專利名稱：一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，同時還涉及一種用于結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，占胃腸道腫瘤的第3位。我國的發(fā)病率與死亡率，隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，呈逐年上升的趨勢。結(jié)直腸癌已經(jīng)成為威脅人類生命和健康不容忽視的疾病。結(jié)直腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，許多患者在確診時已經(jīng)處于晚期。大約25%的患者初次就診時就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，另外，40% -50% 新診斷患者將繼續(xù)發(fā)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。僅僅少于5%的患者能存活5年以上。因此，深入對結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究和提高結(jié)直腸癌的診斷率，對提高結(jié)直腸患者的生存率、降低其病死率具有相當重要的臨床意義。目前用于結(jié)直腸癌的診斷的方法包括大便潛血試驗、內(nèi)窺鏡檢查、影像學(xué)檢察、分子生物學(xué)檢查以及病理組織學(xué)檢查。目前在結(jié)直腸癌診斷技術(shù)中，不同的檢查手段是從不同側(cè)面不同程度反映了區(qū)別于正常組織的腫瘤形態(tài)。單一的檢查手段并不能明確病情，需要結(jié)合實際情況，選擇多種檢查手段才能做出判斷。其中病理診斷也是結(jié)直腸癌診斷中最可靠的診斷，是明確診斷以擬定治療方案所必需的依據(jù)。常規(guī)的病理形態(tài)學(xué)檢查包括脫落細胞學(xué)檢查和活體組織檢查。由于結(jié)直腸中脫落細胞常有不同程度的變性，陰性結(jié)果并不能否定腫瘤的存在，臨床上結(jié)直腸癌脫落細胞學(xué)檢查應(yīng)用范圍非常有限，主要依靠組織病理學(xué)檢查明確診斷。免疫組化是最近10多年來迅速發(fā)展起來的一門新興技術(shù)。它已被廣泛運用腫瘤研究和診斷，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測組織中的未知抗原或者抗體，主要是腫瘤相關(guān)抗原(腫瘤分化抗原和腫瘤胚胎抗原)，借以判斷腫瘤的來源和分化程度，協(xié)助腫瘤的病理診斷和鑒別診斷。目前常用的染色方法有過氧化物酶-抗過氧化物酶法，艮口 PAP法(peroxidaseantiperoxidase technique)禾口卵白素一生物素_過氧化物醇復(fù)合物法，艮 P ABC 法(avidin-biotin—peroxickse complex technique)。禾 O 用免疫組織化學(xué)方法已經(jīng)可以對許多常規(guī)方法難以判斷其來源的腫瘤加以鑒別。例如檢測細胞骨架的中間絲(intermediate filament)，其直徑平均為10nm，介于微管和微絲之間。中間絲有五類即神經(jīng)原纖維、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、結(jié)蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)和角蛋白 (keratin)。它們各有生物化學(xué)和免疫學(xué)特性，并分別存在于不同類型的細胞中，故具有相對的特異性，可用來協(xié)助診斷相應(yīng)的神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、橫紋肌和平滑肌、間葉組織和上皮細胞來源的腫瘤。目前能用于腫瘤輔助診斷和鑒別診斷的抗體已不勝枚舉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，該抗體檢測具有高靈敏性，高特異性和高準確性的特點，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細胞和正常的細胞。IL-17F在正常結(jié)腸組織上皮細胞中呈陽性表達染色，而在癌變細胞上皮中呈陰性表達。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種用于結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒在臨床流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，有效地區(qū)分結(jié)直腸癌變的上皮細胞和正常細胞，為臨床的診斷和治療提供參考依據(jù)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，該免疫組織化學(xué)染色試劑盒含有a)兔來源的抗人hterleukin-17F(IL-17F)的抗體，b)生物素標記的的羊抗兔IgG ；c) 親和素標記的HRP ；d)正常山羊血清封閉液；e)3% (體積比) ；f)DAB顯色液；g)蘇木素。本試劑盒將IL-17F這一在結(jié)直腸癌患者的癌變組織中特異性低表達的細胞因子作為用于檢測的參考指標。在本發(fā)明中關(guān)鍵是兔來源的抗人^IterleUkin-HF(IL-HF)的抗體制備，其方法包括下列步驟 A)構(gòu)建 IL-17F 表達載體。試劑盒DES -Inducible/kcreted Kit with pCoHygro購
自invitrogen公司。將人的免疫球蛋白IgGl的Fc片段(華盛頓大學(xué)Edward A. Clark博士友情贈送)標簽克隆至試劑盒中提供的PMT/BiP/V5-HisA表達質(zhì)粒中，獲得果蠅表達體系-免疫球蛋白融合質(zhì)粒(DES-Ig)。通過PCR的方法擴增人IL-17F的cDNA序列，克隆入 DES-Ig 質(zhì)粒。B)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17F表達載體的果蠅細胞系S2(試劑盒中提供的細胞)，硫酸銅誘導(dǎo)蛋白分泌表達并純化IL-17F。按照試劑盒說明書，將上述構(gòu)建成功的載體和試劑盒中提供的pCoHygro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染果蠅細胞系S2，篩選獲得穩(wěn)定細胞系；并用硫酸銅誘導(dǎo)蛋白的分泌表達。收集上清，用蛋白A-瓊脂糖(Protein Α-Sepharose)柱子購自sigma公司富集純化IL-17F-Ig融合蛋白。C)免疫兔子獲得IL-17F的多克隆抗體并鑒定。具體步驟是取200ug免疫原即 IL-17F-Ig融合蛋白與弗氏完全佐劑進行1 1混合形成乳劑，注射入兔子雙肩皮下和后大腿肌肉；間隔2周加強免疫，免疫原量減半，用弗氏不完全佐劑混合成乳劑注射臨近部位； 再間隔2周加強免疫；注射后的第7天取血。吸取血清，離心，分裝，凍存。檢測抗體效價。利用本發(fā)明中的抗IL-17F特異性的多克隆抗體，聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色常規(guī)試劑(生物素標記的的羊抗兔IgG ；親和素標記的HRP ；正常山羊血清封閉液；3% H2O2 ；DAB顯色液；蘇木素)，方便、高效、特異的輔助結(jié)直腸癌的病理檢測，可作為判斷患者預(yù)后的一個指標，對結(jié)直腸癌的檢測，基礎(chǔ)研究和檢測提供參考，具有臨床實用性和科學(xué)研究性。一種用于結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(查)試劑盒在臨床流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，該試劑盒由以下物質(zhì)組成a)兔來源的抗人 hterleukin-17F(IL_17F)的抗體。b)生物素標記的的羊抗兔IgG ；c)親和素標記的HRP;d)正常山羊血清封閉液；e)3% (體積比)H202 ；f) DAB 顯色液；
g)蘇木素；其檢查步驟是1.組織用石蠟包埋，切片，石蠟切片置于58_62°C烤箱中1小時后，脫蠟至水，用 PBS (pH7. 4)沖洗2-4次，每次4_6分鐘。2.抗原微波修復(fù)10mM pH 5. 8-6. 2枸櫞酸鈉緩沖液倒入微波修復(fù)盒內(nèi)將切片放入修復(fù)液內(nèi)，微波爐高火3min—中火7min—低火3min。自然冷卻后至室溫(20_25°C)， PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。3.切片放入3% (體積比)H2O2溶液，室溫下孵育15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。4.甩去PBS液，滴加5% BSA室溫28-32分鐘。5.甩去BSA，第一抗體按1 100的濃度稀釋。每張切片加入100 μ 1稀釋液覆蓋組織，4°C過夜。PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。6.甩去PBS液，每張切片加100 μ 1第二抗體，室溫下孵育45分鐘。PBS沖洗2_4 次，每次4-6分鐘。7.甩去PBS液，每張切片加50-100 μ 1新鮮配制的DAB溶液，室溫(20_25°C，上下相同)下孵育4-6分鐘，顯微鏡控制顯色(約lmin)。8.顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染l-3min，自來水洗。9.切片經(jīng)過梯度酒精(70-100% )脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果的觀察IL-17F蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細胞漿，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。在正常腸上皮細胞中表達，而在癌變的腸上皮細胞中不表達或低表達。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用以下判斷標準。將染色程度評分無色記O分、淡黃色記1分、棕黃色記2分和棕褐色記3 分；再將陽性細胞所占的百分比評分0分為陰性、陽性細胞數(shù)< 10%記1分、11% 50% 記2分、51 % 75 %記3分、> 75 %記4分，然后計算兩者的乘積。乘積< 3分為陰性，彡3 分為陽性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果該抗體檢測具有高靈敏性，高特異性和高準確性的特點，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細胞和正常的細胞。IL-17F在正常結(jié)腸組織上皮細胞中呈陽性染色，而在癌變細胞上皮中呈陰性。申請人:通過實時定量PCR技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)分析了 IL-17F在結(jié)直腸癌病人手術(shù)切除標本中的表達水平。發(fā)現(xiàn)20例病人手術(shù)標本中，癌變組織IL-17F的mRNA水平顯著低于正常組織(P < 0. 05)。4例病人手術(shù)標本中，癌變組織IL-17F的蛋白水平顯著低于正常組織(P < 0. 05)。


圖1為一種免疫組織化學(xué)染色圖；AC為正常的結(jié)腸組織(即病人手術(shù)切除標本的末端、遠離病灶區(qū)的正常組織)的染色圖。BD為癌變病灶區(qū)結(jié)腸組織(即病人手術(shù)切除標本的中間、病灶中心區(qū)的癌變組織) 的染色圖。AB為組織切片用IL-17F抗體進行免疫組織化學(xué)染色圖，CD為空白對照染色即組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，不加IL-17F抗體。4個圖中，僅A圖中的上皮細胞呈陽性染色(箭頭指示)，其余的圖中細胞均呈陰性染色；圖2為一種免疫組織化學(xué)染色
圖2為一種病人手術(shù)切除標本中病灶區(qū)域的癌變組織免疫組織化學(xué)染色圖。圖中 A位置為從細胞核變化觀察相對正常的結(jié)腸上皮，B位置為從細胞核變化觀察已發(fā)生癌變的結(jié)腸上皮。A位置的細胞呈陽性染色，B位置的細胞呈陰性染色。2個圖結(jié)果顯示正常結(jié)腸組織上皮細胞高表達IL-17F而癌變組織上皮細胞低/基本不表達IL-17F。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如精編分子生物學(xué)指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學(xué)出版社，1995，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實施例1 一種用于檢測結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色試劑盒，該免疫組織化學(xué)染色試劑盒包括a)兔來源的抗人 Interleukin-I7F(IL-I7F)的抗體；b)生物素標記的的羊抗兔IgG ；c)親和素標記的HRP ；d)正常山羊血清封閉液；e) 3% (體積比)H2O2 ；f) DAB 顯色液；g)蘇木素；b-g為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。在本發(fā)明中關(guān)鍵是兔來源的抗人Interleukin-17F(IL-17F)的抗體制備，其方法包括下列步驟A)構(gòu)建 IL-17F 表達載體。試劑盒 DES "Inducible/Secreted Kit with pCoHygro購自invitrogen公司。將人的免疫球蛋白IgGl的Fc片段標簽克隆至試劑盒中 PMT/BiP/V5-HisA表達質(zhì)粒中，獲得果蠅表達體系-免疫球蛋白融合質(zhì)粒(DES-Ig)。通過 PCR的方法擴增人IL-17F的cDNA序列，克隆入DES-Ig質(zhì)粒。B)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17F表達載體的果蠅細胞系S2 (試劑盒中提供的細胞)，硫酸銅誘導(dǎo)蛋白分泌表達并純化IL-17F。按照試劑盒說明書(DES -Inducible/Secreted Kit with pCoHygro試劑盒)，將上述構(gòu)建成功的載體和試劑盒中提供的pCoHygro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染果蠅細胞系S2，篩選獲得穩(wěn)定細胞系；并用硫酸銅誘導(dǎo)蛋白的分泌表達。收集上清，用蛋白A-瓊脂糖(Protein Α-Sepharose)柱子購自sigma公司富集純化IL_17F_Ig融合蛋白。C)免疫兔子獲得IL-17F的多克隆抗體并鑒定。常規(guī)方法免疫兔子，收集血清。具體步驟是取200ug免疫原即IL-17F-Ig融合蛋白與弗氏完全佐劑進行1 1混合形成乳劑， 注射入兔子雙肩皮下和后大腿肌肉；間隔2周加強免疫，免疫原量減半，用弗氏不完全佐劑混合成乳劑注射臨近部位；再間隔2周加強免疫；注射后的第7天取血。吸取血清，離心，分裝，凍存。檢測抗體效價。利用本發(fā)明中的抗IL-17F特異性的多克隆抗體，聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色常規(guī)試劑(生物素標記的的羊抗兔IgG ；親和素標記的HRP ；正常山羊血清封閉液；3% H2O2 ；DAB顯色液；蘇木素)，方便、高效、特異的輔助結(jié)直腸癌的病理檢測，可作為判斷患者預(yù)后的一個指標，對結(jié)直腸癌的檢測，基礎(chǔ)研究和檢測提供參考，具有臨床實 用性和科學(xué)研究性。一種用于檢測結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色試劑盒在臨床流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，該試劑盒由以下物質(zhì)組成a)兔來源的抗人 Interleukin-17F(IL_17F)的抗體。b)生物素標記的的羊抗兔IgG ；c)親和素標記的HRP;d)正常山羊血清封閉液；e) 3% (體積比)的 H2O2 ；f) DAB 顯色液；g)蘇木素；其檢測步驟是1.組織用石蠟包埋，切片，石蠟切片置于60°C烤箱中1小時后，脫蠟至水，用 PBS (pH7. 4)沖洗三次，每次5分鐘。2.抗原微波修復(fù)10mM pH 6. 0士0. 1枸櫞酸鈉緩沖液倒入微波修復(fù)盒內(nèi)將切片放入修復(fù)液內(nèi)，微波爐高火3min—中火7min—低火3min。自然冷卻至室溫(20-25 °C )后， PBS沖洗三次，每次5分鐘。3.切片放入3% (體積比)過氧化氫溶液，室溫下孵育15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗三次，每次5分鐘。4.甩去PBS液，滴加5 % BSA室溫30分鐘。5.甩去BSA，第一抗體按1 100的濃度稀釋。每張切片加入100 μ 1稀釋液覆蓋組織，4°C過夜。PBS沖洗三次，每次5分鐘。6.甩去PBS液，每張切片加100 μ 1第二抗體，室溫下孵育45分鐘。PBS沖洗三次， 每次5分鐘。7.甩去PBS液，每張切片加50-100 μ 1新鮮配制的DAB溶液，室溫(20_25°C，上下相同)下孵育5分鐘，顯微鏡控制顯色(約lmin)。8.顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染2min，自來水洗。9.切片經(jīng)過梯度酒精(70-100% )脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果的觀察IL-17F蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細胞漿，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。在正常腸上皮細胞中表達，而在癌變的腸上皮細胞中不表達或低表達。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用以下判斷標準。將染色程度評分無色記O分、淡黃色記1分、棕黃色記2分和棕褐色記3 分；再將陽性細胞所占的百分比評分0分為陰性、陽性細胞數(shù)< 10%記1分、11% 50%記2分、51 % 75 %記3分、> 75 %記4 分，然后計算兩者的乘積。乘積< 3分為陰性，彡3 分為陽性。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，該試劑盒含有a)兔來源的抗人hterleukin-17F的抗體；b)生物素標記的的羊抗兔IgG；c)親和素標記的HRP；d)正常山羊血清封閉液；e)3%體積比H2O2 ；f)DAB顯色液；g)蘇木素。
2.權(quán)利要求1所述的一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，其特征在于所述的兔來源的抗人hterleukin-17F的抗體制備方法如下A)構(gòu)建IL-17F表達載體，將人的免疫球蛋白IgGl的Fc片段標簽克隆至試劑盒中pMT/ BiP/V5-HisA表達質(zhì)粒中，獲得果蠅表達體系-免疫球蛋白融合質(zhì)粒DES-Ig，通過PCR的方法擴增人IL-17F的cDNA序列，克隆入DES-Ig質(zhì)粒；B)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17F表達載體的果蠅細胞系S2，硫酸銅誘導(dǎo)蛋白分泌表達并純化 IL-17F，將構(gòu)建成功的載體和試劑盒中提供的pCoHygro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染果蠅細胞系S2，篩選獲得穩(wěn)定細胞系；并用硫酸銅誘導(dǎo)蛋白的分泌表達，收集上清，用蛋白A-瓊脂糖柱子富集純化IL-17F-Ig融合蛋白；C)免疫兔子獲得IL-17F的多克隆抗體并鑒定，常規(guī)方法免疫兔子，收集血清，取200ug 免疫原即IL-17F-Ig融合蛋白與弗氏完全佐劑進行1:1混合形成乳劑，注射入兔子雙肩皮下和后大腿肌肉；間隔2周加強免疫，免疫原量減半，用弗氏不完全佐劑混合成乳劑注射； 再間隔2周加強免疫；注射后的第7天取血，吸取血清，離心，分裝，凍存。
3.一種用于結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒，其包含有a)兔來源的抗人hterleukin-17F的抗體；b)生物素標記的的羊抗兔IgG；c)親和素標記的HRP；d)正常山羊血清封閉液；e)3%體積比H2O2；f)DAB顯色液；g)蘇木素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)兔來源的抗人Interleukin-17F(IL-17F)的抗體，b)生物素標記的羊抗兔IgG；c)親和素標記的HRP；d)正常山羊血清封閉液；e)3%體積比H2O2；f)DAB顯色液；g)蘇木素。該檢測具有高靈敏性，高特異性和高準確性的特點，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細胞和正常的細胞。IL-17F在正常結(jié)腸組織上皮細胞中呈陽性表達染色，而在癌變細胞上皮中呈陰性表達。有效地區(qū)分結(jié)直腸癌變的上皮細胞和正常細胞，為臨床的診斷和治療提供參考依據(jù)。
文檔編號G01N33/574GK102435735SQ201110301990
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者童攢, 董晨 申請人:武漢康邁生物技術(shù)有限公司