專利名稱：一種檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，具體涉及了一種基于胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)錯(cuò)配與目標(biāo)汞離子(T-Hg2+-T)的特異性識(shí)別作用，利用兩種DNA修飾的納米金(DNAl-AuNPs與DAN2_AuNPs)作為信號(hào)放大元件而形成三維“漁網(wǎng)型”結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感策略高靈敏度檢測(cè)水體中汞離子的方法。
背景技術(shù)：
汞是一種對(duì)環(huán)境和人體有極大危害的物質(zhì)。汞污染主要來自電廠、氯堿、塑料、電池、電子等工業(yè)排放的廢水。汞有3種價(jià)態(tài)，其中水體中汞主要以二價(jià)形式存在。目前汞的檢測(cè)主要依賴于分析儀器，如高效液相色譜、感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜以及原子吸收光譜等。近年來，基于胸腺嘧啶錯(cuò)配與Hg2+的特異性識(shí)別與電化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展了一系列DNA電化學(xué)生物傳感器，而納米金顆粒作為一種新型的納米材料，憑借其獨(dú)特的物理化學(xué)特性，如高比表面積、高表面反應(yīng)活性等，在材料科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域均獲得廣泛的應(yīng)用。功能化的納米金可負(fù)載大量的單鏈DNA，用于捕捉富集水溶液中的汞離子， 起到信號(hào)放大作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種“漁網(wǎng)型”汞離子電化學(xué)生物傳感原理定性定量檢測(cè)水體中汞離子的方法。此方法使用兩種不同的DNA功能性納米金(DNAl-AuNPs與 DAN2-AuNPs)作為電信號(hào)放大元件，利用胸腺嘧啶-汞離子-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)的特異性識(shí)別來捕捉并富集汞離子，形成一種三維“漁網(wǎng)型”結(jié)構(gòu)，高靈敏度檢測(cè)目標(biāo)離子。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)制備納米金溶液。(2)用含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)錯(cuò)配的DNAl和DNA2序列修飾步驟(1)的納米金溶液，得到DNA功能性納米金溶液(命名為DNAl-AuNPs和DNAl-AuNPs)。(3)將與DNAl序列含有T-T錯(cuò)配的cDNA修飾于金電極上制得cDNA修飾電極。(4)得到汞離子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線將cDNA修飾電極放置于含有梯度濃度Hg2+的 DNAl-AuNPs溶液中反應(yīng)后，再加入DNA2_AuNPs溶液反應(yīng)后，用超純水清洗cDNA修飾電極后將其放置于含有的Ru (NH3) 63+溶液中進(jìn)行電化學(xué)掃描，得到不同濃度汞離子對(duì)應(yīng)的DPV峰電流；使用DPV峰電流作為縱坐標(biāo)，汞離子濃度為橫坐標(biāo)，繪制汞離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(5)定性定量檢測(cè)樣品水體中的汞離子。其中，本發(fā)明步驟(1)所述的納米金溶液的制備方法應(yīng)理解是現(xiàn)有技術(shù)中任意的納米金溶液的制備方法。本發(fā)明步驟(2)所述的含有T-T錯(cuò)配的DNAl和DNA2序列應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何相互之間能含有T-T錯(cuò)配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T雙鏈的DNA序列；同理，步驟(3)所述的與DNAl序列含有T-T錯(cuò)配的cDNA序列應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任意與DNAl相互之間能含有T-T錯(cuò)配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T雙鏈的cDNA序列；因此DNAl和DNA2序列、cDNA序列的設(shè)計(jì)相互關(guān)聯(lián)配對(duì)，其三者的錯(cuò)配原理如圖1和圖2所示。例如，本發(fā)明的 DNA1、DNA2 和 cDNA 設(shè)計(jì)為
確定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) X Cm1 (DNA2)的組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)cDNA_DNAl_DNA2的 T-T錯(cuò)配的序列；其中η為cDNA的個(gè)數(shù)，m為DNA2的個(gè)數(shù) 設(shè)計(jì)1
DNAl:HS-5'-(CH2)6-TCTGCT CTTGTTCCTΓ-3' cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTTGGTTC ATGTGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTATGGAACTTGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTTCTAGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTAGGTTCTTGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTACTTGTGCDNA2HS-5-(CH2) 6-AAGGTT CATGTGCTGT-3 HS-5'-(CH2)6-TTGGATCTAGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-ATGGTTCTAGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-ATGGTACTTGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AAGGTTCTAGTGCTGT-3共有C51XC5=25 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列O
設(shè)計(jì)2DNAlHS-5-(CH2)6-TCTGCT TCTTGTCTCT-3 cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTGTGTCTΓ6ΤAGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGACTTGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCATGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCTAGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTAGTGTCTTGTTGCDNA2HS-5-(CH2)6-TGTGAC TAGTTGCTGA-3 HS-5'-(CH2)6-AGTGTCTTGTAGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-TGAGTCTTGATGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AGAGTCTAGTTGCTGT-3HS-5'-(CH2)6-AGTGTCAAGTTGCTGA-3共有C51XC5=25 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列O
設(shè)計(jì)3 DNAlHS-5-(CH2)6-TCTGCT TCTGTTCTCT-3 cDNAHS-5-(CH2)「AAAGCG GTAGTGTTCTGTTGC-3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC
-3' -3'HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；
HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列。本發(fā)明步驟(2)所述的DNA功能性納米金溶液的制備方法為合成的納米金經(jīng)計(jì)算得到濃度為2. 3 nmol · L—1，取納米金溶液在14000 rpm下高速離心20分鐘，除去約80% 的上層溶液，在納米金溶液中加入一定量的DNA (DNA1或DNA2)，使得最終溶液中納米金溶液與DNA的濃度分別為10 nmol · L—1與3 μ M,靜止M h后，再梯度加入2 mol · L—1的氯化鈉與PH 7. 0磷酸緩沖溶液，24 h后使得最終溶液含有0. 2mol .L—1 NaCl與10 mmol .L—1 PB, pH 7.0，14000 rpm下高速離心20分鐘，清洗，再分散于pH 7. 4,0. 2mol Γ1 NaCl與 IOmmol Γ1 PB 配制的 PBS 溶液中，最終得到 DNA-Au NPs (DNAl-Au NPs 或 DNA2_Au NPs), 置于4°C中保存。本發(fā)明步驟(3)所述的cDNA修飾電極的制備方法是金電極浸泡于體積比98% H2SO4 30 %H202=3 1溶液中20分鐘，除去表面吸附的雜質(zhì)，超純水清洗后，分別用1 μ m、 0.3 μπκΟ.Οδ μπι α-Al2O3粉末打磨干凈，再分別于無水乙醇和超純水中超聲清洗5分鐘。 最后，得到的金電極在0. 5mol · L—1硫酸溶液中以lOOmVs—1的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)伏安圖；將處理干凈的金電極浸沒于分別含有1 ymol ·廠1 cDNA, pH 7.4 的10 _ol · Γ1 tris-HCl緩沖溶液和l_ol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接著再浸沒在 Immol · L—1 MCH溶液中2 h，清洗后得到組裝好cDNA的金電極。本發(fā)明步驟(4)中，所述的將cDNA修飾電極與含有梯度濃度Hg2+的DNAl_AuNPs溶液的反應(yīng)條件為37°C下反應(yīng)30min lh。所述的DNA2_AuNPs溶液的加入量為100 μ L ； 加入反應(yīng)時(shí)間為30min lh。所述的Ru(NH3)63+溶液的濃度為3 10 μ mol · L—1。所述的電化學(xué)掃描是差示脈沖伏安(DPV)掃描。本發(fā)明步驟(5)中，所述的定性定量檢測(cè)樣品水體中的汞離子的方法是將步驟 (3)得到的cDNA修飾電極浸沒于分別含有20 μ L濃度為2 mol · L—1的NaCl、80 μ L濃度 50 mmol · Γ1 的 tris-HCl、100 μ L DNAl-AuNPs 及 100 μ L 含有不同濃度的 Hg2+ 樣品水體中，37°C下反應(yīng)1 h，后再加入100 yL DNA2-AuNPs, 1 h后，將電極取出，用10 mol · Γ1 tris-HCl 清洗 5 分鐘，然后在 Ru (NH3)63+濃度 10 μ mol Γ1 的濃度 IOmmol Γ1 的 tris-HCl 緩沖溶液中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)在步驟(4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算得到樣品水體中汞離子含量。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明利用了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶堿基錯(cuò)配與汞離子(T-Hg2+-T)之間的特異性識(shí)別， 再結(jié)合兩種DNA修飾的功能性納米金(DNAl-AuNPs與DAN2_AuNPs)的放大作用，層層捕捉并富集溶液中的汞離子，最終形成一種三維“漁網(wǎng)”型結(jié)構(gòu)，靜電吸附大量的電化學(xué)信號(hào)探針六氨合釕Ru (NH3) 63+。差示脈沖伏安(DPV)作為電化學(xué)檢測(cè)方法。發(fā)展出的這種電化學(xué)傳感策略檢測(cè)汞離子具有高靈敏性，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
檢測(cè)金屬離子的生物傳感器很多，如基于有機(jī)熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)，陽極溶出伏安法， 聚合材料，蛋白質(zhì)等很多被報(bào)道，但由于其局限性(如檢出限高，選擇性不高，與水溶液環(huán)境不兼容)從而想找出一種檢出限低、選擇性高且與環(huán)境相協(xié)調(diào)的一種方法。而電化學(xué)生物傳感器有著廉價(jià)、操作簡易、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到人們的重視。本發(fā)明基于汞離子與胸腺嘧啶錯(cuò)配的高效特異識(shí)別作用，再結(jié)合納米金的生物兼容性與放大作用，實(shí)現(xiàn)了高靈敏、高選擇性檢測(cè)水中汞離子，從而避免了復(fù)雜合成(如熒光法)、儀器昂貴(如HPLC)等缺點(diǎn)。且該方法檢出限(7.38X10_12mol 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他電化學(xué)生物傳感器，且超過其他一些如比色法、熒光法、電制化學(xué)發(fā)光法等。


圖1為本發(fā)明胸腺嘧啶-汞離子-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)的特異性識(shí)別原理圖1。圖2為本發(fā)明原理圖2。圖3為15 士 nm納米金的透射電鏡圖。圖 4 為a)不含 Hg2+，含有 DNAl-AuNPs 與 DNA2_AuNPs ；b)含有 IOOnmol .I71 Hg2+， 不含有 DNAl-AuNPs 與 DNA2_AuNPs ；c)含有 IOOnmol · Γ1 Hg2+ 與 DNAl-AuNPs ；d)含有 IOOnmol · Γ1 Hg2+，DNAl-AuNPs 與 DNA2_AuNPs 的差示脈沖伏安(DPV)圖。圖5為a)裸金電極；b)金電極上組裝上cDNA ;c)含有100 nmol · L—1 Hg2+； d)含有 IOOnmol · L-1 Hg2+ 與 DNAl-AuNPs ；e)含有 IOOnmol · L-1 Hg2+，DNAl-AuNPs 與 DNA2-AuNPs 在含有 5讓?duì)? · Γ1 Fe(CN)63"4- (1:1)與 0· 1 mol · Γ1 KCl 的磷酸緩沖溶液 (IOmmol · Λ pH 7. 4)中阻抗譜圖(EIS)。圖 6 為分別含 Hg2+ 為 a) O nmol · Γ1 ；b) 0. 05 nmol · Γ1 ；c) 0. 1 nmol · Γ1 ；d) 0. 5 nmol · L-1 ；e) 1 nmol · L-1 ；f) 1. 5 nmol · L-1 ；g) 2 nmol · L-1 ；h) 2. 5 nmol · L-1 ； i) 5 nmol · L-1 ； j) IOnmol · L-1 ；k) 25 nmol · L-1 ；1) 50nmol · L-1 ；m) 75 nmol · L-1 ；η) IOOnmol .L—1所測(cè)得的DPV圖。溶液為含有10 μ M六氨合釕的tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 4， 10mM)。圖7為汞離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中的插圖為汞離子濃度在0.05nM-2.5nM之間，與 DPV峰電流之間呈線性直線關(guān)系。圖8為定性檢測(cè)水中汞離子的選擇性實(shí)驗(yàn)方法；汞離子(10 nM、100 nM)與其他金屬離子(1 μ M)分別對(duì)應(yīng)的DPV峰電流變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的英文名詞解釋
Au NPs (Au Nanopartiles)納米金溶液。T (Thymine)胸腺嘧啶。cDNA (capture DNA)，捕捉DNA，用于捕捉納米金修飾的DNA。DNAl-AuNPs:修飾上 DNAl 的納米金。Ru(NH3)63+ 簡稱六氨合釕，全稱為hexaaminerutheium(III) chloride ([Ru(NH3)6JCl3)三氯化六氨合釕。DPV (Differential Pulse Voltammetry)差示脈沖伏安法。
Fe(CN) 63-74-鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀比例為1:1。 EIS (Electrochemical impedance spectroscopy)交流阻抗譜。 TCEP, Tris (2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride。 MCH :6_mercaptohexanolο
實(shí)施例1
本發(fā)明步驟(2)所述的含有T-T錯(cuò)配的DNAl和DNA2序列應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何相互之間能含有T-T錯(cuò)配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T雙鏈的DNA序列；同理，步驟(3)所述的與DNAl序列含有T-T錯(cuò)配的cDNA序列應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任意與DNAl相互之間能含有 T-T錯(cuò)配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T雙鏈的cDNA序列；因此DNAl和DNA2序列、cDNA序列的設(shè)計(jì)相互關(guān)聯(lián)配對(duì)，其三者的錯(cuò)配原理如圖1和圖2所示。例如，本發(fā)明的DNA1、DNA2 和cDNA設(shè)計(jì)為
確定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) X Cm1 (DNA2)的組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)cDNA_DNAl_DNA2的 T-T錯(cuò)配的序列；其中η為cDNA的個(gè)數(shù)，m為DNA2的個(gè)數(shù)
設(shè)計(jì)1
-(CH2)6-TCT GCT CTT GTT CCT T-3'； -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TTC ATG TGC-3 ‘；
DNAl :HS-5' cDNA :HS-51
DNA2: HS-5'
HS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTATGGAACTTGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTTCTAGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTAGGTTCTTGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTACTTGTGC6-AAGGTT CATGTGCTGT-3 HS--5'-(CH2)6-TTGGATCTAGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-ATGGTTCTAGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-ATGGTACTTGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-AAGGTTCTAGTGCTGT-3
共有 C51XC51
設(shè)計(jì) 2
DNAl HS-5'
=25 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列。 -(CH2)6-TCT GCT TCT TGT CTC T-3'
cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTGTGTCTTGTAGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGACTTGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCATGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCTAGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTAGTGTCTTGTTGC--3DNA2:HS-5'-(CH2)6-TGTGAC TAGTTGCTGA-3 HS-5'-(CH2)6-AGTGTCTTGTAGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-TGAGTCTTGATGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AGAGTCTAGTTGCTGT-3HS-5'-(CH2)6-AGTGTCAAGTTGCTGA-3
共有 C51XQ1=ZS 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列,
設(shè)計(jì) 3
DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT GTT CTC T-3'； cDNA: HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TTC TGT TGC -3'；
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'；
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；
HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列。實(shí)施例2
(1) 納米金溶液的制備
納米金采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制得(見圖3)。首先，所有玻璃儀器都需要使用王水浸泡以除去玻璃容器中殘留的還原性物質(zhì)。準(zhǔn)確稱取HAuCl4 ·4Η20 0.0123 g于250 mL 三口燒瓶中，然后三口燒瓶中加入100 mL水。劇烈攪拌，加熱沸騰回流。準(zhǔn)確稱取2水合檸檬酸鈉0. 2849 g于25 mL容量瓶中。取3. 2mL檸檬酸鈉溶液，水浴加熱到50°C后快速加入燒瓶。15分鐘后溶液從無色到淺藍(lán)色再到紫色最后為酒紅色，繼續(xù)加熱10分鐘后停止加熱，繼續(xù)攪拌10分鐘后冷卻到室溫。(2) DNA 功能性納米金的合成(DNAl-AuNPs 與 DAN2-AuNPs)
合成的納米金經(jīng)計(jì)算得到濃度為2. 3nmol · L—1，取納米金溶液在HOOOrpm下高速離心 20分鐘，除去約80%的上層溶液，在納米金溶液中加入一定量的DNA，使得最終溶液中納米金溶液與DNAl的濃度分別為IOnmol · L—1與3 μ Μ，靜止24h后，再梯度加入2 mol · L—1的氯化鈉與磷酸緩沖(PB，pH 7. 0)溶液，24 h后使得最終溶液含有0. 2mol · Γ1 NaCl與10 mmol·廠1 PB，pH 7.0,14000 pm下高速離心20分鐘，清洗，再分散于PBS溶液中(0. 2mol ·廠1 NaCl 與 IOmmol .171 PB，pH 7. 4)，最終得到 DNAl-Au NPs，置于 4°C 中保存。合成 DNA2_AuNPs 的方法與DNA2-AuNPs方法一致。(3) cDNA修飾電極的制備
金電極(2 mm直徑，上海辰華)浸泡于“/^73/^^(98% H2SO4 30 %H2&=3 1(ν/ν))溶液中20分鐘，除去表面吸附的雜質(zhì)，超純水清洗后，分別用1 μπι、0. 3 μπι,Ο. 05 μπι α -Al2O3 粉末打磨干凈，再分別于無水乙醇和超純水中超聲清洗5分鐘。最后，得到的金電極在0. 5 mol 硫酸溶液中以lOOn^Vs—1的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)伏安圖。 將處理干凈的金電極浸沒于分別含有1 μπιο ·!/1 cDNA, 10 mmol -L"1 tris_HCl緩沖溶液 (pH 7. 4)和Immol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接著再浸沒在Immol · Γ1 MCH溶液中2 h，清洗后得到組裝好cDNA的金電極。(4) 電化學(xué)檢測(cè)汞離子將制備好的cDNA組裝電極放置于含有一定濃度Hg2+的DNAl-AuNPs中，37°C下反應(yīng) 30min lh，然后再加入100 μ L DNA2_AuNPs溶液，30min Ih后，用超純水清洗電極，放置于含有3 10 μΜ的Ru (NH3)63+溶液中進(jìn)行電化學(xué)(差示脈沖伏安，DPV)掃描，得到不同濃度汞離子對(duì)應(yīng)的DPV峰電流(見圖4)，然后使用DPV峰電流作為縱坐標(biāo)，汞離子濃度為橫坐標(biāo)，繪制汞離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5)。 (5)將步驟(3)得到的cDNA修飾電極浸沒于分別含有20 μ L濃度為2 mol · L—1 的 NaCl、80yL 濃度 50 mmol .171 的 tris-HCl、100 μ L DNAl-AuNPs 及 100 μ L 不同濃度的 Hg2+樣品水體中，37°C下反應(yīng)1 h，后再加入100 uL DNA2-AuNPs, 1 h后，將電極取出，用 10 mol 'Γ1 tris-HCl 清洗 5 分鐘，然后在 Ru (NH3)63+濃度 10 μ mol Γ1 的濃度 IOmmol .171 的tris-HCl緩沖溶液中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)在步驟(4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行比對(duì)， 計(jì)算得到樣品水體中汞離子含量。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備納米金溶液；(2)用含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配的DNAl和DNA2序列修飾步驟(1)的納米金溶液， 得到DNA功能性納米金溶液DNAl-AuNPs和DNAl-AuNPs ；(3)將與DNAl序列含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配的cDNA修飾于金電極上制得cDNA修飾電極；(4)得到汞離子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線將cDNA修飾電極放置于含有梯度濃度Hg2+的 DNAl-AuNPs溶液中反應(yīng)后，再加入DNA2_AuNPs溶液反應(yīng)后，用超純水清洗cDNA修飾電極后將其放置于含有的Ru (NH3) 63+溶液中進(jìn)行電化學(xué)掃描，得到不同濃度汞離子對(duì)應(yīng)的DPV峰電流；使用DPV峰電流作為縱坐標(biāo)，汞離子濃度為橫坐標(biāo)，繪制汞離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)定性定量檢測(cè)樣品水體中的汞離子將步驟(3)得到的cDNA修飾電極浸沒于分別含有 20 μ L 濃度為 2 mol · L—1 的 NaCl、80 μ L 濃度 50 mmol · L—1 的 tris_HCl、100 μ L DNAl-AuNPs及100 μ L不同濃度的Hg2+樣品水體中，37°C下反應(yīng)1 h，后再加入100 μ L DNA2-AuNPs, 1 h后，將電極取出，用10 mol噸―1 tris_HCl清洗5分鐘，然后在Ru (NH3) 63+濃度10 μ mol · L-1的濃度IOmmol · L-1的tris-HCl緩沖溶液中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)在步驟(4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算得到樣品水體中汞離子含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA設(shè)計(jì)為確定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn) CDNA-DNA1-DNA2的T-T錯(cuò)配的序列；其中η為cDNA的個(gè)數(shù)，m為DNA2的個(gè)數(shù)DNAl :HS-5' -(CH2)6-TCT GCT CTT GTT CCT T-3'；cDNA :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AAA GCG GTT TGG TTC ATG TGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA TGG AAC TTG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TTC TAG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT AGG TTC TTG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TAC TTG TGC-3 ‘；DNA2: HS-5' -(CH2)6-AAG GTT CAT GTG CTG T-3'；HS-5' -(CH2)6-TTG GAT CTA GTG CTG Α~3'； HS-5' -(CH2)6-ATG GTT CTA GTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-ATG GTA CTT GTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AAG GTT CTA GTG CTG Τ-3'；共有 C51XQ1=ZS 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA設(shè)計(jì)為確定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn) CDNA-DNA1-DNA2的T-T錯(cuò)配的序列；其中η為cDNA的個(gè)數(shù)，m為DNA2的個(gè)數(shù)DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT TGT CTC T-3'；cDNA :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AAA GCG GTT GTG TCT TGT AGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG ACT TGT TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TCA TGT TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TCT AGT TGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TCT TGT TGC-3‘； DNA2: HS-5' -(CH2)6-TGT GAC TAG TTG CTG A-3'；HS-5' -(CH2)6-AGT GTC TTG TAG CTG A_3'； HS-5' -(CH2)6-TGA GTC TTG ATG CTG A_3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTC TAG TTG CTG T-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTC AAG TTG CTG A_3'； 共有 C51XQ1=ZS 種 cDNA-DNAl-DNA2 組合序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA設(shè)計(jì)為確定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn) CDNA-DNA1-DNA2的T-T錯(cuò)配的序列；其中η為cDNA的個(gè)數(shù)，m為DNA2的個(gè)數(shù)DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT GTT CTC T-3'； cDNA: HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TTC TGT TGC -3'；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 種 CDNA-DNA1-DNA2 組合序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(2)所述的 DNA功能性納米金溶液的制備方法為合成的納米金經(jīng)計(jì)算得到濃度為2. 3 nmol ，取納米金溶液在14000 rpm下高速離心20分鐘，除去約80%的上層溶液，在納米金溶液中加入一定量的DNA，使得最終溶液中納米金溶液與DNA的濃度分別為10 nmol · L—1與3 μ M，靜止 24 h后，再梯度加入氯化鈉與ρΗ 7.0磷酸緩沖溶液，24 h后使得最終溶液含有0. 2mol -L"1 NaCl與10 mmol · Γ1 PB, ρΗ 7. 0，14000 rpm下高速離心20分鐘，清洗，再分散于ρΗ 7. 4， 0. 2mol Γ1 NaCl與IOmmol 'L"1 PB配制的PBS溶液中，最終得到DNA-Au NPs，置于4°C中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(3)所述的 cDNA修飾電極的制備方法是金電極浸泡于體積比98% H2SO4 30 %H202=3:1溶液中20分鐘，除去表面吸附的雜質(zhì)，超純水清洗后，分別用1 μπι、0.3 μπι,ο. 05 μπι α-Al2O3粉末打磨干凈，再分別于無水乙醇和超純水中超聲清洗5分鐘；最后，得到的金電極在0. 5mol - Γ1 硫酸溶液中以100m-Vs-1的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)伏安圖；將處理干凈的金電極浸沒于分別含有1 μ mol · L—1 cDNA, ρΗ 7. 4的10 mmol · L—1 tris-HCl緩沖溶液和Immol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接著再浸沒在Immol · L—1 MCH溶液中2 h，清洗后得到組裝好cDNA的金電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(4)中所述的將cDNA修飾電極與含有梯度濃度Hg2+的DNAl-AuNPs溶液的反應(yīng)條件為37°C下反應(yīng) 30min Ih0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(4)所述的所述的DNA2-AuNPs溶液的加入量為100 μ L ；加入反應(yīng)時(shí)間為30min lh。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(4)所述的 Ru(NH3)63+ 溶液的濃度為:3 10 μ mol · L-1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法，其特征在于步驟(4)所述的電化學(xué)掃描是差示脈沖伏安掃描。
全文摘要
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)水體中目標(biāo)汞離子的方法。本發(fā)明利用了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶堿基錯(cuò)配與汞離子(T-Hg2+-T)之間的特異性識(shí)別，再結(jié)合兩種DNA修飾的功能性納米金(DNA1-AuNPs與DAN2-AuNPs)的放大作用，層層捕捉并富集溶液中的汞離子，最終形成一種三維“漁網(wǎng)”型結(jié)構(gòu)，靜電吸附大量的電化學(xué)信號(hào)探針六氨合釕Ru(NH3)63+。差示脈沖伏安(DPV)作為電化學(xué)檢測(cè)方法。發(fā)展出的這種電化學(xué)傳感策略檢測(cè)汞離子具有高靈敏性，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/48GK102435662SQ20111027566
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉會(huì)祥, 唐雪梅, 宋榮斌, 梅亞軍, 田丹碧, 馬玉潔, 黃和 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)