專利名稱：一種用于檢測羊bmpr-ib基因多態(tài)性的pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和動物育種領(lǐng)域。具體地涉及BMPR-IB基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,縮寫為SNP)及其與羊產(chǎn)蓋數(shù)的相關(guān)性,涉及檢測這些SNP的試劑盒。
背景技術(shù)：
研究發(fā)現(xiàn)，Booroola美利奴羊的多胎性能是由位于常染色體上FecB基因發(fā)生突變所致，F(xiàn)ecB基因的突變對綿羊排卵率是基因的加性效應(yīng)，對窩產(chǎn)羔數(shù)呈部分顯性效應(yīng)，綿羊FecB基因?qū)嶋H為骨骼形態(tài)蛋白IB型受體(BMPR-IB)基因，由于該基因A746G堿基突變導(dǎo)致第249位的谷氨酸突變?yōu)榫彼?Q — R)，導(dǎo)致綿羊排卵數(shù)和窩產(chǎn)羔數(shù)增加，并且證 明BMPR-IB基因為影響綿羊的產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，可以用于對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇。目前，國內(nèi)外研究人員開始應(yīng)用BMPR-IB基因開展分子標(biāo)記輔助選育多胎綿羊，新西蘭Genomnz實驗室正在進(jìn)行BMPR-IB基因的基因標(biāo)記輔助選擇。劉守仁等經(jīng)多年研究，培育出多胎細(xì)毛羊品系核心群，繁殖率達(dá)182%，較同等條件下的細(xì)毛羊提高60% 70%，又利用多胎基因BMPR-IB基因標(biāo)記的方法，培育肉毛兼用美利奴，證明綿羊多胎性狀主效基因標(biāo)記輔助育種在利用優(yōu)良品種與我國地方品種雜交提高產(chǎn)肉性能方面具有一定的優(yōu)勢。對于綿羊多胎基因突變位點的檢測國內(nèi)外也做了大量的工作，多采用檢測單個堿基的差異(或突變)來標(biāo)示其多態(tài)性。近年來，SNP檢測方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快，已報道并建立了多種SNP檢測方法。傳統(tǒng)的代表方法有限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphisms, RFLP),單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformationpolymorphisms, SSCP)、等位基因特異的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,AS0)雜交等。對于綿羊多胎基因的檢測，常用方法是PCR-RFLP，PCR之后再酶切，再電泳，費時費力。該工作重復(fù)勞動多，消耗高，自動化程度低，該手段目前已經(jīng)不適應(yīng)大規(guī)模、低消耗和自動化的要求，因此，建立一種能夠自動化、簡便、快速的綿羊BMPR-IB基因分型方法勢在必行。隨著熒光定量PCR儀的普及，利用探針技術(shù)的的快速、特異性和敏感性，可以更方便快捷地進(jìn)行大規(guī)模多態(tài)性檢測。本研究旨在利用探針技術(shù)的優(yōu)點，建立綿羊BMPR-IB基因分型方法，使之易于應(yīng)用在大規(guī)模群體的檢測中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即是提供一種新的用于羊BMPR-IB基因分型的PCR試劑盒。本發(fā)明還提供了一種檢測樣本中是否存在BMPR-IB基因的SNP的方法，該方法包括如下步驟(I)利用我們自己設(shè)計的試劑盒擴(kuò)增BMPR-IB基因，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)利用FRET探針技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型。本發(fā)明中，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為219bp，其中含有A746G。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的基本技術(shù)路線是I、提取綿羊基因組DNA，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用RFLP進(jìn)行基因分型。2 J^BMPR-IB基因第6個內(nèi)含子進(jìn)行測序。3、設(shè)計探針及引物，對已經(jīng)分型的樣品利用FRET探針檢測，最后利用測序驗證分型的正確性。利用RFLP用于對BMPR-IB基因進(jìn)行分型所依據(jù)的序列可以從Genbank中獲得，編號為NM_001009431 ;用于進(jìn)行探針設(shè)計的序列是經(jīng)過測序獲得的。本發(fā)明特別地提供了一種使用方便，靈敏度高的對上述基因分型的檢測試劑盒，它含有PCR特異擴(kuò)增弓I物和用于PCR擴(kuò)增檢測的PCR反應(yīng)液(如試劑、緩沖液等常規(guī)組件)，以及用于基因分型的FRET探針等。
具體來說，本發(fā)明提供了一種快速高效檢測羊BMPR-IB基因多態(tài)性的PCR試劑盒，其特征是由分離包裝的引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液構(gòu)成，其中，引物F和R的序列為F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 ；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 探針Anchor、sensor 序列為Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BlackHQ ；Sensor probe FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-P04在所述探針Anchor、sensor上，BlackHQ是一種淬滅劑，F(xiàn)AM是綠色突光標(biāo)記物。就本發(fā)明來說，試劑盒中的PCR反應(yīng)液可以直接由市售的現(xiàn)有產(chǎn)品充當(dāng)，如TransGen 公司生產(chǎn)的 TransStartTMProbe qPCR superMix 以及 CW BIO 公司生產(chǎn)的GoldStar TaqMan Mixture 或是 2*Es Taq MasterMix (無染料)。本發(fā)明的主要技術(shù)貢獻(xiàn)在于I、獲得BMPR-IB基因的第6內(nèi)含子序列；2、針對上述突變點設(shè)計出了用于探針檢測的引物和探針；3、利用FRET探針技術(shù)檢測PCR產(chǎn)物中的多態(tài)性，證實此方法正確可靠。需要特別說明的是，就本發(fā)明的試劑盒來說，引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液之間的用量比例的選取是次要的，即該用量比例的選取并不構(gòu)成本發(fā)明技術(shù)方案的必要條件。在試劑盒產(chǎn)品中，引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液之間的比例可針對不同的用戶需求而做出調(diào)整。為了讓本試劑盒的制作更為簡便，本發(fā)明推薦采用如下用量比例方案當(dāng)以25ul反應(yīng)體系為基準(zhǔn)時，試劑盒中包含12. 5ul probe mixPCR反應(yīng)液，0. 2uM引物F、IuM引物R、
0.2uMAnchor probe、0. IuM Sensor probe。在檢測時，取用 IulDNA(20_50ng)樣本加入上述反應(yīng)體系。通過調(diào)節(jié)加入的水量，讓引物F為0. 2uM、引物R為luM、Anchor probe為0. 2uM、Sensor probe 為 0. IuM0另外，F(xiàn)RET技術(shù)是早已存在的技術(shù)，但迄今為止，國內(nèi)外尚無公開報道將其應(yīng)用于BMPR-IB基因分型中?，F(xiàn)對FRET技術(shù)簡述如下
原理FRET探針依靠熒光能量從一個熒光染料到另一個的傳遞。兩個獨立的特異寡核苷酸序列都標(biāo)記上熒光基團(tuán)。上游探針在3 ‘末端有一個供體基團(tuán)，下游探針在5 ‘末端有一受體基團(tuán)。設(shè)計探針時他們在與目標(biāo)序列結(jié)合時互相臨近，使供體和受體熒光基團(tuán)緊密接近。一旦探針雜交到模板上，從供體到受體熒光基團(tuán)的能量傳遞產(chǎn)生了一個不同波長的熒光信號。供體熒光信號的減弱和受體熒光信號的加強(qiáng)都能分別監(jiān)測到。因此，只有當(dāng)兩個探針都結(jié)合上去才能檢測到熒光信號。(如圖I所示)基因點突變的檢測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記.如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度。這樣便可對基因的突變和多態(tài) 性進(jìn)行分析。本發(fā)明采用的改進(jìn)的FRET探針原理我們所設(shè)計的是經(jīng)過改進(jìn)的FRET探針，上游探針不標(biāo)記熒光信號，只攜帶淬滅基團(tuán)。I、采用熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的組合代替了之前的兩個熒光基團(tuán)(熒光能量共振轉(zhuǎn)移)；2、在退火階段，57°C檢測時(溫度較高，時間較短)，兩條探針沒有充分雜交上去，所以沒有信號的變化；3、熔解曲線體現(xiàn)的是sensor探針的熔解過程，anchor探針是Tm較高的探針,在sensor探針熔解反應(yīng)前保持雜交于目標(biāo)序列；4、在熔解過程中，當(dāng)兩個探針都結(jié)合上去時，因為淬滅劑的存在，熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，所以產(chǎn)生了一個倒置的峰。這樣在所有的熒光定量PCR儀上只利用一個通道在不到兩個小時就能對36，72，96，甚至多達(dá)384個樣本(根據(jù)所使用儀器的孔道)進(jìn)行檢測。


圖I是FRET技術(shù)原理圖。圖2是實施例中的基因分型結(jié)果圖。圖3是實施例中的基因分型結(jié)果表格圖。
具體實施例方式本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例中所涉及的內(nèi)容。實施例本實施例中的試劑盒是由分離包裝的引物引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液構(gòu)成，其中引物F和R的序列為F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 探針序列為
Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BIackHQ ；Sensor probe FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-P04在所述探針Anchor、sensor上，BlackHQ是一種淬滅劑，F(xiàn)AM是綠色突光標(biāo)記物。本實施例中的試劑盒以25ul反應(yīng)體系為基準(zhǔn)制作，試劑盒中包含12. 5ul probemixPCR 反應(yīng)液，0. 2uM 引物 F, IuM 引物 R,0. 2uMAnchor probe,0. IuM Sensor probe。在檢測時，取用IulDNA(20-50ng)樣本加入上述反應(yīng)體系。為了進(jìn)一步說明本實施例中所制作試劑盒的使用方法和使用效果，下面繼續(xù)說明將上述試劑盒用于BMPR-IB基因多態(tài)性分型的具體過程及使用效果。實驗步驟 I、DNA提取按照常規(guī)的DNA提取方法或試劑盒進(jìn)行DNA提取。2、目的基因的實時PCR擴(kuò)增采用上述試劑盒對目的基因BMPR-IB進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增時使用的機(jī)器為澳大利亞 Corbett Life Science 公司的 Rotor-Gene 6000。PCR反應(yīng)程序950C 30s95 °C 10S55°C 20S 50cycles72 °C 30S熔解分析程序95 °C IMin40 °C 5Min40°C升溫至75°C，I0C /5S FAM通道檢測熒光3、點突變SNP分析。根據(jù)熔解峰位置的不同，判斷不同的基因型。突變型的熔解峰位于野生型之前，雜合熔解峰橫跨兩者。(如圖2所示，倒置峰經(jīng)過180度翻轉(zhuǎn)，便于分析)設(shè)置好峰庫，編輯好名稱后，分型結(jié)果直接出現(xiàn)在屏幕下方的表格中。(如圖3所示)通過對105個樣本進(jìn)行試驗，20個樣本進(jìn)行測序驗證，證實此技術(shù)方法正確可靠。需要說明的是，上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，并不以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測羊BMPR-IB基因多態(tài)性的PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括分離包裝的引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液， 所述引物F和R的序列為F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 ；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 ； 所述探針Anchor、sensor序列為Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BIackHQ ；Sensor probe :FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG_P04。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測羊BMPR-IB基因多態(tài)性的PCR試劑盒，其特征在于在所述探針Anchor、sensor上，BlackHQ是一種淬滅劑，F(xiàn)AM是綠色突光標(biāo)記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測羊BMPR-IB基因多態(tài)性的PCR試劑盒，其特征在于當(dāng)以25ul反應(yīng)體系為基準(zhǔn)時，試劑盒中包含12. 5ul probe mixPCR反應(yīng)液，0. 2uM引物F、IuM 引物 R、0. 2uMAnchor probe、0. IuM Sensor probe。
全文摘要
一種用于檢測羊BMPR-IB基因多態(tài)性的PCR試劑盒，包括分離包裝的引物F、引物R、探針Anchor、探針Sensor和PCR反應(yīng)液，引物F和R的序列為F5-AGAGGACAATA GCAAAGCA-3；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3；探針序列為Anchor probeAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BlackHQ；Sensor probeFAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-PO4。
文檔編號G01N21/64GK102732605SQ201110282240
公開日2012年10月17日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者劉彥琴, 劉月琴, 孫洪新, 張英杰, 李雪梅, 楊佳棟, 王紅娜, 董李學(xué) 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)