專(zhuān)利名稱：一種HCV核酸適配體及其在制備HCV-cAg檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝炎病毒核酸適配體及其應(yīng)用，尤其涉及一種丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體及其在制備丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)感染引起的，已成為全球性嚴(yán)重的衛(wèi)生問(wèn)題和健康難題。HCV為嗜肝性慢性病毒，經(jīng)HCV感染后的患者臨床癥狀極不典型，容易造成漏診。與乙肝相比，丙肝更易發(fā)生慢性化，且易早期出現(xiàn)肝硬化、肝癌，死亡率較高，因此HCV的檢測(cè)對(duì)丙型肝炎病毒感染的早期診斷和指導(dǎo)臨床治療有重大的意義。目前用于HCV感染診斷的兩項(xiàng)主要指標(biāo)為抗-HCV檢測(cè)和HCV RNA檢測(cè)，抗-HCV檢測(cè)存在大約70d的“窗口期”(即從病毒感染起至可以檢測(cè)出該病毒標(biāo)準(zhǔn)物之前的時(shí)期)， 這一時(shí)期具有很強(qiáng)的感染性，在此時(shí)期進(jìn)行輸血、注射等都極有可能造成HCV感染，從而引起疾病的傳播，此外該方法也不能用于丙肝患者的療效監(jiān)測(cè)；而HCVRNA在晚期肝病患者中含量很少，往往檢測(cè)不到，且該方法技術(shù)和環(huán)境要求較高，其應(yīng)用受到很大的限制。2001年 Ortho公司推出了檢測(cè)HCV核心抗原ELISA試劑盒，2005年湖南景達(dá)制藥有限公司推出了 HCV游離核心抗原檢測(cè)試劑盒，該試劑盒操作簡(jiǎn)易，對(duì)人員、儀器的要求較為簡(jiǎn)單，但是一旦體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，血清中的抗原、抗體便形成了抗原-抗體復(fù)合物，其檢測(cè)的靈敏度便會(huì)大大降低。鑒于此，開(kāi)發(fā)一種快速、操作簡(jiǎn)單易用、檢測(cè)靈敏度高的方法在臨床診斷中具有十分重要的意義。近年來(lái)，核酸適配體(aptamer)技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展。核酸適配體是指通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX)技術(shù)從人工合成的DNA文庫(kù)中篩選得到的能與相應(yīng)配體專(zhuān)一性緊密結(jié)合的一類(lèi)單鏈寡核苷酸序列。它分子量小，這段序列可以是RNA，修飾RNA，ssDNA或dsDNA，它具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識(shí)別能力，更容易進(jìn)行修飾和標(biāo)記，更加穩(wěn)定，且易與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合。適配體富集作用強(qiáng)，可捕捉到血清中微量的疾病靶標(biāo)標(biāo)志物，通過(guò)酶標(biāo)記抗體的信號(hào)放大程序，實(shí)現(xiàn)了對(duì)感染性疾病的快速、靈敏、特異性檢測(cè)，并且還可完成多指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)，故在疾病的診斷上有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體及其在制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體，其特征在于，所述適配體的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。進(jìn)一步的，上述適配體連接或標(biāo)記了生物素或熒光素。
本發(fā)明所述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體在制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。其中所述HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒由如下組分構(gòu)成96人份抗HCV-cAg單克隆抗體酶標(biāo)板1塊，陰性對(duì)照1瓶，陽(yáng)性對(duì)照1瓶，樣品稀釋液1瓶，生物素標(biāo)記HCV-cAg寡核苷酸適配體(Bio-HCV-cAg aptamer)稀釋液1瓶，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(Avi-HRP)稀釋液1瓶，洗滌液1瓶，顯色劑Al瓶，顯色劑Bl瓶，終止液1瓶，說(shuō)明書(shū)1份，不干膠封片3片。上述酶標(biāo)板為透明聚苯乙烯96或48孔酶標(biāo)板，且其各孔包被有濃度為5ug/ml的包被抗體(所述包被抗體包含HCV核心區(qū)2 180氨基酸位置)，包被緩沖液為pH4. 7 4. 9醋酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)簧锼貥?biāo)記HCV-cAg寡核苷酸適配體(Bio-HCV-cAg aptamer)稀釋液為標(biāo)記上了生物素的丙型肝炎病毒核心抗原寡核苷酸序列的溶液；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(Avi-HRP)稀釋液為做了相適稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素(Avi-HRP)； 顯色體系為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)體系。本發(fā)明的丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體可以捕獲溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，也可以檢測(cè)溶液中丙型肝炎病毒的核心蛋白，利用其制備的HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒可以克服現(xiàn)有的檢測(cè)方法的缺陷，提高檢測(cè)的靈敏度，且操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，周期短，極有利于丙型肝炎血清學(xué)診斷和血液篩查。綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的核酸適配體及利用其制備的HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒還具有以下突出優(yōu)點(diǎn)1、使用HCV-cAg aptamer取代了抗一HCV-cAg 二抗，具有以下優(yōu)勢(shì)1)HCV-cAg aptamer通過(guò)體外篩選過(guò)程進(jìn)化，不依靠動(dòng)物、細(xì)胞及內(nèi)環(huán)境，易于獲得；2)aptamer篩選周期更短，篩選過(guò)程自動(dòng)化，能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，節(jié)約成本；3) aptamer較抗體更為穩(wěn)定，具有較高的特異性和親和力，重復(fù)性好，可有效降低實(shí)際生產(chǎn)中批次間的差異。2、本發(fā)明使用BA-ELISA進(jìn)行檢測(cè)，該方法利用了生物素-親和素系統(tǒng) (Biotin-Avidin System BAS)，可以進(jìn)一步放大檢測(cè)信號(hào)，與aptamer的聯(lián)合使用，可檢出 pg/ml級(jí)的核心抗原，極大的提高了丙肝核心抗原檢測(cè)試劑盒的靈敏度，對(duì)于窗口期感染者的早期診斷具有重要的臨床診斷意義，也預(yù)示著良好的應(yīng)用前景。


圖lHCV-cAg抗原核酸檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法(ELISA法)檢測(cè)原理示意圖1為ELISA酶標(biāo)板；2為抗HCV-cAg單克隆包被抗體；3為捕獲的HCV-cAg ；4為 Bio-HCV-cAg aptamer ；5為生物素；6為HRP底物顯色反應(yīng)；7為親和素；8為HRP辣根過(guò)氧化物酶。 圖2HCV_cAg適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(DNAsis軟件分析)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體的篩選及確定依據(jù)公開(kāi)的丙型肝炎病毒核心抗原蛋白氨基酸序列(重點(diǎn)是HCV核心區(qū)2 180 氨基酸)，以常規(guī)方法設(shè)計(jì)隨機(jī)核苷酸文庫(kù)，進(jìn)行丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體的篩選和優(yōu)化，最終確定丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體寡核苷酸序列如下(以SEQ ID No. 1所示)agcagcatga agtcatcgtt gatgttgctg ttatggtagc atgttgcagg tggtatcaac 60ggagtagctg cacacatgtc acctactgca acc93進(jìn)一步的，將上述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體寡核苷酸分子用 DNAsis軟件分析，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2所示。實(shí)施例2丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸適配體在制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成96人份抗HCV-cAg單克隆抗體酶標(biāo)板1塊，陰性對(duì)照1瓶，陽(yáng)性對(duì)照1瓶，樣品稀釋液1瓶，生物素標(biāo)記HCV-cAg寡核苷酸適配體(Bio-HCV-cAg aptamer)稀釋液1瓶，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(Avi-HRP)稀釋液1瓶，洗滌液1瓶，顯色劑Al瓶，顯色劑Bl瓶，終止液1瓶，說(shuō)明書(shū)1份，不干膠封片3片。上述丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒的制備及實(shí)際應(yīng)用1、選聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板，包被抗HCV-cAg單克隆抗體制成檢測(cè)酶標(biāo)板抗體檢測(cè)板的最佳制備條件為，使用包被單克隆抗體以最佳包被抗體濃度(5ug/ ml)，用pH4. 7 4. 9醋酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)靠准?00 μ 1于檢測(cè)板孔內(nèi)，置4°C 16小時(shí)以上。棄去包被液，用PBST洗滌液充分洗滌各孔，每次300 μ 1/孔，隨之拍干。加入封閉液， 200 μ 1/孔，4°C封閉16小時(shí)以上，隨后棄去封閉液拍干，室溫(不高于25°C )干燥4小時(shí)。 干燥后的酶標(biāo)板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存于2-8°C。2、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的制備陽(yáng)性對(duì)照為從HCV感染者靜脈采血后分離血清，經(jīng)EIA和分片段確認(rèn)HCV四種 (HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原均陽(yáng)性；經(jīng)PCR法測(cè)定HCV為陽(yáng)性，抗HIV、HBsAg為陰性，60°C 水浴1小時(shí)后除菌過(guò)濾，-20°C保存。陰性對(duì)照為正常獻(xiàn)血員血清，經(jīng)HCV四種(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原分別檢測(cè)均為陰性、抗HIV、HBsAg及TP亦為陰性的人血清，除菌過(guò)濾后-20°C保存。3、Bio-HCV_cAg aptamer 的制備生物素標(biāo)記HCV-cAg寡核苷酸適配體序列如下5 ‘ -Biotin-AGCAGCATGAAGTCATCGTTGATGTTGCTGTTATGGTAGCATGTTGCAGGTGGTATCA ACGGAGTAGCTGCACACATGTCACCTACTGCAACC-3'以上Bio-HCV-cAg aptamer由上海生物工程有限公司合成。4、Avi-HRP稀釋液的配制鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(Avi-HRP)購(gòu)于南京賽泓瑞生物科技有限公 1 500 1 2000，用 PBST 稀釋 1000 倍。
司，效價(jià)5、HCV-cAg樣品稀釋液、濃縮洗滌液的配制
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒核心抗原核酸適配體，其特征在于，所述適配體的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒核心抗原核酸適配體，其特征在于，所述適配體連接或標(biāo)記了生物素或熒光素。
3.權(quán)利要求1或2所述丙型肝炎病毒核心抗原核酸適配體在制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種丙型肝炎病毒核心抗原核酸適配體，其中所述適配體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)了所述丙型肝炎病毒核心抗原核酸適配體在制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。利用本發(fā)明所述適配體及其制備HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒可檢出pg/ml級(jí)的核心抗原，極大的提高了丙肝核心抗原檢測(cè)試劑盒的靈敏度，對(duì)于窗口期感染者的早期診斷具有重要的臨床診斷意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102433339SQ20111027497
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者丁興龍, 張?jiān)鳆? 朱之煒, 李夫東, 江長(zhǎng)林, 王佳穎, 王恒, 鄭祖惠, 韓娟 申請(qǐng)人:山東萊博生物科技有限公司