專利名稱：基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜的類黃酮代謝輪廓分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是ー種基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-Chip/MS)的大豆類黃酮代謝輪廓分析的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代分析化學(xué)發(fā)展的ー個(gè)重要方向就是發(fā)展微量化、集成化的分離分析新方法。為了提高分析的靈敏度和通量，降低分析成本和樣本消耗量，發(fā)展微量化、集成化的分析方法已成為當(dāng)前研究的前沿領(lǐng)域。納流液相色譜技術(shù)是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來(lái)的ー門技術(shù)，因其具有樣本消耗小、分析速度快和易集成化的優(yōu)點(diǎn)吸引了研究者的廣泛關(guān)注，成為微型化分析領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。最近出現(xiàn)的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-Chip/MS)把納流液相系統(tǒng)的樣本濃縮和分離功能與電噴霧質(zhì)譜儀中使用的復(fù)雜連接和噴霧器無(wú)縫地整合在一起，大幅度降低了泄漏和系統(tǒng)無(wú)效體積，簡(jiǎn)化了工作流程，提高了分析的靈敏度和 可靠性。目前LC-Chip/MS技術(shù)已被用于蛋白質(zhì)組、寡糖等研究，其易操作、靈敏度高及樣本消耗量少的特點(diǎn)在代謝組學(xué)研究方面亦有很大優(yōu)勢(shì)，但迄今為止基于LC-Chip/MS的代謝組學(xué)輪廓分析技術(shù)鮮見報(bào)道。類黃酮是廣泛分布于植物中的一大類衍生化合物，目前已知的類黃酮化合物有3000-4000種，其中食品中的主要類黃酮大致分為四類，分別為黃烷酮、黃酮、黃酮醇和異黃酮。目前研究較多的是大豆中的異黃酮，其作為大豆生長(zhǎng)過(guò)程中的一類次生代謝產(chǎn)物，因具有預(yù)防癌癥、心血管疾病及骨質(zhì)疏松癥等生理功能而備受關(guān)注。除異黃酮外，大豆中的其他黃酮類化合物也具有不同的生理功能，如對(duì)其含量及分布進(jìn)行研究，并與代謝途徑相關(guān)聯(lián)，則可以獲取更加全面、完整的信息。到目前為止，對(duì)大豆中黃酮類物質(zhì)分析的文獻(xiàn)報(bào)道大都局限于測(cè)定某幾個(gè)黃酮類代謝物或水解后的總黃酮含量，僅有的幾篇輪廓分析的報(bào)道也需要二次提取及純化過(guò)程。而相對(duì)快速的提取及分析不僅可以減小人力物力的消耗，而且可以大大提高分析的通量。LC-Chip/MS分析系統(tǒng)作為儀器微型化的代表，除可以減小進(jìn)樣量外，其關(guān)鍵組成部分-芯片也具有較強(qiáng)的靈活性，我們采用訂制的高富集容量芯片不僅可以大幅度提高檢測(cè)靈敏度，簡(jiǎn)化樣品預(yù)處理過(guò)程，在優(yōu)化的分離分析條件下還可實(shí)現(xiàn)更多黃酮類化合物的分離分析。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)不同種植環(huán)境及遺傳背景的大豆樣本進(jìn)行分析為大豆類黃酮的進(jìn)ー步研究提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立ー種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜方法，使預(yù)處理過(guò)程更為簡(jiǎn)單，樣品用量更少，并可獲得更多黃酮類代謝物信息。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜(LC-Chip/MS)方法(I)加入提取液的大豆種子樣本超聲離心后，上清液直接上樣分析，樣品預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)須富集等預(yù)處理過(guò)程；(2)上清液直接上樣分析，采用高富集容量芯片及優(yōu)化的分離分析條件，可實(shí)現(xiàn)更多黃酮類化合物的輪廓分析，I U L樣品在22分鐘內(nèi)可獲得大豆中73種黃酮類化合物的代謝輪廓；高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、長(zhǎng)150mm分析柱及噴針組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通過(guò)六通閥相連，噴針固接于分析柱
的一端。具體步驟如下，(I)稱取一定量的大豆種子樣本 于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標(biāo)柚皮素、異槲皮苷及蘆丁各0. 5-2 u g/mL的提取溶劑(含甲醇10-30%的水溶液)，超聲10-20分鐘后離心，將上清液移至進(jìn)樣瓶中用于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析。(2)LC-Chip/MS分析方法的具體參數(shù)為本分析最終選用的是高富集容量芯片，該芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 y mX 150mm)及噴針(10 y m ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 (5 y m)。富集柱和分析柱通過(guò)六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接ロ①④相連，分析柱的一端與六通閥的接ロ③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接ロ②作為流動(dòng)相端、其通過(guò)nano泵與流動(dòng)相A和B相連，六通閥的接ロ⑥廢液端、即廢液出ロ端，六通閥的接ロ⑤作為試樣端、其通過(guò)毛細(xì)管泵與洗脫液和試樣存儲(chǔ)容器相連。富集時(shí)，芯片通過(guò)毛細(xì)管泵接通試樣端和廢液端引入試樣存儲(chǔ)容器中的樣品并在富集柱上實(shí)現(xiàn)富集，此時(shí)六通閥的接ロ⑤、④、①、⑥依次連通，試樣端洗脫液為含體積2%的こ腈水；樣品分析時(shí)，通過(guò)nano泵接通流動(dòng)相端和分析柱，樣品進(jìn)入分析通道，此時(shí)六通閥的接ロ②、①、④、③依次連通；分析流動(dòng)相A為含體積0. 1%甲酸的水溶液，B為含體積
0.I % 甲酸的 ZJ青；梯度洗脫條件=Omin 時(shí) 90/10 (A/B, V/V)，13min 時(shí) 70/30 (A/B, V/V)，18min 時(shí) 5/95 (A/B，V/V)并保持 4min，22. Imin 時(shí) 90/10 (A/B，V/V)，隨后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)平衡8min ;其中0_13min為第一段線性梯度洗脫、13_18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第三段梯度洗脫；毛細(xì)管泵的流速為4-6 V- L/min, nano泵的流速0. 3-0. 6 u L/min ;進(jìn)樣量為
0.1-1 U L，進(jìn)樣后富集柱沖洗體積為3-4 y L ;分析柱的柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，采用正離子模式檢測(cè)；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細(xì)管電壓為1800-1900V ;Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100 1000 ;在上述條件下可獲得大豆類黃酮的代謝輪廓譜，即大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖(圖I)。本發(fā)明具有的效果是樣本的儲(chǔ)存、預(yù)處理及分析均采用自主建立的標(biāo)準(zhǔn)化程序，避免引入人為誤差。所采用的預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要二次富集及純化，可避免目的化合物的部分損失，同時(shí)減小了預(yù)處理過(guò)程誤差，保證了分析方法的穩(wěn)定性。采用微型化分析儀器及自主訂制的高容量富集芯片，在優(yōu)化的分析條件下節(jié)省了分析時(shí)間和樣品用量，提高了分析通量，與預(yù)處理過(guò)程相結(jié)合可鑒定更多的目標(biāo)化合物。另外，采用不同類型的內(nèi)標(biāo)及質(zhì)量控制樣本校正預(yù)處理過(guò)程和實(shí)驗(yàn)中儀器響應(yīng)微小漂移帶來(lái)的誤差，進(jìn)ー步確保了該方法的穩(wěn)定性。對(duì)樣本中9個(gè)特征離子的方法重復(fù)性考察結(jié)果見表1，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為I. 50-7. 66%,進(jìn)ー步證明了本專利所闡述方法的穩(wěn)定性。


圖I大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖(A)及典型離子的EIC圖⑶。圖2不同種植地點(diǎn)大豆樣本的PLS-DA得分圖。每個(gè)點(diǎn)表示ー 個(gè)樣本，t表示樣本在主成分投影值。 :種植地點(diǎn)濟(jì)南，▲:種植地點(diǎn)吉林。 圖3為本發(fā)明中高富集容量芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖中I洗脫液，2廢液，3富集柱，4流動(dòng)相，5分析柱，6噴針。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II.大豆種子樣本采集5個(gè)大豆品種分別為吉育73、長(zhǎng)農(nóng)16、九農(nóng)30、荷豆12、中黃13。其中吉育73、長(zhǎng)農(nóng)16和九農(nóng)30的種植地點(diǎn)為吉林。荷豆12和中黃13的種植地點(diǎn)為濟(jì)南。大豆種子樣本采集后放在_80°C冰箱保存。2.分析方法2. I大豆種子樣本預(yù)處理大豆種子樣本從_80°C冰箱中取出，在干燥器中等待其溫度恢復(fù)至室溫。將每種大豆種子樣本放在粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)60目篩，得到粒徑均一的粉末。將大豆種子粉末分裝至塑料管中，備用。稱取5個(gè)品種大豆種子樣本各3份(姆份0. Ig),分別置于5mL玻璃管中。稱取每種大豆種子樣本0. 5g，混合均勻，作為質(zhì)量控制(QC)樣本。然后稱取QC樣本6份(姆份0. Ig),分別置于5mL玻璃管中。稱取內(nèi)標(biāo)柚皮素0. 4mg及異槲皮苷、蘆丁各I. 6mg于I. 5mL離心管中，加入ImL乙腈。斡旋，超聲，使之完全溶解，獲得濃度分別為柚皮素0. 4mg/mL、異槲皮苷I. 6mg/mL、蘆丁I. 6mg/mL的混標(biāo)溶液。取IOmL 7欠，39. 95mL甲醇，超聲混勻作為提取溶剤，向提取溶劑中加入上述混標(biāo)溶液50 u L，混勻后共50mL提取溶剤。向每個(gè)玻璃管中加入2mL提取溶劑，超聲20分鐘。取出ImL移至eppendorf管中，于4°C，14000rpm下離心10分鐘，將上清液移至進(jìn)樣瓶。2. 2芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析如圖3所示，高富集容量芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 V- mX 150mm)及噴針(10 y m ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為ZorbaxSB-C18(80A, 5iim)。富集柱和分析柱通過(guò)六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接ロ①④相連，分析柱的一端與六通閥的接ロ③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接ロ②作為流動(dòng)相端、其通過(guò)nano泵與流動(dòng)相A和B相連，六通閥的接ロ⑥廢液端、即廢液出ロ端，六通閥的接ロ⑤作為試樣端、其通過(guò)毛細(xì)管泵與洗脫液和試樣存儲(chǔ)容器相連；芯片通過(guò)毛細(xì)管泵接通試樣端和廢液端引入樣品(試樣存儲(chǔ)容器)并在富集柱上實(shí)現(xiàn)富集，此時(shí)六通閥的接ロ⑤、④、①、⑥依次連通，試樣端洗脫液為含體積2%的こ腈水；樣品分析時(shí)，通過(guò)nano泵接通流動(dòng)相端和分析柱，樣品進(jìn)入分析通道，此時(shí)六通閥的接ロ②、①、④、③依次連通。分析流動(dòng)相A為含體積0.1%甲酸的水溶液，B為含體積0.1%甲酸的こ臆。梯度洗脫條件(其中0-13min為第一段線性梯度洗脫、13-18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第三段梯度洗脫)0min時(shí)90/10 (A/B, V/V)，13min時(shí) 70/30 (A/B, V/V)，18min 時(shí) 5/95 (A/B, V/V)并保持 4min, 22. Imin 時(shí) 90/10 (A/B, V/V)，隨后起始梯度90/10 (A/B，V/V)平衡8min。毛細(xì)管泵的流速為4 y L/min，nano泵的流速
0.30 u L/min ;進(jìn)樣量為I y L，進(jìn)樣后富集柱沖洗體積為4 y L，分析采用反沖模式以減小譜帶展寬；柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ES I)，采 用正離子模式檢測(cè)；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶剤，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細(xì)管電壓為1800-1900V ;Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/zlOO 1000。在上述條件下可獲得大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖。15個(gè)大豆種子樣本的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜分析順序?yàn)殡S機(jī)進(jìn)行，在分析過(guò)程中,先將QC樣進(jìn)樣一次，然后每分析3個(gè)樣本后，再將QC樣進(jìn)樣一次，通過(guò)保證QC樣本保留時(shí)間和響應(yīng)信號(hào)的重現(xiàn)性，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果提示，整個(gè)分析時(shí)間內(nèi)QC樣本的重復(fù)性良好，沒有出現(xiàn)明顯的組分變化，保留時(shí)間沒有出現(xiàn)飄移，表I和表2為方法重復(fù)性和儀器精密度的考察結(jié)果。3.模式識(shí)別及標(biāo)志物篩選為了考察不同種植地點(diǎn)的大豆類黃酮代謝輪廓差別，我們采用定性分析軟件(MassHunter Qualitative Analysis)對(duì)所有大豆種子樣本的黃酮類化合物進(jìn)行峰提取形成ー個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，即把每個(gè)樣本的測(cè)量數(shù)據(jù)匹配成ー張由保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)和峰面積構(gòu)成的峰表，同時(shí)通過(guò)總峰面積歸ー化來(lái)減少系統(tǒng)誤差。然后利用SMCA-P 11.5(Umetrics,Umea, Sweden)進(jìn)行 PLS-DA 分析。非參數(shù)檢驗(yàn)采用 SPSS 13. 0 (SPSS Inc. , Chicago, IL)進(jìn)行。圖2是不同種植地點(diǎn)大豆的PLS-DA得分圖。從中可知，9個(gè)種植地點(diǎn)為吉林的大豆樣本和6個(gè)種植地點(diǎn)為濟(jì)南的大豆樣本的投影在第一主成分上可以得到很好的分離，表明不同種植地點(diǎn)的大豆樣本的類黃酮代謝輪廓存在明顯的區(qū)別。將VIP > I. 0的信息提取并進(jìn)行獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)的變量(P < 0. 05)認(rèn)為是對(duì)分類有重要貢獻(xiàn)的化合物，它們分別是 glycitein 0-hexoside，genistein 0-hexoside，daidzeinO-hexosidemalonylated, daidzein 0-hexoside malonylated 等黃酮類物質(zhì)(表3)。基于本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)不同品種及遺傳背景的大豆樣本中的類黃酮做進(jìn)ー步分析，為其深入研究提供依據(jù)。表I大豆類黃酮LC-Chip/MS分析方法的重復(fù)性考察(n = 4)
權(quán)利要求
1.基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜的類黃酮代謝輪廓分析方法，其特征在于 (I)加入提取液的大豆種子樣本超聲離心后，上清液直接上樣分析；(2)上清液直接上樣分析，高富集容量芯片分離分析條件高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、長(zhǎng)150_分析柱及噴針組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通過(guò)六通閥相連，噴針固接于分析柱的一端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于步驟(I)中稱取大豆種子樣本于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標(biāo)柚皮素、異槲皮苷及蘆丁各O. 5-2μ g/mL的提取溶劑，提取溶劑為含甲醇10-30%的水溶液，超聲10-20分鐘后離心，上清液用于LC-Chip/MS分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于 富集柱和分析柱通過(guò)六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接口①④相連，分析柱的一端與六通閥的接口③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接口②作為流動(dòng)相端、其通過(guò)nano泵與流動(dòng)相A和B相連，六通閥的接口⑥廢液端、即廢液出口端，六通閥的接口⑤作為試樣端、其通過(guò)毛細(xì)管泵與洗脫液和試樣存儲(chǔ)容器相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于 步驟(2)選用的是高富集容量芯片，該芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75μπι)、分析柱(75ymX150mm)及噴針(ΙΟμπι ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為ZorbaxSB-C18(80A,5um)； 富集時(shí)，芯片通過(guò)毛細(xì)管泵接通試樣端和廢液端引入試樣存儲(chǔ)容器中的樣品并在富集柱上實(shí)現(xiàn)富集,此時(shí)六通閥的接口⑤、④、①、⑥依次連通,試樣端洗脫液為含體積2%的乙腈水； 樣品分析時(shí)，通過(guò)nano泵接通流動(dòng)相端和分析柱，樣品進(jìn)入分析通道，此時(shí)六通閥的接口②、①、④、③依次連通；分析流動(dòng)相A為含體積O. 1%甲酸的水溶液，B為含體積O. 1%甲酸的乙腈；梯度洗脫條件=Omin 時(shí) 90/10 (A/B, V/V)，13min 時(shí) 70/30 (A/B, V/V)，18min 時(shí)5/95 (A/B,V/V)并保持 4min，22. Imin 時(shí) 90/10 (A/B，V/V)，隨后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)；其中0-13min為第一段線性梯度洗脫、13_18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第二段梯度洗脫； 毛細(xì)管泵的流速為4-6 μ L/min, nano泵的流速O. 3-0. 6 μ L/min ;進(jìn)樣量為O. 1-1 μ L,進(jìn)樣后富集柱沖洗體積為3-4 μ L ;分析柱的柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)； 質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，采用正離子模式檢測(cè)；使用高純?chǔ)?輔助噴霧電離與脫溶齊U，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細(xì)管電壓為1800-1900V ;質(zhì)量掃描范圍m/Z 100 1000 ;在上述條件下可獲得大豆類黃酮的代謝輪廓譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜方法，采用簡(jiǎn)單的樣本預(yù)處理方法，在高富集容量芯片及優(yōu)化的分離分析條件下，微小進(jìn)樣量即可實(shí)現(xiàn)73種黃酮類化合物的輪廓分析。本發(fā)明的分析方法簡(jiǎn)單、快速，樣本用量小且重復(fù)性好，適合于實(shí)際樣本的批量分析。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102768246SQ20111027378
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者吳澤明, 周佳, 常玉瑋, 許國(guó)旺, 趙春霞, 路鑫 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所