專(zhuān)利名稱(chēng)：一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物體顯微和超微結(jié)構(gòu)研究中的制片方法，尤其是一種大型海藻 離體染色表皮片層的快速制片方法。
背景技術(shù)：
顯微和超微結(jié)構(gòu)研究是揭示生命現(xiàn)象和過(guò)程的必需手段，從荷蘭科學(xué)家虎克發(fā)明 顯微鏡以來(lái)已經(jīng)有300多年，取得了許多進(jìn)步，但該領(lǐng)域的研究往往受到樣品處理過(guò)程中 制片技術(shù)的好壞所影響。
大型海藻，是海洋中的大型低等植物，其長(zhǎng)度從幾毫米至幾十米，常見(jiàn)的一般大多 屬于厘米級(jí)，粗度一般也就幾毫米長(zhǎng)，常見(jiàn)的大型海藻體積都比較小。那么，開(kāi)展其顯微和 超微結(jié)構(gòu)研究已成了對(duì)其進(jìn)行精確鑒定、分類(lèi)和生命活動(dòng)等研究必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。然 而，針對(duì)多數(shù)如此小的生物，進(jìn)行其顯微和超微結(jié)構(gòu)研究在制片上存在很大難度，特別是針 對(duì)其表皮細(xì)胞的難度更大，因此目前現(xiàn)有的制片方法大多都是直接來(lái)源于高等植物。過(guò)去 該領(lǐng)域的學(xué)者主要從兩個(gè)方面進(jìn)行染色觀察1.制作切片后染色觀察；2.樣品表面直接 觀察。這些方法存在明顯的不足1.切片只能觀察到部分組織和結(jié)構(gòu)，不能顯現(xiàn)觀察對(duì)象 的全貌；2.通過(guò)表面直接觀察，由于其內(nèi)部有其它組織細(xì)胞，導(dǎo)致觀察結(jié)果往往受到干擾； 3.無(wú)論是切片還是表面觀察，其超微觀察結(jié)果通常不好，無(wú)法獲得所需組織結(jié)構(gòu)的清晳照 片等圖像信息。
我們?cè)陂_(kāi)展大型海藻的研究過(guò)程中，經(jīng)常碰到此類(lèi)問(wèn)題，也曾尋找文獻(xiàn)，都未能解 決這個(gè)問(wèn)題。如何有效地分離大型海藻的表皮層，成為了學(xué)科發(fā)展的一個(gè)難題。迄今為止， 尚未見(jiàn)到任何有關(guān)利用試劑特性來(lái)解離大型海藻表皮制片的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種大型海藻離體染色表皮片層的快速 制片方法。
一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，包括如下步驟(1)配制苯胺藍(lán)染色混合試劑母液配制比例為乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 :1，然后以母液為基礎(chǔ)配制O. 5%(w/v)苯胺藍(lán)染色混合試劑；(2)選取樣品選擇目標(biāo)樣品并進(jìn)行清潔，去除藻體表面的雜質(zhì)和雜藻，切成長(zhǎng)約I一1. 5cm的樣品段；(3)染色及表皮細(xì)胞層解離取多數(shù)樣品，加入步驟(I)制得的混合試劑，一般4一8根 樣品加入混合試劑I滴，正常處理樣品的處理時(shí)間為10 —12分鐘，幼嫩組織的處理時(shí)間為 3— 4分鐘，讓樣品表皮細(xì)胞層與內(nèi)皮層細(xì)胞間充分解離并染色；(4)染色表皮片層的分離切開(kāi)表皮層，移去內(nèi)部組織，可制成面積可達(dá)Icm2的染色表 皮細(xì)胞片層；(5)染色表皮片層制片染色表皮片層移置預(yù)先準(zhǔn)備的載玻片，加保濕防腐劑，封片。
在步驟(I)中，先將苯酚、乳酸、甘油和水的混合過(guò)程中進(jìn)行加熱。
在步驟(2)中，在超聲波清洗儀中處理樣品8-10分鐘，幼嫩組織處理3-4分鐘，用 潔凈海水沖洗樣品，鏡檢清洗效果。
在步驟(3)中，挑選藻體表面干凈、均勻的樣品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺 藍(lán)溶液，翻動(dòng)樣品，使之均勻著色；針對(duì)樣品表皮細(xì)胞與內(nèi)皮層細(xì)胞質(zhì)地和致密性差異，利 用苯酚的腐蝕性特點(diǎn)，解離表皮與內(nèi)皮層細(xì)胞間的粘質(zhì)和胞間連結(jié)。
在步驟(4)中，左手用尖鑷子輕壓樣品內(nèi)部組織部分，右手用解剖針輕輕從左至右 劃開(kāi)表皮細(xì)胞層，用軟毛筆移去內(nèi)部組織，可制成面積可達(dá)I Cm2的染色表皮細(xì)胞片層。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下I)能精確分離出表皮細(xì)胞層。
2)所制備的表皮片層面積大,適合多種用途。
3)制片速度快，花費(fèi)極少，經(jīng)濟(jì)適用。
4)表皮細(xì)胞不變形。
5)染色效果好，不易退色。
6)具有殺菌防腐作用，能較長(zhǎng)時(shí)間保存。
本發(fā)明是一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制備方法，通過(guò)此種方法制備的 大型海藻表皮片層不但具有明顯的結(jié)構(gòu)特征一超微結(jié)構(gòu)清皙，細(xì)胞不變形，而且可展現(xiàn)連 續(xù)的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，在形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、發(fā)育學(xué)及進(jìn)化研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本發(fā)明一方面 是通過(guò)混合試劑中苯胺藍(lán)對(duì)樣品進(jìn)行染色，另一方面根據(jù)大型海藻表皮層和內(nèi)皮層質(zhì)地和 致密性存在差異的特性，利用苯酚的腐蝕性解離胞間粘質(zhì)及其連結(jié)，達(dá)到表皮層和內(nèi)皮層 分離的目的。
實(shí)施例1 :大型海藻成熟表皮片層的制備(I)選取樣品的成體部分，用毛刷和超聲波清洗儀清潔藻體表面2-3次，超聲波清洗儀 處理樣品一般每次8-10分鐘,去除藻體表面的雜質(zhì)和雜藻,切成長(zhǎng)約1-1. 5 cm左右的樣品 段，挑選其中生長(zhǎng)均勻、粗細(xì)適中、分枝較少的樣品用于后續(xù)操作。
(2)把清潔、切段的樣品轉(zhuǎn)入載玻片凹槽中或小的培養(yǎng)皿或小燒杯中，一般按4根 樣品加入混合試劑I滴，處理樣品10-12分鐘，每隔3-4分鐘翻動(dòng)樣品一次，讓樣品表皮細(xì) 胞層與內(nèi)皮層細(xì)胞間充分解離并染色。
(3)染色及解離的樣品轉(zhuǎn)入小燒杯中，用蒸餾水清洗樣品3-4次，去除樣品表面混 合試劑，左手用尖鑷子輕壓樣品內(nèi)部組織部分，右手用解剖針輕輕從一端至另一端劃開(kāi)表 皮層，然后用鑷子輕輕固定樣品一端，再用細(xì)毛筆移去解離的內(nèi)部組織，根據(jù)觀察需要制成 染色表皮細(xì)胞片層，較大的面積可達(dá)I cm2。
(4)用吸管吸取染色表皮細(xì)胞片層，轉(zhuǎn)移到載玻片凹槽中，用蒸餾水清洗2-3次。 準(zhǔn)備干凈的載玻片，用吸管吸取一個(gè)染色表皮片層置于其上，慢慢用鑷子和解剖針展開(kāi)片 層，使之單層平鋪于載玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。
本實(shí)施例說(shuō)明由于成熟藻體生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)，其表面附著的雜質(zhì)和雜藻多且附著比較牢固，因此前處理需要的強(qiáng)度比幼藻體的大，其組織結(jié)構(gòu)致密，所需要進(jìn)行的染色和解離 時(shí)間也較長(zhǎng)。由其制成的表皮片層韌性好，利于后續(xù)操作和永久封存。
實(shí)施例2 :大型海藻幼嫩表皮片層的制備(I)選取樣品的成體部分，用超聲波清洗儀清潔藻體表面I次，處理時(shí)間一般3-4分鐘， 去除藻體表面的雜質(zhì)，切成長(zhǎng)約1-1.5 cm左右的樣品段，挑選其中生長(zhǎng)均勻、粗細(xì)適中、分 枝較少的樣品用于后續(xù)操作。
(2)把清潔、切段的樣品轉(zhuǎn)入載玻片凹槽中或小的培養(yǎng)皿或小燒杯中，一般按8根 樣品加入混合試劑I滴，處理樣品10分鐘，每隔3-4分鐘翻動(dòng)樣品一次，讓樣品表皮細(xì)胞層 與內(nèi)皮層細(xì)胞間充分解離并染色。
(3)染色及解離的樣品轉(zhuǎn)入小燒杯中，用蒸餾水清洗樣品2-3次，去除樣品表面混 合試劑，左手用尖鑷子輕壓樣品內(nèi)部組織部分，右手用解剖針輕輕從一端至另一端劃開(kāi)表 皮層，然后用鑷子輕輕固定樣品一端，再用細(xì)毛筆移去解離的內(nèi)部組織，根據(jù)觀察需要制成 染色表皮細(xì)胞片層。
(4)用吸管吸取染色表皮細(xì)胞片層，轉(zhuǎn)移到載玻片凹槽中，用蒸餾水清洗1-2次。 準(zhǔn)備干凈的載玻片，用吸管吸取一個(gè)染色表皮片層置于其上，慢慢用鑷子和解剖針展開(kāi)片 層，使之單層平鋪于載玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。
本實(shí)施例說(shuō)明由于幼嫩藻體生長(zhǎng)時(shí)間短，其表面組織幼嫩，附著的雜質(zhì)較少，雜 藻一般沒(méi)有或很少且附著不牢固，因此前處理的強(qiáng)度要小，其組織致密性不夠強(qiáng)，所需要進(jìn) 行的染色和解離時(shí)間也稍短，各類(lèi)操作也應(yīng)更輕緩，以免樣品組織過(guò)度解離而導(dǎo)致表皮層 小片狀脫落，不易制得較大面積的表皮片層。
權(quán)利要求
1.一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，包括如下步驟 (1)配制苯胺藍(lán)染色混合試劑母液配比為乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 : 1，然后以母液為基礎(chǔ)配制O. 5% (w/v)苯胺藍(lán)染色混合試劑； (2)選取樣品選擇目標(biāo)樣品并進(jìn)行清潔，去除藻體表面的雜質(zhì)和雜藻，切成長(zhǎng)約I一1.5cm的樣品段； (3)染色及表皮細(xì)胞層解離取多數(shù)樣品，加入步驟(I)制得的混合試劑，一般4一8根樣品加入混合試劑I滴，處理正常樣品的處理時(shí)間為10 —12分鐘，幼嫩組織的處理時(shí)間為3— 4分鐘，讓樣品表皮細(xì)胞層與內(nèi)皮層細(xì)胞間充分解離并染色； (4)染色表皮片層的分離切開(kāi)表皮層，移去內(nèi)部組織，可制成面積可達(dá)Icm2的染色表皮細(xì)胞片層； (5)染色表皮片層制片染色表皮片層移置預(yù)先準(zhǔn)備的載玻片，加保濕防腐劑，封片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(I)中先將苯酚、乳酸、甘油和水的混合過(guò)程中進(jìn)行加熱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(2)中，在超聲波清洗儀中處理樣品8-10分鐘，幼嫩組織處理3-4分鐘，用潔凈海水沖洗樣品，鏡檢清洗效果。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(3)中，挑選藻體表面干凈、均勻的樣品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺藍(lán)溶液，翻動(dòng)樣品，使之均勻著色；針對(duì)樣品表皮細(xì)胞與內(nèi)皮層細(xì)胞質(zhì)地和致密性差異，利用苯酚的腐蝕性特點(diǎn)，解離表皮與內(nèi)皮層細(xì)胞間的粘質(zhì)和胞間連結(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(4)中，左手用尖鑷子輕壓樣品內(nèi)部組織部分，右手用解剖針輕輕從左至右劃開(kāi)表皮細(xì)胞層，用軟毛筆移去內(nèi)部組織，可制成面積可達(dá)I cm2的染色表皮細(xì)胞片層。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一權(quán)利要求所述一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制備方法，其制片速度快，經(jīng)濟(jì)適用，表皮細(xì)胞不變形，染色穩(wěn)定，具有殺菌防腐作用，能較長(zhǎng)時(shí)間保存。
全文摘要
一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，步驟包括混合試劑配制、一步完成離解并染色大型海藻表皮細(xì)胞層，人工操作快速制成面積可達(dá)1cm2的表皮細(xì)胞片層。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、制作速度快、顯色效果和穩(wěn)定性好，適用于顯微鏡和電鏡觀測(cè)以及表皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察與研究。
文檔編號(hào)G01N1/30GK103033401SQ20111029660
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者丁蘭平, 黃冰心 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)