專利名稱：一種基于量子點的單病毒示蹤方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于量子點的單病毒示蹤方法，屬于化學及生物醫(yī)學領域。
背景技術：
病毒侵染宿主細胞的過程非常復雜，往往包含許多階段、多種途徑并涉及不同亞細胞結構。為了滿足抗腫瘤藥物的設計及基因治療方面的發(fā)展，病毒侵染機制的研究非常重要。單病毒示蹤技術是利用顯微鏡實時監(jiān)控單個病毒或亞病毒結構在活細胞內(nèi)的運動行為，研究病毒的侵染過程及病毒與亞細胞結構之間相互作用，進一步揭示未發(fā)現(xiàn)的生物機制的動態(tài)成像技術。近幾年，單病毒示蹤技術被廣泛地應用于病毒侵染機制的研究領域， 成為監(jiān)控病毒的侵染路徑或病毒的組分與宿主細胞相互作用一個強有力的工具。但是，實現(xiàn)對病毒粒子的熒光標記成為進行單病毒示蹤的首要條件。傳統(tǒng)的熒光標記物存在易光漂、標記效率低等缺點，不能滿足長時間、實時動態(tài)可視的示蹤效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種可長時間、實時動態(tài)可視化的單病毒示
蹤方法。為了實現(xiàn)長時間的單病毒示蹤，本發(fā)明以量子點作為熒光標記物來標記病毒，利用帶有在線培養(yǎng)裝置的轉盤式熒光共聚焦為成像儀器，通過兩步法的標記策略，從而實現(xiàn)基于量子點的單病毒的長時間示蹤。具體的技術方案包括如下步驟
1.利用生物素化的試劑盒，將病毒表面進行生物素化修飾； 2利用病毒與細胞表面受體結合的作用，將生物素化的病毒吸附到細胞表面；
3.利用鏈酶親和素與生物素的相互作用，將鏈酶親和素化的量子點標記到病毒表面；
4.利用帶有在線培養(yǎng)裝置的轉盤式熒光共聚焦為成像儀器，對病毒在活細胞內(nèi)的侵染行為進行監(jiān)控。本發(fā)明利用一種簡單高效的基于量子點的病毒標記策略，建立了一種基于量子點的長時間的單病毒示蹤技術。量子點作為熒光標記物，具有獨特又優(yōu)越的光學性能，如消光系數(shù)大，量子產(chǎn)率高，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，亮度比傳統(tǒng)的熒光染料高10-100倍，光穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的熒光染料高100-1000倍等特點。該技術將成為各種病毒侵染機制的強有利工具。本發(fā)明可更廣泛地應用于生物和醫(yī)學科學等領域。


圖1量子點標記病毒的流程示意圖。圖2在細胞表面量子點標記的病毒。(左圖)細胞的微分干涉相差圖片，(右圖) 細胞表面量子點標記病毒的熒光照片。
圖3 H9N2亞型禽流感病毒在活細胞的軌跡。圖4 H9N2病毒的速度與時間的關系曲線，標尺20微米。
具體實施例方式
下面對量子點標記病毒的操作方法詳細說明。1.將狗腎上皮細胞培養(yǎng)在共焦專用的培養(yǎng)小皿中，24h后可以用于實驗。利用生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo),通過與H9N2禽流感病毒表面的氨基將生物素連接到病毒表面。具體操作如下取0.3mg生物素化試劑 Sulfo-NHS-LC-Biotin，加入到300 μ L (蛋白濃度為400 mg/ml)的純化好的病毒溶液中， 室溫搖床反應2h。多余的生物素化試劑利用NAP-5 (GE Healthcare)的脫鹽柱除掉多余的生物素化試劑，獲得體積為700 μ L標記好的病毒溶液。2.取100 μ L生物素化的病毒加入到細胞表面，4度孵育lOmin，用IX PBS緩沖溶液洗3次。3.再加入100 μ L濃度為InM的鏈霉親和素化的量子點(SA_QDs，武漢珈源量子點有限公司)到細胞表面4度孵育lOmin，用PBS緩沖溶液洗3次。4.放在100X的共焦顯微鏡下進行觀察，獲得圖2。5.用高斯濾波出去背景噪音。6.利用圖像處理軟件對單個病毒在每一幀運動位置進行獲取，得到病毒的運動軌跡(圖3)。將病毒每幀的運動速度與相對時間做曲線，得到圖4。該技術可以有效地長時間的實現(xiàn)對病毒侵染機制的動態(tài)研究。
權利要求
1.一種基于量子點的單病毒示蹤方法，其特征在于，包括如下步驟1)利用生物素化的試劑盒，將病毒表面進行生物素化修飾；2)利用病毒與細胞表面受體結合的作用，將生物素化的病毒吸附到細胞表面；3)利用鏈酶親和素與生物素的相互作用，將鏈酶親和素化的量子點標記到病毒表面；4)利用帶有在線培養(yǎng)裝置的轉盤式熒光共聚焦為成像儀器，對病毒在活細胞內(nèi)的侵染行為進行監(jiān)控。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病毒為H9N2禽流感病毒。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞為狗腎上皮細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，對病毒表面進行生物素化修飾后，利用脫鹽柱除掉多余的生物素化試劑。
全文摘要
本專利涉及一種基于量子點的單病毒示蹤方法。該方法以量子點作為熒光標記物，通過生物素與鏈酶親和素的相互作用，實現(xiàn)量子點對單個病毒的標記。通過實時動態(tài)的單顆粒成像技術，可以實現(xiàn)對單病毒侵染宿主細胞的侵染過程的全程示蹤。該標記方法具有很高的標記效率，能夠充分反映病毒在單個細胞內(nèi)的群體動態(tài)侵染行為。結合量子點優(yōu)異的光學性質(zhì)，我們建立了一種多目標的，實時的，長時間的單分子示蹤的方法，對全局地，高效地研究病毒侵染機制提供了強有力的工具。本發(fā)明可更廣泛生物醫(yī)學領域，用于研究囊膜及無囊膜病毒的侵染機制。
文檔編號G01N33/58GK102445541SQ201110299128
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權日2011年9月29日
發(fā)明者劉書琳, 龐代文, 張志凌 申請人:武漢大學