專利名稱：一種檢測尿液中甾體激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種尿液中留體激素的檢測方法。
背景技術(shù)：
留體激素是由哺乳動物的性腺及胎盤等組織合成的，具有促進(jìn)性器官成熟和第二性征的出現(xiàn)，及維持性功能等作用。目前留體激素廣泛應(yīng)用于避孕、生理治療、不孕不育癥診療及治療前列腺癌、乳癌等領(lǐng)域。建立靈敏、快速、準(zhǔn)確的檢測尿樣中留體激素方法，對性疾病的診斷和臨床用藥具有非常重要的意義。然而，尿液中的留體激素含量很低，并存在很多的干擾物質(zhì)，給尿液中留體激素的檢測帶來了很多困難。因此，尋找一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測尿液中留體激素的方法一直是生物分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外有關(guān)尿液中留體激素檢測的文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要有酶聯(lián)免疫檢測法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些檢測方法都需要結(jié)合一定的樣品前處理技術(shù)，目前主要采用的有液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)和分散液液微萃取(DLLME)。分散液液微萃取是一種新型的樣品前處理技術(shù)，具有有機(jī)溶劑用量少，操作簡單，萃取時(shí)間短和富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡單可靠、環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)。DLLME與各種色譜技術(shù)聯(lián)用能達(dá)到很低的檢測限，但儀器和耗材昂貴，操作復(fù)雜需要專業(yè)技術(shù)人員，對于普遍應(yīng)用還是具有一定的困難。尿液中留體激素經(jīng)DLLME分離富集后，進(jìn)行薄層色譜分析。經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼归_劑進(jìn)行展開，將留體激素與干擾物質(zhì)有效地分離，再利用茴香醛對留體結(jié)構(gòu)的特異顯色，達(dá)到簡便、快速、靈敏地檢測尿液中留體激素的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測尿液中留體激素的新方法，該方法不需要昂貴的檢測設(shè)備，操作簡單，分析時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確。為此，本發(fā)明公開了一種檢測尿液中留體激素的方法，包括以下步驟(1)樣品溶液的制備將尿液樣品用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0，置于萃取劑加分散劑的混合溶液中進(jìn)行萃取，分離萃取液，所得固體物用乙腈溶解定容；(2)樣品的檢測將樣品溶液和留體激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在長度為8-lOcm的薄層硅膠板上點(diǎn)樣，在展開劑中展開至溶液前沿距薄層硅膠板末端2cm，然后將薄層硅膠板吹干，均勻地噴上顯色劑后在紅外燈下烘烤顯色；將顯色后薄層硅膠板上樣品溶液中的甾體激素斑點(diǎn)與留體激素標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)比較，若樣品溶液的斑點(diǎn)比移值與留體激素標(biāo)準(zhǔn)液相同， 則尿液樣品中含有對應(yīng)甾體激素，反之，則尿液樣品中未含有該甾體激素或含量低于檢出限，而且若樣品溶液的斑點(diǎn)顏色淺于標(biāo)準(zhǔn)液，則尿液樣品中甾體激素的濃度低于標(biāo)準(zhǔn)液濃度，反之，則尿液樣品中留體激素的濃度等于或高于標(biāo)準(zhǔn)液濃度。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是
本發(fā)明能夠?qū)δ蛞簶悠愤M(jìn)行凈化，減少了其他物質(zhì)的干擾；本發(fā)明對尿液中留體激素的富集效果好，富集倍數(shù)均在70倍以上；本發(fā)明能夠?qū)Ω患嘀械母蓴_物質(zhì)進(jìn)行有效的分離，降低檢測限；本發(fā)明選擇茴香醛乙醇溶液作為顯色劑，對留體激素顯色具有較高的靈敏度，尿液樣品中甾體激素的濃度=0. 1 μ g/mL時(shí)均能檢出；本發(fā)明操作簡單，所用試劑廉價(jià)易得，成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確；本發(fā)明適用范圍廣，可用于人及其他哺乳動物尿液中留體激素的檢測，并可用于臨床指導(dǎo)一些相關(guān)疾病的診療。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。實(shí)施例1利用本發(fā)明檢測人體尿液中雌二醇激素的含量。取100 μ L四氯化碳和0. 5mL丙酮混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液樣品中，在35kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中l(wèi)OOOOr/min離心2min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL雌二醇標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為8cm的薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3, ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑10% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出雌二醇。實(shí)施例2利用本發(fā)明檢測人體尿液中黃體酮激素的含量。取100 μ L 二氯甲烷和0. 5mL乙腈混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. O的5. OmL尿液樣品中，在40kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中5000r/min離心％iin，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為9cm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑12% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤顯藍(lán)色。樣品溶液斑點(diǎn)的比移值與0. lyg/mL黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液相同，判斷為被測尿液中黃體酮的濃度不低于0. 1 μ g/mL。實(shí)施例3利用本發(fā)明檢測人體尿液中甲睪酮激素的含量。取100 μ L四氯化碳和0. 5mL0. 05% TritonX-IOO非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. O的5. OmL尿液樣品中，在45kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中4000r/min離心5min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑15% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出甲睪酮。
實(shí)施例4利用本發(fā)明檢測人體尿液中苯丙酸諾龍激素的含量。取10(^1^三氯甲烷和0.511^0.05% TritonX-114非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液樣品中，在50kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中2500r/min離心8min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑18% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出苯丙酸諾龍。實(shí)施例5利用本發(fā)明檢測人體尿液中氫化可的松激素的含量。取100 μ L 二氯甲烷和0. 5mL0. 05% TergitolTMN-6非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液樣品中，在53kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中2000r/min離心lOmin，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為9cm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑20% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出氫化可的松。實(shí)施例6利用本發(fā)明檢測豬尿液中雌二醇激素的含量。取100 μ L四氯化碳和0. 5mL甲醇混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. O的5. OmL尿液樣品中，在53kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中l(wèi)OOOOr/min離心2min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為9cm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3, ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑20% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤顯藍(lán)色。樣品溶液斑點(diǎn)的比移值與0. 1 μ g/mL雌二醇標(biāo)準(zhǔn)液相同，判斷為被測尿液樣品中雌二醇的濃度不低于0. 1 μ g/mL。實(shí)施例7利用本發(fā)明檢測豬尿液中黃體酮激素的含量。取100 μ L三氯甲烷和0. 5mL0. 05% TritonX-IOO非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. O的5. OmL尿液中，在50kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中5000r/min離心5min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. lyg/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液 (7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑18% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤顯藍(lán)色。樣品溶液斑點(diǎn)的比移值與0. 1 μ g/mL黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液相同，判斷為被測尿液樣品中黃體酮的濃度不低于0. 1 μ g/mL。實(shí)施例8
利用本發(fā)明檢測豬尿液中甲睪酮激素的含量。取100 μ L 二氯甲烷和0. 5mL0. 05% TritonX-114非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液中，在45kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中4000r/min離心6min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. lyg/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液 (7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑15% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出甲睪酮。實(shí)施例9利用本發(fā)明檢測豬尿液中苯丙酸諾龍激素的含量。取100 μ L四氯化碳和0. 5mL乙腈混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液中，在40kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中2500r/min離心8min，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液(7 3,v/v)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑12% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈烘烤未顯色，判斷為被測尿液樣品中未檢出苯丙酸諾龍。實(shí)施例10利用本發(fā)明檢測豬尿液中氫化可的松激素的含量。取100 μ L三氯甲烷和0. 5mL0. 05% TergitolTMN-6非離子表面活性劑混勻，用注射器迅速將混合液注入經(jīng)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0的5. OmL尿液中，在35kHz下超聲至形成均勻的乳濁體系，于離心機(jī)中2000r/min離心lOmin，用吸管移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，所得固體物用乙腈溶解定容至lmL。將所得樣品溶液和0. 1 μ g/mL甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液分別在長度為IOcm薄層板上點(diǎn)樣，在氯仿-甲醇溶液 (7 3，ν/ν)中展開至溶液前沿距薄層板末端2cm，干燥后均勻噴灑10% (w/v)茴香醛乙醇顯色劑，在紅外燈下烘烤顯藍(lán)色。樣品溶液斑點(diǎn)的比移值與0. 1 μ g/mL氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)液相同，但顏色深于標(biāo)準(zhǔn)液，判斷為被測尿液樣品中氫化可的松的濃度不低于0. 1 μ g/mL。以上實(shí)施例與采用高效液相色譜法的檢測結(jié)果比較見表一表一
權(quán)利要求
1.一種檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)樣品溶液的制備將尿液樣品用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至 7. 0，置于萃取劑加分散劑的混合溶液中進(jìn)行萃取，分離萃取液，所得固體物用乙腈溶解定容；(2)樣品的檢測將樣品溶液和留體激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在長度為8-lOcm的薄層硅膠板上點(diǎn)樣，在展開劑中展開至溶液前沿距薄層硅膠板末端2cm，然后將薄層硅膠板吹干，均勻地噴上顯色劑后在紅外燈下烘烤顯色；將顯色后薄層硅膠板上樣品溶液中的留體激素斑點(diǎn)與甾體激素標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)比較，若樣品溶液的斑點(diǎn)比移值與甾體激素標(biāo)準(zhǔn)液相同，則尿液樣品中含有對應(yīng)甾體激素，反之，則尿液樣品中未含有該甾體激素或含量低于檢出限，而且若樣品溶液的斑點(diǎn)顏色淺于標(biāo)準(zhǔn)液，則尿液樣品中留體激素的濃度低于標(biāo)準(zhǔn)液濃度，反之， 則尿液樣品中留體激素的濃度等于或高于標(biāo)準(zhǔn)液濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述留體激素為雌性激素，孕激素和雄性激素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述萃取劑為二氯甲烷或三氯甲烷或四氯化碳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述分散劑為甲醇或乙醇或乙腈或丙酮或Triton X-100非離子表面活性劑(0. 05%，ν/ν)或"Triton Χ-114 非離子表面活性劑(0. 05%, ν/ν)或Tergitol ΤΜΝ-6非離子表面活性劑(0. 05%, ν/ν)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述尿液樣品需在-20°C下保存，檢測時(shí)取出自然解凍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述留體激素標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0. 1 μ g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述展開劑為體積比 7/3的氯仿/甲醇溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述顯色劑為 10-20% (w/v)茴香醛的乙醇溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于所述樣品溶液制備的步驟為(1)取100μ L萃取劑和0. 5mL分散劑混合均勻；(2)在具塞尖底離心管中加入5.OmL待測尿液樣品，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0 ；(3)用注射器吸取步驟(1)制得的混合液，注入步驟( 所述的離心管中，超聲至形成均勻的乳濁體系；將離心管于離心機(jī)中2000-10000r/min離心2-lOmin，移除上層溶液，底部有機(jī)相經(jīng)氮?dú)獯得撌挂后w揮發(fā)后，剩余固體物用乙腈溶解定容至lmL。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述檢測尿液中留體激素的方法，其特征在于步驟C3)中超聲波的頻率為35-53kHz。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測尿液中甾體激素的方法，即先通過分散液液微萃取的方法對尿樣中甾體激素進(jìn)行分離富集，經(jīng)薄層層析將樣品中的甾體激素與干擾物質(zhì)進(jìn)行再分離，經(jīng)過茴香醛乙醇溶液顯色，然后與標(biāo)準(zhǔn)甾體激素對比，通過斑點(diǎn)的比移值和顏色判斷甾體激素的含量，檢測靈敏度為0.1μg/mL。本發(fā)明的方法操作簡單，有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高，檢測時(shí)間短，干擾少，是一種簡便、快速、準(zhǔn)確的分析方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N30/06GK102359998SQ20111027934
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者楊亞玲, 胡旭佳, 鄒艷 申請人:昆明冷木捷商貿(mào)有限公司