專利名稱：金核/鉑殼納米棒模擬酶溶液的用途及檢測過氧化氫、葡萄糖和膽固醇的方法
金核/鉑殼納米棒模擬酶溶液的用途及檢測過氧化氫、葡 萄糖和膽固醇的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及金核/鉬殼納米棒模擬酶 溶液用作催化劑的用途以及一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液直接檢測過氧化氫或 通過檢測中間產(chǎn)物過氧化氫間接檢測其他物質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供水溶性葡萄 糖和脂溶性膽固醇的檢測方法。
背景技術(shù)：
因高效率和高選擇性的催化活性，天然酶在生物化學(xué)領(lǐng)域扮演著重要角色。但天 然酶在儲存、運(yùn)輸和使用過程中容易受到外在物理、化學(xué)因素的影響，如溫度、PH值等，而變 性失活。此外，天然酶的價格相對昂貴且制備純化繁瑣。這些缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用范圍。因 此，開發(fā)具有酶特征活性、結(jié)構(gòu)比天然酶更穩(wěn)定的模擬酶在化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域 也是極其重要的。
近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)在體相中呈現(xiàn)化學(xué)惰性的金屬化合物在納米尺度下表現(xiàn) 出新穎的類過氧化物酶活性。這些納米顆粒在不同pH和不同溫度下表現(xiàn)出比辣根過氧 化物酶更加穩(wěn)定的催化特征，是一類新型模擬酶。中國科學(xué)院生物物理研究所閻錫蘊(yùn)研 究小組發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵納米顆粒具有類過氧化物酶催化活性；并利用這一特性，設(shè)計了 兩種免疫檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對乙肝病毒表面抗原和肌鈣蛋白的檢測(L. Z. Gao，J. Zhuang, L. Nie, J. B. Zhang, Y. Zhang, N. Gu, T. Wang, J. Feng, D. L. Yang, S. Perrett, X. Y. Yan, Nature Nanotechnology, 2007, 2, 577-583)。隨后，汪爾康等人利用四氧化三鐵納米顆粒類過氧 化物酶特性，實(shí)現(xiàn)了對過氧化氫和葡萄糖的檢測(H. Wei, E. K. Wang, Anal. Chem. 2008,80, 2250-2254)。之后，氧化石墨烯也被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化物酶特性，并成功用于模型體系葡萄 糖的檢測。與上述納米顆粒不同的是，我們最近的研究工作表明，貴金屬納米顆粒(如鉬) 具有類過氧化物酶和氧化酶雙重活性。與其他只具有單一類酶活性的納米顆粒相比，雙功 能活性的模擬酶具有更多的優(yōu)勢。(W. W. He，Y. liu, J. S. Yuan, J. J. Yin, X. C. Wu, X. N. Hu, K. Zhang, J. B. Liu, C. Y. Chen, Y. L. Ji, Y. T. Guo, Biomaterials. 2011，32，1139-1147)通常， 對于具體的測試樣品，如血液中，還存在有其他還原性的干擾物質(zhì)，如尿酸、維生素C、膽紅 素和谷胱甘肽等，它們可消耗H2O2，將其還原為H2O,這樣就會影響下一步的顯色反應(yīng)，使實(shí) 際測得的吸光度下降，致使結(jié)果偏低。而金核/鉬殼納米結(jié)構(gòu)類氧化酶活性可以用來預(yù)處 理待測試樣本，從而顯著降低樣本中還原性物質(zhì)的干擾(見實(shí)施例)。因此，與其他類過氧 化物酶活性的納米顆粒相比，本發(fā)明利用金核/鉬殼納米結(jié)構(gòu)的雙功能酶特性，可預(yù)先消 除還原性物質(zhì)(如抗壞血酸等)對檢測的干擾，提供了一種抗還原性物質(zhì)干擾的檢測方法。
對類過氧化物酶活性，底物之一是過氧化氫，因而可以用來直接檢測過氧化氫。此 外，許多生化反應(yīng)的中間產(chǎn)物涉及到過氧化氫，因而可以通過檢測過氧化氫間接檢測其他 物質(zhì)，從而搭建一個基于與過氧化氫產(chǎn)生相關(guān)的其它物質(zhì)的檢測平臺。在本專利中，我們以 水溶性葡萄糖和脂溶性膽固醇作為兩類典型的檢測實(shí)例。葡萄糖是動、植物體內(nèi)的主要組成部分，葡萄糖濃度的測定在食品分析質(zhì)量監(jiān)控、生物化學(xué)和臨床化學(xué)中都占有很重要的 地位。膽固醇是體內(nèi)其它所有類固醇的前體，例如糖皮質(zhì)類固醇、性激素、膽汁酸和維生素 D，血液中膽固醇的含量是用于診斷冠心病、動脈硬化、腦血栓和其他多種疾病的重要參數(shù)。 葡萄糖和膽固醇在其特定氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，從而可以通過兩步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)其特 異性檢測。目前常用的檢測葡萄糖或膽固醇法的方法之一是基于葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)或膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,CHOD)的特異性催化氧化反應(yīng)結(jié)合 過氧化物酶(peroxidase, POD)催化氧化顯色底物的方法。首先利用GOD催化葡萄糖氧化 成葡萄糖酸或CHOD催化膽固醇氧化成膽留-4-烯-3-酮，同時產(chǎn)生H2O2, H2O2在過氧化物 酶催化下氧化無色的還原型色原生成有色的氧化型色素，然后根據(jù)氧化型色素在特定波長 的吸光度求出樣品中葡萄糖或膽固醇的含量。但天然酶對熱敏感、穩(wěn)定性差、來源有限以及 受催化條件局限等缺點(diǎn)限制了它們的廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用金核/鉬殼納米棒模擬酶，避免了非水溶劑對天然酶活性的影響，實(shí) 現(xiàn)了對非水溶性的物質(zhì)一膽固醇的檢測，并得到了與水溶性物質(zhì)相同的線性檢測區(qū)間。
本發(fā)明的一個目的是，提供金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液作為類過氧化物酶或類 氧化酶用作催化劑的用途。
本發(fā)明的另一個目的是，提供基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液檢測過氧化氫的 方法，該方法可用于過氧化氫的比色檢測，從5 X 10_5到I X 10_3mol/L濃度范圍內(nèi)對過氧化 氫檢測呈現(xiàn)好的線性響應(yīng)。
本發(fā)明的再一目的是，提供基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液并結(jié)合葡萄糖氧化 酶來比色檢測葡萄糖的方法，該方法可實(shí)現(xiàn)抗維生素C干擾的葡萄糖的靈敏、特異檢測，該 方法對于葡萄糖比色檢測的線性響應(yīng)范圍為5X 10_5到4X 10_4mol/L。
本發(fā)明的再一目的是，提供基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液并結(jié)合膽固醇氧化 酶來比色檢測膽固醇的方法，該方法可完成膽固醇的靈敏、特異檢測，該方法對于膽固醇比 色檢測的線性響應(yīng)范圍為3X 10_5到3X 10_4mol/L。
在本說明書中，術(shù)語“類過氧化物酶”指顯示出過氧化物酶的催化活性的物質(zhì)。具 體地，本發(fā)明的類過氧化物酶催化氧化還原反應(yīng)，并以過氧化物作為電子受體，從而氧化底 物。
在本說明書中，術(shù)語“類氧化酶”指顯示出氧化酶的催化活性的物質(zhì)。具體地，本 發(fā)明的類氧化酶催化氧化還原反應(yīng)，并以分子氧作為電子受體，氧化底物。
在本說明書中，術(shù)語“ABTS”是化合物“2，2' —聯(lián)氮一雙(3 —乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸)二銨鹽”的縮寫名稱，但二者互換地使用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液作為類過氧化物酶或類氧化酶用作催 化劑的用途。
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定過氧化氫含量的方法， 該方法包括以金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液為催化劑，使鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫水溶 液反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，測定生成的有色物質(zhì)，以確定過氧化氫的含量。
優(yōu)選地，所述金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的濃度為O. 033 O. 133nM，優(yōu)選為 O.033nMo
優(yōu)選地，所述鄰苯二胺(OPD)的濃度為ImM 3. 3mM,優(yōu)選為3. 3mM。
優(yōu)選地，所述反應(yīng)是在pH值為3. 5 6. 5，優(yōu)選為4. 5，反應(yīng)溫度為30°C 70°C， 優(yōu)選為37°C，反應(yīng)時間為10 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘的條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選地，檢測的過氧化氫含量的線性范圍是5Χ1(Γ5 lXl(T3mol/L，優(yōu)選為 5 X 10 5 6 X 10 4mol/L0
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液抗維生素C干擾測定葡萄糖的方法，該方法包括以葡萄糖氧化酶為催化劑使葡萄糖氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)以上所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定葡萄糖的含量。
優(yōu)選地，檢測的葡萄糖含量的線性范圍是5X 10_5 4X 10_4mol/L。
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定膽固醇的方法，該方法包括以膽固醇氧化酶為催化劑使膽固醇氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)以上所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定膽固醇的含量。
優(yōu)選地，檢測的膽固醇含量的線性范圍是3X 1(Γ5 3Χ l(T4mol/L
以下將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明提供金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液作為類過氧化物酶或類氧化酶用作催化劑的用途。
本發(fā)明的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液含有一種由圓柱狀金納米棒內(nèi)核和包覆于所述圓柱狀金納米棒內(nèi)核外表面的島狀多孔鉬殼層構(gòu)成的金核/鉬殼結(jié)構(gòu)。
所述的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的制備方法可以包括如下步驟
I)制備金晶種溶液
向十六烷基三甲基溴化銨水溶液加入四氯金酸水溶液，然后在攪拌的條件下再加入硼氫化鈉水溶液，制得第一混合溶液；
所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化銨、四氯金酸和硼氫化鈉的質(zhì)量配比為O. 75 O. 0025 0.006;繼續(xù)攪拌第一混合溶液3分鐘，然后靜置2 5小時，得到含金晶種的金晶種溶液，該金晶種溶液中金濃度為O. 25mM ；
2)制備金納米棒溶液
向十六烷基三甲基溴化銨水溶液中依次加入四氯金酸水溶液、硝酸銀水溶液和硫酸水溶液；混合均勻后再加入抗壞血酸水溶液，然后向其中加入步驟(I)制備的金晶種溶液，制得第二混合液；再將所述第二混合溶液置入30°C恒溫水浴中水浴12 16小時，得到含金納米棒的金納米棒溶液；
所述第二混合液中的十六烷基三甲基溴化銨、四氯金酸、硝酸銀、硫酸、抗壞血酸與金晶種的質(zhì)量配比為 5 O. 025 O. 0025 O. 0075 O. 5 O. 04 O. 000015 ；
3)制備純化的金納米棒溶液
將步驟2)制備的金納米棒溶液經(jīng)離心分離，得到純化的金納米棒溶液，并通過加入去離子水，控制純化的金納米棒溶液中金納米棒的濃度為O. 5mM ；
4)制備金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液
將步驟3)得到的純化的金納米棒溶液與四氯亞鉬酸鉀溶液混合并搖勻，再加入抗壞血酸水溶液得第三混合溶液；所述第三混合溶液中的抗壞血酸、四氯亞鉬酸鉀與金納 米棒的質(zhì)量配比為5 20 I 3 10;
將上述混合均勻的第三混合溶液置入30 V的恒溫水浴中反應(yīng)2 3小時，溶液由 棗紅色變成了暗灰色；之后再向第三溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨水溶液，并使加入 十六烷基三甲基溴化銨后的溶液中的十六烷基三甲基溴化銨濃度為O. 03M ;然后再進(jìn)行離 心分離，得到金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液；
5)金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的改性
將步驟4)得到的金核/鉬殼納米棒模擬溶液在每分鐘12000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速下離心分 離5分鐘，棄去上清液，向沉淀中加入與上清液等體積的改性溶液，所述改性溶液由濃度為 lmg/mL的聚苯乙烯磺酸鈉溶液和濃度為3. OmM的氯化鈉溶液組成的混合液；再將所述混合 液進(jìn)行超聲10 25分鐘，然后靜置3 10小時，得到改性的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶 液；
6)改性的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的純化
將步驟5)制得的改性的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液，在每分鐘12000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn) 速下尚心分尚5分鐘,棄去尚心分尚后的上清液,加入與上清液等體積的去尚子水,分散均 勻，得到經(jīng)純化的改性的金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液。
所述十六烷基三甲基溴化銨水溶液的濃度為O.1M ;所述四氯金酸水溶液的濃度 為24. 7mM ;所述硼氫化鈉水溶液的濃度為O. OlM ;所述硝酸銀水溶液的濃度為IOmM ;所述 硫酸水溶液的濃度為O. 5M ;所述抗壞血酸水溶液的濃度為O.1M ;所述四氯亞鉬酸鉀的濃度 為 2. OmM。
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定過氧化氫含量的方法， 該方法包括以金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液為催化劑，使鄰苯二胺(OPD)或2，2' —聯(lián)氮 一雙(3—乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和過氧化氫水溶液反應(yīng)，產(chǎn)生有色或 發(fā)光物質(zhì)，測定生成的有色或發(fā)光物質(zhì)，以確定過氧化氫的含量。
優(yōu)選地，所述金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的濃度為O. 033 O. 133nM，優(yōu)選為 O. 033nMo
優(yōu)選地，所述鄰苯二胺(OPD)的濃度為ImM 3. 3mM,優(yōu)選為3. 3mM。
優(yōu)選地，所述反應(yīng)是在pH值為3. 5 6. 5，優(yōu)選為4. 5，反應(yīng)溫度為30°C 70°C， 優(yōu)選為37°C，反應(yīng)時間為10 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘的條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選地，檢測的過氧化氫含量的線性范圍是5 X 10_51 X 10_3mol/L，優(yōu)選為 5 X 10 5 6 X 10 4mol/L0
該檢測方法的反應(yīng)原理如下
金核/鉑殼納米棒模擬酶 鄰苯二胺+過氧化氫- 2,2’-二氣基偶氮苯+水
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用金核/鉬殼納米棒模擬酶比色測定過氧化氫的 步驟如下
(I)取2. 8ml O.1M pH 4. 5的磷酸緩沖溶液，依次向其中加入鄰苯二胺(OPD)、金 核鉬殼納米棒模擬酶溶液和過氧化氫水溶液，并使鄰苯二胺的濃度為3. 3mM，金核鉬殼納米棒模擬酶的濃度為O. 033nM ;然后將上述溶液混合均勻；所述混合溶液中固定金核/鉬殼納米棒模擬酶與鄰苯二胺的摩爾比為1: 4X IO9 ;只改變加入過氧化氫水溶液的濃度為0， O. 05，O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1,2,4,5,10，50，100，IOOOmM ；
(2)將步驟⑴中所得混合液在37°C水浴中反應(yīng)30分鐘；
(3)取100 μ I終止液(10Μ H2SO4和O. 5Μ Na2SO3)加入到步驟(2)中所得混合液；
(4)用紫外-可見吸收分光光度計測定上述混合溶液紫外吸收光譜。
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定葡萄糖的方法，該方法包括以葡萄糖氧化酶為催化劑使葡萄糖氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)以上所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定葡萄糖的含量。
優(yōu)選地，檢測的葡萄糖含量的線性范圍是5 X 1(Γ5 4Χ l(T4mol/L。
該檢測方法的反應(yīng)原理如下
葡萄糖氧化酶氧氣+葡萄糖- 過氧化氫+葡萄糖酸
金核/鉑殼納米棒模擬酶鄰苯二胺+過氧化氫- 2,2’-二氣基偶氮苯+水
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用金核/鉬殼納米棒模擬酶并結(jié)合葡萄糖氧化酶來比色檢測葡萄糖的步驟如下
(I)取500ml IOmM pH = 7. O的磷酸緩沖溶液中，向其中加入20 μ I 10mg/mL的葡萄糖氧化酶和待測的葡萄糖磷酸緩沖溶液，然后將上述溶液混合均勻，于37°C反應(yīng)30 分鐘，得到葡萄糖反應(yīng)液；所述混合溶液中只改變加入葡萄糖磷酸緩沖溶液的濃度為0， O. 05，O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8, l,2mM ；
(2)取2. 4ml O.1M pH 4. 5的磷酸緩沖溶液，依次加入鄰苯二胺(OPD)、金核鉬殼納米棒模擬酶溶液，并使鄰苯二胺的濃度為3. 3mM,金核鉬殼納米棒模擬酶的濃度為 O. 033nM，以及上述步驟(I)的葡萄糖反應(yīng)液中；所述混合溶液中固定金核/鉬殼納米棒模擬酶與鄰苯二胺的摩爾比為1: 4X109;
(3)將步驟⑵中所得混合液在37 °C水浴中反應(yīng)30分鐘；
(4)取100 μ I終止液(10Μ H2SO4和O. 5Μ Na2SO3)加入到步驟(2)中所得混合液；
(5)用紫外-可見吸收分光光度計測定上述混合溶液紫外吸收光譜。
本發(fā)明還提供一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定膽固醇的方法，該方法包括以膽固醇氧化酶為催化劑使膽固醇氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)以上所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定膽固醇的含量。
優(yōu)選地，檢測的膽固醇含量的線性范圍是3Χ 1(Γ5 3Χ l(T4mol/L。
該檢測方法的反應(yīng)原理如下
權(quán)利要求
1.金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液作為類過氧化物酶或類氧化酶用作催化劑的用途。
2.一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定過氧化氫含量的方法，該方法包括以金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液為催化劑，使鄰苯二胺(OPD)或2，2' —聯(lián)氮一雙(3—乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和過氧化氫水溶液反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，測定生成的有色物質(zhì)，以確定過氧化氫的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液的濃度為 O. 033 O. 133nM，優(yōu)選為 O. 033nM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述鄰苯二胺(OPD)的濃度為ImM 3.3mM，優(yōu)選為 3. 3mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)是在pH值為3.5 6.5，優(yōu)選為4. 5，反應(yīng)溫度為30°C 70°C，優(yōu)選為37°C，反應(yīng)時間為10 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘的條件下進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項所述的方法，其特征在于，檢測的過氧化氫含量的線性范圍是 5X10—5 lXl(T3mol/L，優(yōu)選為 5 X 1(Γ5 6 X l(T4mol/L。
7.一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定葡萄糖的方法，該方法包括以葡萄糖氧化酶為催化劑使葡萄糖氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定葡萄糖的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，檢測的葡萄糖含量的線性范圍是5Χ1(Γ5 4Xl(T4mol/L。
9.一種基于金核/鉬殼納米棒模擬酶溶液測定膽固醇的方法，該方法包括以膽固醇氧化酶為催化劑使膽固醇氧化生成過氧化氫，然后根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法來測定過氧化氫的含量，從而確定膽固醇的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，檢測的膽固醇含量的線性范圍是3Χ1(Γ5 3Xl(T4mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及金核/鉑殼納米棒模擬酶溶液的用途及檢測過氧化氫、葡萄糖和膽固醇的方法。本發(fā)明檢測過氧化氫的方法包括以金核/鉑殼納米棒模擬酶溶液為催化劑，使鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫水溶液反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，測定生成的有色物質(zhì)，以確定過氧化氫的含量。本發(fā)明檢測葡萄糖或膽固醇的方法包括以葡萄糖氧化酶或膽固醇氧化酶為催化劑使葡萄糖或膽固醇氧化生成過氧化氫，然后再檢測生成的過氧化氫的含量，從而確定葡萄糖或膽固醇的含量。本發(fā)明的方法簡單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且高效。
文檔編號G01N33/52GK102998413SQ201110275358
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉建波, 吳曉春 申請人:國家納米科學(xué)中心