專利名稱：一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生態(tài)環(huán)境保護領(lǐng)域，尤其涉及一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法。
背景技術(shù)：
為克服農(nóng)藥大量使用產(chǎn)生的弊端、保障農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)得以快速發(fā)展，2009年全球轉(zhuǎn)基因種植面積從1996年0. 0174億公頃發(fā)展到1. 34億公頃，其中 Bt水稻是一類轉(zhuǎn)入了含有蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thueingiensis)殺蟲毒性基因片段的轉(zhuǎn)基因作物，具有抗鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Hymenoptera)、 同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophage)等多種昆蟲及其幼蟲特性，也是我國重要轉(zhuǎn)基因作物之一。然而，轉(zhuǎn)基因作物的利用在降低農(nóng)藥用量、保障作物產(chǎn)量的同時是否對農(nóng)田生態(tài)安全構(gòu)成潛在的威脅是目前關(guān)注的重要問題。土壤呼吸強度往往看作是衡量土壤微生物總的活性指標，或者作為評價土壤肥力的指標之一。Bt作物在生長過程中產(chǎn)生各種毒性蛋白，這些蛋白通過根際分泌物，秸稈腐爛等方式進入土壤，它可能對土壤呼吸強度產(chǎn)生負面影響，是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要內(nèi)容，因此測量Bt作物種植和秸稈還田土壤微生物呼吸強度具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法，為BT水稻對土壤生態(tài)系統(tǒng)安全評估提供技術(shù)手段。一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法，包括將采集的土壤樣品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均勻，分別培養(yǎng)7和24小時后，利用氣相色譜測定每克土壤樣品產(chǎn)生的CO2的量；以分別表征Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。所述的葡萄糖溶液的濃度為0. 05 0. 2mol/L,更優(yōu)選為0. lmol/L。所述土壤樣品與葡萄糖溶液的重量體積比為Ig 0.2 0.6!1^，更優(yōu)選為 Ig 0.4mL。本發(fā)明優(yōu)點在于方法本身簡單、快捷，更重要的是可以利用7小時和24小時產(chǎn)生的CO2的量區(qū)分Bt水稻種植及其秸稈還田對土壤微生物的影響和恢復力。


圖1為CO2標準氣體和土壤呼吸釋放的CO2氣相色譜圖(a =CO2標準氣體；b 土壤呼吸)。圖2為華池B6、嘉早935、中九B種植期間不同生長期根際土壤培養(yǎng)7h和24h的
厭氧呼吸作用。
圖3為華池B6、嘉早935和中九B秸稈還田后不同取樣時間土壤培養(yǎng)7h和24h的厭氧呼吸作用。
具體實施例方式水稻材料Bt水稻華池B6、親本嘉早935和遠緣親本中九B。田間試驗設(shè)計與取樣田間實驗在浙江省建德市苗木基地進行，試驗田劃分為9個小區(qū)，分別種植這三個水稻品種，每個品種均設(shè)3個重復小區(qū)，每個小區(qū)26-28行X 12株/行> 300株，不同品種的小區(qū)間隔設(shè)置。在水稻的分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期分別取樣。將水稻連同其根部的泥土用小鏟一起拔出并帶回實驗室，每個小區(qū)取三株水稻樣品。取回的樣品在室溫下適度風干后， 抖落并收集根際周圍的土壤，在除去植物殘根和石礫等雜物后，過2mm篩后進行土壤呼吸活性的測定。水稻成熟后將水稻秸稈切成長約2cm的片段并在室溫條件下風干。翻耕后，在原種植小區(qū)上進行同品種的水稻秸稈還田實驗，將秸稈均勻的鋪撒在小區(qū)內(nèi)并在其上覆蓋厚約5cm的土層，每個小區(qū)的還田秸稈量為7kg。在秸稈還田后的97、128、158和189天分別取樣，取回的樣品在室溫下適度風干后，去除殘根和石礫等雜物后，過2mm篩后待用。土壤呼吸活性的測定準確稱取相當于5g干土重的新鮮土樣于50ml磨口細口瓶中，加入2ml濃度為 0. lmol/1的滅菌葡萄糖溶液，充滿高純氮氣并用橡皮塞塞好，再用封口膠將瓶口密封以確保其密封性。將細口瓶放在30°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7h、24h后用安捷倫氣密性進樣針從細口瓶抽取500 μ 1氣體，之后再進氣相色譜分析。CO2用福立GC-9790氣相色譜測定，CO2經(jīng)轉(zhuǎn)化爐轉(zhuǎn)化為CH4后通過FID檢測器檢測，CO2標準氣體以及土壤呼吸產(chǎn)生的CO2氣相色譜圖如圖1所示，檢測條件為載氣高純氮氣色譜柱(TDX-01，1.5mX 2mm i. d)；檢測器溫度180°C;柱溫100°C;進樣口溫度120°C;轉(zhuǎn)化爐溫度320°C ；進樣量7h為 500μ l，24h 為 200μ 1。土壤呼吸CO2的計算公式
V -M V每克干土呼吸產(chǎn)生的= ^
IlA. m K3V1 根據(jù)標準曲線計算得到的相當于標準氣體的體積，LM =CO2的摩爾質(zhì)量，g/mol (本實驗取44)V2 細口瓶剩余體積，ml (本實驗均為64ml)m 干土的重量，g(本實驗為5g)
V3 進樣量，ml (本實驗為0. 5和0. 2ml)Bt水稻種植土壤微生物呼吸呼吸強度培養(yǎng)7h后，轉(zhuǎn)基因華池B6、親本嘉早935、遠緣親本中九B在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期土壤厭氧呼吸強度如圖2所示。在水稻分蘗期，華池B6、嘉早935、中九B 土壤厭氧呼吸強度分別為0. 35,0. 33,0. 38mgC02/g干土，轉(zhuǎn)基因比親本高6 %而比遠緣親本低 7.9%，經(jīng)ANOVA分析發(fā)現(xiàn)三個品種間差異不顯著；在水稻抽穗期，其相應(yīng)的土壤呼吸強度分別為0. 38,0. 49,0. 52mg C02/g干土，經(jīng)ANOVA分析轉(zhuǎn)基因與親本、遠緣親本間均存在顯著差異，轉(zhuǎn)基因比親本、遠緣親本分別低22. 4%,26. 9% ；在水稻灌漿期，其相應(yīng)的土壤呼吸強度分別為0. 26,0. 36,0. 35mg C02/g干土，經(jīng)ANOVA分析表明轉(zhuǎn)基因與親本、遠緣親本間差異顯著，轉(zhuǎn)基因水稻比親本、遠緣親本低27. 8%,25. 7% ；成熟期，轉(zhuǎn)基因、親本、遠緣親本土壤呼吸強度均為0. 33mg C02/g干土。在培養(yǎng)24h，Bt水稻種植對土壤厭氧呼吸強度如圖2所示。在水稻分蘗期，轉(zhuǎn)基因、 親本和遠緣親本土壤呼吸強度分別為3. 41,2. 75,3. 07mgC02/g干土，轉(zhuǎn)基因比親本、遠緣親本高24%、11. 1%，經(jīng)ANOVA分析顯示三個品種間差異不顯著；在水稻抽穗期其相應(yīng)的土壤呼吸強度分別為2. 71,3. 31,3. 43mg C02/g干土，轉(zhuǎn)基因與親本、遠緣親本間差異顯著，轉(zhuǎn)基因分別比親本、遠緣親本低18. 1%,21% ；在水稻灌漿期，其相應(yīng)的土壤呼吸強度分別為 1. 98、1. 91、1. 9Img C02/g干土，在水稻成熟期，其相應(yīng)的土壤呼吸強度分別為1. 43、1. 50、 1. 40mg C02/g干土，經(jīng)ANOVA分析表明這兩個生長期各個品種間不存在顯著性差異。Bt水稻秸稈還田土壤微生物呼吸強度圖3為華池B6、嘉早935和中九B秸稈還田后不同取樣時間土壤培養(yǎng)7h和24h 的厭氧呼吸作用。培養(yǎng)7h后，Bt水稻華池B6秸稈還田后97、128、158和189天土壤厭氧呼吸產(chǎn)生的CO2量與其親本嘉早935和遠緣親本中九B間均不存在顯著差異。嘉早935在秸稈還田后128和158天呼吸作用分別高于華池B622. 3%、24.6%，高于中九B 30.4%, 30.6%，但不存在顯著差異。在培養(yǎng)24h后，土壤呼吸作用的結(jié)果與培養(yǎng)7h類似，不存在長期的顯著差異。華池B6在秸稈還田后97和189天土壤厭氧呼吸作用與遠緣親本中九B處理存在差異顯著， 分別高31. 4%,28. 5%，而華池B6與嘉早935間不存在顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法，包括 將采集的土壤樣品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均勻，分別培養(yǎng)7和24小時后，利用氣相色譜測定每克土壤樣品產(chǎn)生的CO2的量，分別表征Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的葡萄糖溶液的濃度為0.05 0.2mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述的葡萄糖溶液的濃度為0.Imol/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的分析方法，其特征在于，所述土壤樣品與葡萄糖溶液的重量體積比為Ig 0. 2 0. 6mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述土壤樣品與葡萄糖溶液的重量體積比為Ig 0. 4mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度的分析方法，包括將采集的土壤樣品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均勻，分別培養(yǎng)7和24小時后，利用氣相色譜測定每克土壤樣品產(chǎn)生的CO2的量，分別表征Bt水稻種植及其秸稈還田土壤微生物呼吸強度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。本發(fā)明優(yōu)點在于方法本身簡單、快捷，更重要的是可以利用7小時和24小時產(chǎn)生的CO2的量區(qū)分Bt水稻種植及其秸稈還田對土壤微生物的影響和恢復力。
文檔編號G01N30/02GK102435684SQ20111027953
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者董斌, 虞云龍 申請人:浙江大學