜的QCM-D或Sra芯片表面，并在QCM-D或SI3R上原位、實時和動態(tài)監(jiān)測色素與生物芯片上的蛋白質(zhì)的吸附和解吸附反應(yīng)，建立牙和修復(fù)材料表面的著色生物膜模型；(3)蛋白酶水解色素生物膜通過蛋白酶催化降解吸附于蛋白膜上的各種天然色素?；蛘邔⑵湎扔谏刈饔糜赒CM-D或sra芯片表面，考察其預(yù)防色素附著的功能，監(jiān)測其在不同的濃度、PH、溫度、離子強度等條件下催化降解色素生物膜的過程和效率。在本發(fā)明的較佳實施例中，還包括步驟(4)色素吸附及水解前后的表征通過使用傅立葉變換紅外光譜，檢測色素吸附及水解前后紅外譜圖的變化，以及芯片表面蛋白質(zhì)及色素官能團的改變情況。在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟⑴中11-巰基-11烷酸溶液濃度為8-12mM，活化芯片時間為10-15分鐘。在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(1)所述的活化為通入體積比為1-2 1-2的 0. 1-0. 3MEDC 和 0. 05-0. 15M NHS 混合溶液活化 QCM 或 SPR 芯片 5_15min。
更佳地，步驟(1)中，通入體積比為1 1的0. 2M EDC和0. IM NHS混合溶液，活化芯片IOmin0在本發(fā)明的較佳實施例中，所述的乙醇胺鹽酸溶液濃度為0. 8-1. 5M，pH為8_9。在本發(fā)明的較佳實施例中，所述的唾液為人體唾液或人工合成唾液。所述的色素為天然色素或人工色素。所述的色素選擇和研究項目有關(guān)，可以根據(jù)研究課題定。在本發(fā)明的較佳實施例中，所述色素為天然色素，為類胡蘿卜素、四吡咯衍生物、 類黃酮中的至少一種。在本發(fā)明的較佳實施例中，所述的蛋白酶包括胃蛋白膜、胰蛋白膜、組織蛋白膜、 木瓜蛋白膜以及枯草桿菌蛋白膜等，其種類數(shù)量根據(jù)研究課題需要，可以是一種或多種。在本發(fā)明的實施例中，該蛋白酶為木瓜蛋白酶。一種蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型，包括QCM-D 或 SPR;在QCM-D或SPR的芯片表面形成的自組裝蛋白膜；待研究的色素，其結(jié)合于蛋白膜上；以及待研究的蛋白酶。本發(fā)明首先利用11-巰基-11烷酸溶液活化芯片，利用它的自組裝作用，可以在芯片表面形成分子膜，之后再添加EDC和NHS，后兩者的基團一部分與11-巰基-11烷酸結(jié)合，另一部分與蛋白質(zhì)的基團結(jié)合，由于都是化學(xué)基團之間的結(jié)合，使得本發(fā)明制得的蛋白質(zhì)膜非常穩(wěn)定。本發(fā)明在石英晶體微天平OiCM-D)或表面等離子體共振儀(SPR)的芯片表面形成自組裝的蛋白膜(如唾液)，建立起了口腔蛋白質(zhì)生物膜的體外模型。隨后加入常用食用色素化合物，在QCM和sra上原位、實時和動態(tài)監(jiān)測色素與生物芯片上的蛋白質(zhì)的吸附和解吸附反應(yīng)，建立牙和修復(fù)材料表面的著色生物膜模型，研究色素與蛋白質(zhì)之間相互作用的機制，探索色素導(dǎo)致人然牙和人工材料表面發(fā)生著色的機理。進而通過蛋白酶(如木瓜蛋白酶等)，催化降解吸附的蛋白/色素膜，考察不同實驗條件下生物蛋白酶降解色素的效率，探索不同實驗條件下生物蛋白酶的生物活性，從而可以篩選出安全、有效的生物蛋白酶水解色素生物膜的最佳實驗條件。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代物理化學(xué)固體表面吸附理論；分子生物學(xué)理論(靜電吸附理論、 離子鍵和共價鍵學(xué)說、疏水性和親水性理論、蛋白質(zhì)熒光猝滅理論、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)理論)；現(xiàn)代檢測技術(shù)(消散因子石英晶體微天平OiCM-D)技術(shù)、表面等離子體共振(SPR)技術(shù)、傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)蛋白質(zhì)檢測技術(shù)、熒光猝滅(Fluorescence Quenching, FQ)技術(shù))，分析色素的化學(xué)功能團與唾液蛋白質(zhì)肽鏈之間的相互作用機制，研究化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)水解酶(如木瓜蛋白酶)在不同生理條件下水解色素-生物膜的過程和效率，為清除口腔外源性色素生物膜，提供安全、有效的生物學(xué)方法。本專利所建立的監(jiān)測蛋白酶清除色素生物膜的方法，能夠十分便利的原位、實時、 動態(tài)觀察不同蛋白酶對各種色素生物膜的水解效率。為不同蛋白酶針對靶向色素生物膜的降解，提供關(guān)鍵技術(shù)。由于QCM-D和Sra均為一種高度靈敏的檢測分析儀器，其檢測精度分別達到納克級(10_9)和皮克級(10_12)，因此該體外模型的建立可對色素生物膜在牙面或修復(fù)體表面的形成過程進行原位、實時、動態(tài)的監(jiān)測。可以進一步研究色素生物膜形成及水解清除過程的生物學(xué)機制。由于蛋白酶水解清除色素的過程是一種具有無毒、無害、無損傷特征的生物學(xué)行為，對天然牙面及修復(fù)體表面不會產(chǎn)生物理、化學(xué)性損傷，是一種安全、有效地清除牙面或修復(fù)體表面形成的色素生物膜的生物學(xué)方法，能夠最大限度地降低牙刷和牙膏對于牙齒或材料表面的物理機械損傷。


圖1本發(fā)明實施例一中不同溫度、pH值和離子強度與唾液蛋白膜表面色素吸附量的關(guān)系，其中圖IA :pH值與色素吸附量；圖IB 溫度與色素吸附量；圖IC 離子強度與色素吸附量?！?”示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)圖2.本發(fā)明實施例一中三種條件下木瓜蛋白酶吸附和水解全唾液膜的頻率和厚度與時間的變化。C:在pH 6. 9、離子強度5mM和25°C時；B:在pH 5. 9、離子強度IOmM和 25°C時；A 在pH 6. 9、離子強度IOmM和時。
具體實施例方式實施例一、QCM-D芯片1.自組裝蛋白膜通入IOmM 11-巰基-11烷酸溶液Iml活化芯片IOmin ；再加入 ImL的體積比為1 1的0. 2M EDC和0. IM NHS混合溶液，活化QCM-D芯片lOmin。注入ImL 的蛋白質(zhì)溶液至吸附達到穩(wěn)態(tài)，該蛋白質(zhì)為人體唾液，再注入IM pH 8. 5的乙醇胺鹽酸溶液 lmL，維持封閉lOmin。乙醇胺可以封閉蛋白質(zhì)表面的非特異性結(jié)合位點。排空乙醇胺，并通入20mM pH 2. O的鹽酸溶液以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。至此，在活化的芯片表面形成了由蛋白膜(如唾液)組裝的生物膜。2.色素-唾液生物膜的形成在通入色素之前，保持持續(xù)通入緩沖液。在25°C， PH7.0，離子強度為IOmM PBST的條件下，從樣本入口處注入濃度梯度為0. 06，0. 09，0. 12， 0. 15，0. ISmM的茶黃素(矢車菊素、姜黃素)溶液，直至有色素溶液從管口末端溢出。調(diào)節(jié)注射泵的速度為0. lmL/min，使色素溶液經(jīng)樣本環(huán)路到達測量池，與固定于芯片上的蛋白質(zhì)生物膜(如唾液膜)相互作用，等待色素的吸附達到穩(wěn)態(tài)，至此就在芯片表面形成色素-唾液生物膜。3.木瓜蛋白酶活力的測定以酪蛋白為底物，測量木瓜蛋白酶的活性。一個單位的木瓜蛋白酶被定義為在40°C和pH 7. 5條件下每分鐘酪氨酸形成的量。4.蛋白酶水解色素生物膜當(dāng)色素生物膜形成穩(wěn)定后，注入不同濃度(0.5、1.0、 5.0、12. 5和SOyg/ml)的木瓜蛋白酶溶液，反應(yīng)時間為20min，進樣流速為8 μ L/s.同理， 監(jiān)測其在不同的 ρΗ(6· 0、6· 8、7· 4)、溫度(25,30,35°C )、離子強度(2. 5,5. 0、10、12· 5、25、 50mM)條件下催化降解色素生物膜的過程和效率。5.蛋白酶對色素生物膜形成的預(yù)防作用在以上相應(yīng)條件下(濃度、pH、溫度、離子強度)，將蛋白酶先于色素溶液作用于蛋白膜表面，之后再通入相應(yīng)的色素溶液，進而考察其預(yù)防色素附著的功能。6.色素吸附及水解前后的表征通過使用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)，檢測色素吸附及水解前后紅外光譜譜圖的變化，以及芯片表面蛋白質(zhì)酰胺帶及色素特征性官能團的改變情況。7.部分實驗數(shù)據(jù)見圖1和圖2。實施例二、QCM-D芯片1.自組裝蛋白膜通入8mM 11-巰基-11烷酸溶液Iml活化芯片12min ；再通入 ImL的體積比為2 1的0. 2M EDC和0. IM NHS混合溶液，活化QCM-D芯片lOmin。注入 ImL的蛋白質(zhì)溶液至吸附達到穩(wěn)態(tài)，該蛋白質(zhì)為人體唾液，再注入1. 2M pH 8. O的乙醇胺鹽酸溶液lmL，維持封閉lOmin。乙醇胺可以封閉蛋白質(zhì)表面的非特異性結(jié)合位點。排空乙醇胺，并通入20mM pH 2. O的鹽酸溶液以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。至此，在活化的芯片表面形成了由蛋白膜(如唾液)組裝的生物膜。2.色素-唾液生物膜的形成在通入色素之前，保持持續(xù)通入緩沖液。在25°C， PH7.0，離子強度為IOmM PBST的條件下，從樣本入口處注入濃度梯度為0. 06，0. 09，0. 12， 0. 15，0. ISmM的茶黃素(矢車菊素、姜黃素)溶液，直至有色素溶液從管口末端溢出。調(diào)節(jié)注射泵的速度為0. lmL/min，使色素溶液經(jīng)樣本環(huán)路到達測量池，與固定于芯片上的蛋白質(zhì)生物膜(如唾液膜)相互作用，等待色素的吸附達到穩(wěn)態(tài)，至此就在芯片表面形成色素-唾液生物膜。3.木瓜蛋白酶活力的測定以酪蛋白為底物，測量木瓜蛋白酶的活性。一個單位的木瓜蛋白酶被定義為在40°C和pH 7. 5條件下每分鐘酪氨酸形成的量。4.蛋白酶水解色素生物膜當(dāng)色素生物膜形成穩(wěn)定后，注入不同濃度(0.5、1.0、 5.0、12. 5和SOyg/ml)的木瓜蛋白酶溶液，反應(yīng)時間為20min，進樣流速為8 μ L/s.同理， 監(jiān)測其在不同的 ρΗ(6· 0、6· 8、7· 4)、溫度(25,30,35°C )、離子強度(2. 5,5. 0、10、12· 5、25、 50mM)條件下催化降解色素生物膜的過程和效率。5.蛋白酶對色素生物膜形成的預(yù)防作用在以上相應(yīng)條件下(濃度、pH、溫度、離子強度)，將蛋白酶先于色素溶液作用于蛋白膜表面，之后再通入相應(yīng)的色素溶液，進而考察其預(yù)防色素附著的功能。6.色素吸附及水解前后的表征通過使用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)，檢測色素吸附及水解前后紅外光譜譜圖的變化，以及芯片表面蛋白質(zhì)酰胺帶及色素特征性官能團的改變情況。實施例三SPR芯片1.自組裝蛋白膜通入12mM 11-巰基-11烷酸溶液Iml活化芯片Snin ；再通入 ImL的體積比為1 2的0. 3M EDC和0. 15M NHS混合溶液，活化SPR芯片lOmin。注入ImL 的蛋白質(zhì)溶液至吸附達到穩(wěn)態(tài)，該蛋白質(zhì)為人工合成唾液，再注入IM pH 8. 5的乙醇胺鹽酸溶液lmL，維持封閉lOmin。排空乙醇胺，并通入20mM pH 2. O的鹽酸溶液以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。至此，在活化的芯片表面形成了由蛋白膜(如唾液)組裝的生物膜。2.色素-唾液生物膜的形成在通入色素之前，保持持續(xù)通入緩沖液。在25°C， PH7.0，離子強度為IOmM PBST的條件下，從樣本入口處注入濃度梯度為0. 06，0. 09，0. 12， 0. 15，0. ISmM的茶黃素(矢車菊素、姜黃素)溶液，直至有色素溶液從管口末端溢出。調(diào)節(jié)注射泵的速度為0. lmL/min，使色素溶液經(jīng)樣本環(huán)路到達測量池，與固定于芯片上的蛋白質(zhì)生物膜(如唾液膜)相互作用，等待色素的吸附達到穩(wěn)態(tài)，至此就在芯片表面形成色素-唾液生物膜。3.木瓜蛋白酶活力的測定以酪蛋白為底物，測量木瓜蛋白酶的活性。一個單位的木瓜蛋白酶被定義為在40°C和pH 7. 5條件下每分鐘酪氨酸形成的量。4.蛋白酶水解色素生物膜當(dāng)色素生物膜形成穩(wěn)定后，注入不同濃度(0.5、1.0、 5.0、12. 5和SOyg/ml)的木瓜蛋白酶溶液，反應(yīng)時間為20min，進樣流速為8 μ L/s.同理， 監(jiān)測其在不同的 ρΗ(6· 0、6· 8、7· 4)、溫度(25,30,35°C )、離子強度(2. 5,5. 0、10、12· 5、25、 50mM)條件下催化降解色素生物膜的過程和效率。5.蛋白酶對色素生物膜形成的預(yù)防作用在以上相應(yīng)條件下(濃度、pH、溫度、離子強度)，將蛋白酶先于色素溶液作用于蛋白膜表面，之后再通入相應(yīng)的色素溶液，進而考察其預(yù)防色素附著的功能。6.色素吸附及水解前后的表征通過使用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)，檢測色素吸附及水解前后紅外光譜譜圖的變化，以及芯片表面蛋白質(zhì)酰胺帶及色素特征性官能團的改變情況。
權(quán)利要求
1.一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，包括如下步驟(1)自組裝蛋白質(zhì)通過11-巰基-11烷酸溶液修飾、1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺活化QCM-D或SI3R芯片，再將唾液吸附于QCM-D或 SI^R芯片上，乙醇胺鹽酸溶液封閉，從而形成自組裝的蛋白膜；(2)QCM-D或Sra監(jiān)測色素-唾液生物膜的形成將待研究的色素吸附于自組裝有蛋白膜的QCM-D或SI3R芯片表面，并在QCM-D或SI3R上原位、實時和動態(tài)監(jiān)測色素與生物芯片上的蛋白質(zhì)的吸附和解吸附反應(yīng)，建立牙和修復(fù)材料表面的著色生物膜模型；(3)蛋白酶水解色素生物膜通過蛋白酶催化降解吸附于蛋白膜上的各種天然色素。 或者將其先于色素作用于QCM-D或sra芯片表面，考察其預(yù)防色素附著的功能，監(jiān)測其在不同的濃度、PH、溫度、離子強度等條件下催化降解色素生物膜的過程和效率。
2.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于，還包括步驟(4)色素吸附及水解前后的表征通過使用傅立葉變換紅外光譜，檢測色素吸附及水解前后紅外譜圖的變化，以及芯片表面蛋白質(zhì)及色素官能團的改變情況。
3.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于，步驟(1)中11-巰基-11烷酸溶液濃度為8-12mM，活化芯片時間為10-15 分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于，步驟(1)中，通入體積比為1-2 1-2的0. 1-0. 3M EDC^PO. 05-0. 15M NHS 混合溶液活化QCM或SI3R芯片5-15min。
5.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于，步驟(1)中，通入體積比為1 1的0. 2M EDC^PO. IM NHS混合溶液，活化芯片IOmin0
6.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于，所述的乙醇胺鹽酸溶液濃度為0. 8-1. 5M，pH為8-9。
7.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于所述的唾液為人體唾液或人工合成唾液。
8.如權(quán)利要求1所述的一種建立蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型的方法，其特征在于所述色素為類胡蘿卜素、四吡咯衍生物、類黃酮中的至少一種。
9.如權(quán)利要求1所述的一種蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型，其特征在于所述的蛋白酶包括胃蛋白膜、胰蛋白膜、組織蛋白膜、木瓜蛋白膜以及枯草桿菌蛋白膜。
10.一種蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型，包括QCM-D 或 SPR ；在QCM-D或SPR的芯片表面形成的自組裝蛋白膜；待研究的色素，其結(jié)合于蛋白膜上；以及待研究的蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了蛋白酶清除口腔色素生物膜的分子生物學(xué)模型及其制備方法，本發(fā)明在QCM-D或SPR的芯片表面形成自組裝的蛋白膜，建立起了口腔蛋白質(zhì)生物膜的體外模型；隨后加入常用食用色素化合物，在QCM和SPR上原位、實時和動態(tài)監(jiān)測色素與生物芯片上的蛋白質(zhì)的吸附和解吸附反應(yīng)，建立牙和修復(fù)材料表面的著色生物膜模型，研究色素與蛋白質(zhì)之間相互作用的機制，探索色素導(dǎo)致人然牙和人工材料表面發(fā)生著色的機理。進而通過蛋白酶(如木瓜蛋白酶等)，催化降解吸附的蛋白/色素膜，考察不同實驗條件下生物蛋白酶降解色素的效率，探索不同實驗條件下生物蛋白酶的生物活性，從而可以篩選出安全、有效的生物蛋白酶水解色素生物膜的最佳實驗條件。
文檔編號G01N33/68GK102409078SQ20111027369
公開日2012年4月11日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者姚江武 申請人:姚江武