專利名稱：凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測探針、引物、試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，主要是一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測探針、引物、試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，是嚴重威脅著人類健康的疾病。雖然我國的腫瘤治療取得了很大進展，但發(fā)展并不平衡，總體治療水平還很低，目前我國癌癥治愈率(5年生存率)仍徘徊在20% -30%左右，而國外經(jīng)濟發(fā)達國家癌癥治愈率已達到50% -60%, 這主要與早期確診率高有關(guān)?？梢娢覈谀[瘤早期診斷方面與國外相比還存在較大差距。Survivin 基因是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of Apoptosis Family of Protein, IAPs)中結(jié)構(gòu)獨特的新成員，是凋亡抑制蛋白家族中相對分子量最小的成員，但也是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子。該基因于1997年由耶魯大學(xué)Altieri等用效應(yīng)細胞蛋白酶受體 1 (Effector Cell Protease Rec印tor_l，EPR-1) cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中首先分離出來。該基因定位于人染色體17q25，全長1471Λ，有4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，編碼142個氨基酸，蛋白相對分子量大約為16.5kD。根據(jù)文獻報道，Survivin基因廣泛表達于人的胚胎組織和各種腫瘤組織，但正常成人組織低表達或不表達。所以Survivin基因檢測已作為與腫瘤的早期篩選(包括癌前病變)的重要指標，并有望成為一種廣譜的腫瘤診斷標志物。此外，Survivin基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、與預(yù)后密切相關(guān)，檢測腫瘤標本中該基因的表達可作為多數(shù)腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后指標?，F(xiàn)有技術(shù)中Survivin的快速檢測方法如下1、免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)檢測方法主要是檢測Survivin基因表達過程中產(chǎn)生的蛋白。常規(guī)的免疫學(xué)檢測法主要是免疫熒光法(IFA)、酶免疫法(EIA)等。免疫熒光法又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。但是，該方法非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。酶免疫法最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)，是將特異性抗原或抗體吸附于固相載體上，使其與待測樣品中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺推算待測抗原或抗體的含量。ELISA特異性強，但若采用單一抗原建立ELISA法進行檢測，漏檢率高，可能出現(xiàn)假陽性。另外，出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時候，往往不易解釋。2、分子生物學(xué)方法①核酸探針法帶有標記物的DNA或RNA片段即核酸探針能與互補的核酸序列特異結(jié)合。核酸探針的標記可用核素P32、S35、1131等，以及非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛等。核酸探針法的主要特點是敏感性、特異性都較強。②普通PCR法PCR法通過兩段特異性寡核甘酸引物，在體外經(jīng)DNA聚合酶催化，擴增與兩引物互補的DNA序列之間的區(qū)段，檢測樣品中是否有該序列。PCR較血清學(xué)方法更敏感，但特異性和重復(fù)性較低，若結(jié)合斑點雜交、微孔板雜交、濾膜核酸探針雜交等核酸雜交方法和酶聯(lián)免疫等方法對PCR產(chǎn)物進行分析，靈敏度和特異性均可大大提高。隨著現(xiàn)代核酸技術(shù)的發(fā)展，建立在基因水平上的核酸擴增技術(shù)——PCR及相關(guān)技術(shù)，由于其高敏感性和高特異性，可在Survivin基因的臨床檢測中得到廣泛應(yīng)用，成為實驗室診斷的主要方法。這些以PCR為基礎(chǔ)的檢測方法，都需要花費時間對PCR擴增產(chǎn)物進行后處理，PCR擴增產(chǎn)物中高濃度的目標DNA分子會以氣溶膠的形式污染整個實驗空間，由于PCR的高度靈敏性，甚至可以檢測出反應(yīng)體系中10個拷貝的模板濃度，從而可能給今后的PCR實驗帶來嚴重的假陽性；常規(guī)PCR方法是終點檢測法，由于PCR反應(yīng)具有平臺期，無法依據(jù)終產(chǎn)物對起始模板進行精確定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是要克服上述技術(shù)的不足，而提供一種凋亡抑制蛋白Survivin 基因核酸檢測探針、引物、試劑盒及其檢測方法，克服PCR擴增產(chǎn)物終點檢測所存在的“平臺效應(yīng)”對產(chǎn)物定量的影響，具有高度的特異性、靈敏度與準確性，且技術(shù)操作簡便、自動化程度高的Survivin基因核酸檢測試劑盒。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測引物，包括如下的序列組包括下述正向引物，反向引物的一組序列正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示5' -TGTGATTAGACAGGCCCAGTGA-3 ‘，反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示5' -CACAGCATCGAGCCAAGTCA-3 ‘，或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補的一組序列。本發(fā)明所述的這種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的探針，為以下序列
熒光探針如序列表中SEQ ID NO. 3 所示5' -CACATGCTGGCCGCT-3 ‘；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補的一組序列；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用FAM、MGB熒光基團修飾。作為優(yōu)選，其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3 或 Cy5 ；3’ 端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。本發(fā)明所述的凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的試劑盒，該試劑盒含有(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，各組分含量的配比為濃度為50ρπιΟ1/μ 1的Oligo d (T)18Primers 用量 2 μ L、5 X AMV Buffer 用量 4 μ L、濃度為 10mmol/L 的 dNTP Mixture 用量 1 μ L ；濃度為 40U/ μ L 的 Ribonuclease Inhibitor 用量為 0. 5 μ L ；濃度為 5U/ μ L 的 AMV酶用量為1 μ L ；AMV酶是具有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，并繼續(xù)合成cDNA第二條鏈功能的具有逆轉(zhuǎn)錄活性的聚合酶。(2)FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTP Mixture、Taq酶、 10XPCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、Survivin基因正向引物、Survivin基因反向引物、 Survivin基因探針；其中Taq酶為具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶；Survivin基因正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' -TGTGATTAGACAGGCCCAGTGA-3‘，Survivin基因反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示5' -CACAGCATCGAGCCAAGTCA-3‘，Survivin基因探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示5 ‘ -CACATGCTGGCCGCT-3‘；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用FAM、MGB熒光基團修飾；探針5'端標記FAM熒光報告基團，3 ‘端標記MGB熒光淬滅基團；(3) RNA提取液，主要成分為1Trizol reagents，其中包括苯酚、8_羥基喹啉、β -巰基乙醇、異硫氰酸胍成分；(4)Hank' s 液；其中包括NaCl、KCl、NaHC03、N￡i2HP04 · 12H20、KH2P04、葡萄糖、酚紅。(5)陰性質(zhì)控品，為不含Survivin基因的無菌DEPC純化水；(6)陽性質(zhì)控品，為1. OX 106COpy/mL含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品；(7)臨界陽性質(zhì)控品，為1. OX 104COpy/mL含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品；(8)陽性定量質(zhì)控品，為含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品，工作濃度為 1. OX 107copy/ml，1. OX 106copy/ml，1· 0 X 105copy/ml 和 1. OX 104copy/ml ；陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10進行增殖。作為優(yōu)選，其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3 或 Cy5 ；3’ 端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。作為優(yōu)選，所述的Hank’ s液由多種無機鹽組成，其中每IOOOmL Hank’ s液中包括
NaCl8g
KCl0.4g
NaHCO30.3 5g
Na2HPO4-12H200.12g
KH2PO40.06g
葡萄糖Ig
酚紅0.02g。作為優(yōu)選，所述FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量 27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動Taq酶用量0. 5 μ L ；濃度為10mmol/L的dNTP Mixture 用量IyL ;10XPCR Buffer用量5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L ；濃度為 10 μ mol/L的Survivin基因正向引物用量1. 5 μ L ；濃度為10 μ mol/L的Survivin基因反向引物用量1. 5 μ L ；濃度為10 μ mol/L的Survivin探針用量1 μ L。本發(fā)明所述的這種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸的檢測方法，包括下列步驟(1)采集樣品采集腫瘤患者新鮮全血或腫瘤新鮮組織；a、腫瘤新鮮全血用無菌注射器抽取受檢者3-5毫升，注入Na2EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻送檢；腫瘤新鮮組織取活檢或手術(shù)病人腫瘤組織500mg，放于^iil DEPC水處理過的EP 管中，密閉送檢；b、標本保存和運輸如果標本不立即測試，應(yīng)儲存于室溫，避免反復(fù)凍融而造成的溶血；標本長途運送應(yīng)采用4°C冰壺；(2)樣品處理a、新鮮全血混勻抗凝血，取500 μ 1-1000 μ 1轉(zhuǎn)至一潔凈的2ml離心管中，編號標記；4000r/min離心IOmin ；棄血清，加入600 μ 1 Hank，s液，混勻重懸；另取一新的2ml離心管加入800 μ 1人淋巴細胞分離液，將紅細胞重懸液慢慢的加在分離液上層，2000r/min 離心20min ；用毛細吸管或Iml —次性注射器吸取白色中間懸浮層于另一新的1. 5ml離心管，加入800 μ 1 Hank，s液，混勻，12000r/min離心2min,白色沉淀用50 μ 1 DEPC純化水重懸，加入150 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置5min ；b、新鮮組織取500mg腫瘤組織，加入Iml生理鹽水，充分研磨成組織勻漿或用液氮研磨，取100 μ 1勻漿液加500 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置5min ；⑶RNA提取加入30 μ 1氯仿，用力震蕩15s_30s，冰浴IOmin, 4°C 12，OOOrpm離心15min ；小心將上層水相100 μ 1轉(zhuǎn)移到干凈0. 5ml離心管中，加100 μ 1異丙醇混勻，冰浴15min，12000rpm離心15min ；棄上清，加入300 μ 1 75 %的DEPC乙醇，充分顛倒混勻， 13，OOOrpm離心lOmin，小心吸去大部分乙醇；將提取管敞口在室溫空氣中干燥5-lOmin待乙醇揮發(fā)干凈，用11 μ 1 DEPC H2O溶解沉淀；(3)逆轉(zhuǎn)錄向裝有8. 5 μ L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入11 μ LDEPC水溶解的RNA樣品，5，OOOrpm離心10秒；反應(yīng)時間:42°C，60分鐘；(4)加樣向裝有45μ L FQ-PCR核酸擴增液的PCR反應(yīng)管中分別加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， 陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品，陽性定量質(zhì)控品各5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm 離心10秒；(5) FQ-PCR擴增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；94 "C 5 分鐘；94 °C 30 秒、58 °C 45 秒，5 個循環(huán)；94°C 30秒、58°C 45秒，35個循環(huán)，收集熒光信號，在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值；(6)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于 28且小于或等于32的為臨界陽性。進一步地，當需要繪制標準曲線時，另取4個反應(yīng)管，直接加入不同濃度梯度的陽性定量質(zhì)控品5 μ L，5，OOOrpm離心10秒，放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。本發(fā)明有益的效果是本發(fā)明試劑盒利用特異性的探針來檢測Survivin基因表達，檢測完成后無需開蓋電泳，避免了產(chǎn)物污染及對實驗室人員的傷害。本發(fā)明可用LNA探針，AllgloTM探針來實現(xiàn)。本發(fā)明實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比， 實時檢測克服了擴增產(chǎn)物終點檢測所存在的“平臺效應(yīng)”對產(chǎn)物定量的影響，它具有高度的特異性、靈敏度與準確性，且技術(shù)操作簡便、自動化程度高，由于采用閉管操作，不需要PCR 產(chǎn)物后處理，有效解決PCR污染問題等特點，結(jié)果可靠。


圖1是本發(fā)明實施例1中提供的實驗結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實施例2中提供的實驗結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實施例3中提供的實驗結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實施例4中提供的實驗結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實施例5中提供的實驗結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實施例5中提供的標準曲線。圖中圖1、圖2、圖3、圖4和圖5的橫坐標表示表示循環(huán)數(shù)(Cycle number)，縱坐標表示熒光值(Delta Rn)；圖6的橫坐標表示LogC (Survivin基因反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA起始濃度的對數(shù)值)，縱坐標表示Ct值。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合舉例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的舉例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種Survivin基因核酸檢測試劑盒，本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液， 1 Oligod(T) 18Primers>5XAMV Buffer> dNTP Mixture^ Ribonuclease Inhibitor、AMV 酶；FQ-PCR 反應(yīng)液，包括 DEPC 處理水、dNTP Mixture、Taq 酶、IOXPCR Buffer、含有 Mg2+離子的溶液、Survivin基因正向引物、Survivin基因反向引物、Survivin基因探針；RNA提取液為iTrizol Reagents其中包括苯酚、8-羥基喹啉、β -巰基乙醇、異硫氰酸胍等成分； Hanks 液，其中包括 NaCl、KC1、NaHC03、Na2HPO4 · 12H20、KH2PO4、葡萄糖、酚紅；陰性質(zhì)控品， 為不含Survivin基因的無菌DEPC純化水；陽性質(zhì)控品，為高濃度含Survivin基因的質(zhì)粒標準品；臨界陽性質(zhì)控品，為低濃度含Survivin基因的質(zhì)粒標準品；陽性定量質(zhì)控品，為含有Survivin的高度保守的263個堿基對的核苷酸片段的pUCm-T重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌TOPlO中增殖；試劑盒的制造1.試劑本試劑盒制造過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司。2. FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液制備(1)引物及探針設(shè)計與合成選擇Survivin基因作為目標檢測基因，通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)檢索，獲得在多種腫瘤病人中均可檢測到的野生型
9survivin 基因(NCBI 檢索號BC065497. 1)以及其剪接變異體 survivin-ΔEx3 (NCBI 檢索號ΝΜ_001012270· 1)和 survivin_2B(NCBI 檢索號ΝΜ_001012271· 1)的序列，并用 MEGA4.0軟件對3個序列進行比對，選擇其中一段保守序列，該序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示5 ‘ -TGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGG CAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTG-3 ‘，利用實時 TaqMan 熒光定量 PCR 的專業(yè)設(shè)計軟件I^rimer Express 3. 0設(shè)計引物、探針序列，引物、探針序列不僅要滿足軟件中各項指標，而且要確保Survivin引物、探針序列能檢測Survivin基因及其變異體序列。在本發(fā)明中，Survivin探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3 或Cy5 ；3，端修飾的熒光染料可選自TAMRA、Eclipse，BHQl，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本實施例中熒光報告基團設(shè)計為FAM，F(xiàn)AM的激發(fā)波長為485nm，接收波長為527nm，淬滅基團設(shè)計為 MGB。設(shè)計結(jié)果如下表所示
引物名稱堿基純化方式引物序列(5’ -3’ )Survivin-F22bpPAGETGTGATTAGACAGGCCCAGTGASurvivin-R20bpPAGECACAGCATCGAGCCAAGTCA探針名稱報告基團淬滅基團合成序列Survivin-PFAMMGBCACATGCTGGCCGCT表中F :forward，正向；Survivin-F 表示 Survivin 基因正向引物。R :reverse,反向；Survivin-R 表示 Survivin 基因反向弓I物。P :probe,探針；Survivin-Ρ 表示 Survivin 基因探針，探針既可為 iTaciMan-MGB 探針也可為LNA探針。FAM:熒光報告基團。MGB:熒光淬滅基團。按照上表的設(shè)計結(jié)果，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司anvitrogen Corporation Shanghai Representative Office)合成弓丨物禾口探針。(2) FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液配制DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動Taq酶用量0. 5μ L ；濃度為 10mmol/L的dNTP Mixture用量 1 μ L ;10XPCR Buffer用量 5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、濃度為10 μ mol/L的Survivin基因正向引物用量1. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L的Survivin基因反向引物用量1. 5 μ L、濃度為10 μ mol/ L的Survivin探針用量1 μ L。3.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制濃度為50pmol/y 1的Oligo dO^8Primers用量2μ L、 5 X AMVBuffer 用量 4 μ L、濃度為 10mmol/L 的 dNTP Mixture 用量 1 μ L ；濃度為 40U/ μ L 的 Ribonuclease Inhibitor 用量為 0. 5 μ L ；濃度為 5U/ μ L 的 AMV 酶用量為 1 μ L。4.陰性質(zhì)控品制備為不含Survivin基因的無菌DEPC純化水
10
取經(jīng)檢驗合格的陰性質(zhì)控品為純化水，直接吸取5 μ L作模板。5.陽性質(zhì)控品制備高濃度含Survivin基因的陽性質(zhì)粒取含Survivin基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Τ0Ρ10增殖，質(zhì)粒合成和菌株由上海桑尼生物科技有限公司提供。先經(jīng)過1 過夜活化，在培養(yǎng)增殖4 證，用生工生物(上海)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取含Survivin基因的重組質(zhì)粒，利用微量分光光度計測 A260定量，然后根據(jù)公式換算并稀釋至1. OX 106cOpy/ml，即可作為陽性質(zhì)控品模板。6.臨界陽性質(zhì)控品制備低濃度含Survivin基因的陽性質(zhì)粒取含Survivin基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10增殖，質(zhì)粒合成和菌株由上海桑尼生物科技有限公司提供。先經(jīng)過1 過夜活化，在培養(yǎng)增殖4 證，用生工生物(上海)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取含Survivin基因的重組質(zhì)粒，利用微量分光光度計測 A260定量，然后根據(jù)公式換算并稀釋至1. OX 104cOpy/ml，即可作為臨界陽性質(zhì)控品模板。7. RNA提取液，為"Trzizol Reagents，其中包括苯酚、8_羥基喹啉、β -巰基乙醇、 異硫氰酸胍等成分。8. Hanks 液，其中包括 NaCl、KCl、NaHCO3、Nei2HPO4 · 12Η20、ΚΗ2Ρ04、葡萄糖、酚紅。9.陽性定量質(zhì)控品1，含有約1.0X107copy/ml的含Survivin基因的陽性質(zhì)粒；10.陽性定量質(zhì)控品2，含有約1. OX 106COpy/ml的含Survivin基因的陽性質(zhì)粒；11.陽性定量質(zhì)控品3，含有約1.0X105copy/ml的含Survivin基因的陽性質(zhì)粒；12.陽性定量質(zhì)控品4，含有約1. OX 104COpy/ml的含Survivin基因的陽性質(zhì)粒；陽性定量質(zhì)控品，為含有Survivin的高度保守序列的263個堿基對的核苷酸片段的pUCm-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA 純化試劑盒純化，用分光光度計測A26tl定量，然后根據(jù)公式換算并稀釋至1.0X IO9Copy/ ml, -20°C保存。貯存濃度為1.0X109COpy/ml，使用前用無菌生理鹽水或0. Olmol/L PBS進行10倍梯度的系列稀釋。工作濃度依次為1.0X107copy/ml，1.0X106copy/ml， 1. 0X105copy/ml 和 1. OX 104copy/ml，使用前，12000rmp 離心 1 分鐘，取 5μ L 作模板。本發(fā)明的試劑盒可以按照下表進行配置(Μ人份/盒)
權(quán)利要求
1.一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測引物，其特征在于包括如下的序列組 包括下述正向引物，反向引物的一組序列正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示5' - TGTGATTAGACAGGCCCAGTGA -3，， 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 所示5' - CACAGCATCGAGCCAAGTCA -3，， 或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列； 或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列； 或者與上述序列的堿基互補的一組序列。
2.一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的探針，其特征在于為以下序列 熒光探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示5' - CACATGCTGGCCGCT -3，；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列； 或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列； 或者與上述序列的堿基互補的一組序列；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用FAM、MGB熒光基團修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的探針，其特征在于， 其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自:FAM, HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
4.一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，各組分含量的配比為濃度為50pmol/μ 的Oligo d (T)18 Primers 用量 2 L、5XAMV Buffer 用量 4 L、濃度為 10mmol/L WdNTP Mixture 用量 1 L ；濃度為 40U/ L 的 Ribonuclease hhibitor 用量為 0. 5 L ；濃度為 5 U/ L 的 AMV 酶用量為1 L ；(2)FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTP Mixture、Taq酶、10XPCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、Survivin基因正向引物、Survivin基因反向引物、Survivin 基因探針；Survivin基因正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示5’- TGTGATTAGACAGGCCCAGTGA -3’ ，Survivin基因反向引物如序列表中SEQ ID N0. 2所示5’- CACAGCATCGAGCCAAGTCA -3’ ，Survivin基因探針如序列表中SEQ ID N0. 3所示5’- CACATGCTGGCCGCT -3’ ；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用FAM、MGB熒光基團修飾；(3)RNA提取液，Trizol reagents，其中包括苯酚、8—羥基喹啉、β-巰基乙醇、異硫氰酸胍成分；(4)Hank，s 液；(5)陰性質(zhì)控品，為不含Survivin基因的無菌DEPC純化水；(6)陽性質(zhì)控品，為1.OX 106COpy/mL含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品；(7)臨界陽性質(zhì)控品，為1.OX 104COpy/mL含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品；(8)陽性定量質(zhì)控品，為含Survivin基因的陽性質(zhì)粒標準品，工作濃度為1.0X107copy/ml, 1.0X IO6 copy/ml，1. OX IO5 copy/ml和 1. 0X IO4 copy/ml ；陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10進行增殖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的試劑盒，其特征在于，其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自:FAM, HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ； 3，端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse，BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述的Hank’ s液由多種無機鹽組成，其中每IOOOmL Hank’ s液中包括NaCl8gKCl0.4gNaHCO30. 35gNa2HPO4 · 12H200. 12gKH2PO40.06g葡萄糖Ig酚紅0.02g。根據(jù)權(quán)利要求4所述的凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測的試劑盒，其特征在于， 所述FQ-PCR核酸擴增反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27.5 ？ L ；濃度為 5U/ L的熱啟動Taq酶用量0. 5 L ；濃度為 10mmol/L WdNTP Mixture用量 1 L ； 10XPCR Buffer 用量 5 L ；濃度為 25mmol/L 的 MgCl2溶液用量 7 L ；濃度為 10 μ mol/L 的 Survivin 基因正向引物用量1.5 L ；濃度為10 μ mol/L的Survivin基因反向引物用量1.5 L;濃度為 10 μ mol/L 的 Survivin 探針用量 1 L。一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟(1)采集樣品采集腫瘤患者新鮮全血或腫瘤新鮮組織；a、腫瘤新鮮全血用無菌注射器抽取受檢者3-5毫升，注入Na2EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻送檢；腫瘤新鮮組織取活檢或手術(shù)病人腫瘤組織500mg，放于aiil DEPC水處理過的EP管中， 密閉送檢；b、標本保存和運輸如果標本不立即測試，應(yīng)儲存于室溫，避免反復(fù)凍融而造成的溶血；標本長途運送應(yīng)采用4°C冰壺；(2)樣品處理:a、新鮮全血混勻抗凝血，取500μ 1 -1000 μ 1轉(zhuǎn)至一潔凈的2 ml離心管中，編號標記；4000r/min離心IOmin ；棄血清，加入600 μ 1 Hank，s液，混勻重懸；另取一新的2ml離心管加入800 μ 1人淋巴細胞分離液，將紅細胞重懸液慢慢的加在分離液上層，2000r/min 離心20min ；用毛細吸管或Iml —次性注射器吸取白色中間懸浮層于另一新的1. 5ml離心管，加入800 μ 1 Hank，s液，混勻，12000r/min離心2min,白色沉淀用50 μ 1 DEPC純化水重懸，加入150 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置5min ；b、新鮮組織取500mg腫瘤組織，加入Iml生理鹽水，充分研磨成組織勻漿或用液氮研磨，取100 μ 1勻漿液加500 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置5min ；(3)RNA提取加入30 μ 1氯仿，用力震蕩15s-30s，冰浴lOmin，4°C 12, OOOrpm離心15min ；小心將上層水相100 μ 1轉(zhuǎn)移到干凈0. 5ml離心管中，加100 μ 1異丙醇混勻，冰浴15min，12000rpm離心15min ；棄上清，加入300 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分顛倒混勻， 13, OOOrpm離心lOmin，小心吸去大部分乙醇；將提取管敞口在室溫空氣中干燥5-lOmin 待乙醇揮發(fā)干凈，用11 μ 1 DEPC H2O溶解沉淀；(3)逆轉(zhuǎn)錄向裝有8.5 L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入11 LDEPC水溶解的RNA樣品，5，OOOrpm離心10秒；反應(yīng)時間:42°C，60分鐘；(4)加樣向裝有45 LFQ-PCR核酸擴增液的PCR反應(yīng)管中分別加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品，陽性定量質(zhì)控品各5 L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心10秒；(5)FQ-PCR擴增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；·94 0C 5分鐘；·94 0C 30 秒、58°C 45 秒，5 個循環(huán)；·94°C 30秒、58°C 45秒，35個循環(huán)，收集熒光信號，在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值；(6)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于觀且小于或等于32的為臨界陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凋亡抑制蛋白Survivin基因核酸檢測探針、引物、試劑盒及其檢測方法。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包括Oligod(T)18Primers、5×AMVBuffer、dNTPMixture、AMV酶；FQ-PCR反應(yīng)液，包括DEPC處理水、dNTPMixture、Taq酶、10×PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、Survivin基因正向引物、Survivin基因反向引物、Survivin基因探針等。本發(fā)明采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測SurvivinmRNA表達量，本發(fā)明具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK102409090SQ201110302059
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者王業(yè)富, 王美玉, 鄭毅, 鄭隆泗, 馬強 申請人:鄭隆泗