專利名稱：聚苯乙烯納米金包微粒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫體外診斷領域，特別涉及醫(yī)療器械體外診斷試劑中采用免疫透射比濁法，作為參與反應的抗原或抗體(蛋白質等生物高分子物質)的一種非特異性的載體及其制備方法。
背景技術：
免疫透射比濁法的基本原理是檢測一定體積的溶液通過的光線量。當光線通過時，由于被測液中的抗原抗體復合物對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測定的光通量和抗原抗體復合物的量成反比?，F(xiàn)有的體外診斷試劑免疫透射比濁法方法是用測定目標抗原或抗體的免疫動物(如羊或兔等)產(chǎn)生抗體或抗抗體(蛋白質)后，采集其血液分離血清，即多克隆抗血清，滴定效價，制成一定校價的抗血清溶液，即為體外診斷試劑。再與人體高效價的目標抗原或抗體反應產(chǎn)生一定的濁度，然后用免疫透射比濁法來測定其濃度。由于這種方法的靈敏度不高，若測定的目標抗原或抗體的含量在毫克級、微克級甚至納克級時，在生化分析儀上用免疫透射比濁法就無法測定。為解決這一困擾臨床檢驗醫(yī)學的技術難題，人們提出多種技術解決方案，中國專利申請CN200810057556. 9提供一種前白蛋白檢測試劑盒，CN201010526950.X提供一種顆粒增強免疫透射比濁法試劑盒及其制備方法。本發(fā)明提供一種聚苯乙烯納米金包微粒，并提供一種聚苯乙烯納米金包微粒的制備方法。

發(fā)明內容
為了解決免疫透射比濁法測定的靈敏度問題，本發(fā)明提供一種聚苯乙烯納米金包微粒及其制備方法，由于微粒的金表面粗糙、非特異性物理吸附在等電點范圍的抗體或抗抗體，形成特異性的抗體或抗原體吸附的金包微粒體，即免疫增強體外診斷試劑。與測定的目標抗原或抗體反應時，產(chǎn)生的濁度大為增加，幾何級數(shù)地增大了測定的靈敏度，從而實現(xiàn)在生化分析儀上用免疫透射比濁法測定人體含量在毫克級、微克級甚至納克級抗原或抗體。本發(fā)明所述的技術方案如下
本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒由下列重量比例的成份構成
苯乙烯單體(純化) 11. 8 12. 2;
茶油乳化劑5. 2^5. 6 ；
氯化金交聯(lián)劑3. 8 4. 2 ；
聚乙二醇 6000:1.4 ；
聚醚三醇2. 4 ；
過碘酸鈉5. M ；
氫氧化鈉1. 46 ；
白磷乙醚飽和液8. 2 ；
蒸餾水余量。
所述的苯乙烯單體(純化)重量份比例為12%。所述的茶油乳化劑重量份比例為5. 2%。所述的氯化金交聯(lián)劑重量份比例為3. 8%。所述的聚苯乙烯納米金包微粒制備方法如下
步驟一、苯乙烯單體純化
按2:1重量份比例取聚苯乙烯單體和濃度為ImmoL/L的氫氧化鈉溶液于分液漏斗中， 萃取10分鐘，靜置15分鐘，分離并棄去下層氫氧化鈉水溶液，用蒸餾水如此反復處理，直至苯乙烯單體洗至中性為止； 步驟二、茶油乳化劑制備
取100毫升茶油和100毫升蒸餾水，加熱至60°C，攪拌1(Γ15分鐘，再加入氫氧化鈉固體20克和蒸餾水200毫升，加熱攪拌到80°C，加熱維持4(Γ60分鐘，直至皂化完全為止，即得到茶油乳化劑；
步驟三、氯化金交聯(lián)劑制備
將整個包裝(小瓶或安瓿瓶)一次性溶解，按1 :99重量份比例，用3. 5-二甲硫基甲苯二胺配成氯化金交聯(lián)劑；
步驟四、苯乙烯單體的聚合按照重量份比例分別取出以下成份 茶油乳化劑5. 2^5. 6
苯乙烯單體12
過碘酸鈉5. 54
氯化金交聯(lián)劑 3. 8 4. 2 聚乙烯醇6000:1.4
聚醚三醇2. 4
氫氧化鈉1. 46
白磷乙醚飽和液 8. 2 蒸餾水余量
在蒸餾水中首先加入茶油乳化劑加熱至60°C，以200次/分鐘速度連續(xù)攪拌5、分鐘， 再分別加入苯乙烯單體、過碘酸鈉，繼續(xù)加熱并維持85°C以上，且不停攪拌6小時，隨后取樣鏡檢，無單體油珠，聚合反應完成，即將苯乙烯單體聚合，得到聚苯乙烯微粒； 步驟五、聚苯乙烯微粒與氯化金交聯(lián)劑交聯(lián)
在步驟四中所得的聚苯乙烯微粒中，按照步驟四所述的重量份比例依次加入氯化金交聯(lián)劑、聚乙烯醇6000、聚醚三醇、氫氧化鈉，用工作頻率大于40KHz超聲波機進行超聲乳化 15分鐘，再加熱至沸騰，一次性快速加入步驟四所述的白磷乙醚飽和液，并混勻，再保持沸騰纊10分鐘，溶液顏色首先變黑，再逐漸變成混濁的酒紅色，交聯(lián)反應完成，交聯(lián)成聚苯乙烯金包微粒；
步驟六、金包微粒的粒徑篩選
取上述合成的聚苯乙烯金包微粒與蒸餾水按照2 8的重量份比例稀釋，分別倒入塑料管中，用轉速為4500轉/分鐘進行離心15分鐘，去除沉淀物厚，再放入高速離心機中，用 13000轉/分鐘轉速再離心15分鐘，即可得到30(T500nm粒度的微粒沉淀，在高倍鏡下可見
5淡紅色乳膠顆粒，此即聚苯乙烯納米金包微粒。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒的水溶液為均勻分散的混懸液，未經(jīng)高速離心不會沉淀。金包微粒作為抗原或抗體載體參加免疫濁度反應，呈幾何級數(shù)放大了測定目標抗原或抗體的靈敏度，大大提高了免疫透射比濁法測定靈敏度，把復雜的化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫反應才能檢測的微克級、納克級的目標抗原或抗體，在生化分析儀即可直接測定，實際使用效果好。


圖1為本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒制備流程圖。
具體實施例方式下面將結合具體的實施例來說明本發(fā)明的內容。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒由下列重量比例的成份構成 苯乙烯單體(純化) 11. 8 12. 2;
茶油乳化劑5. 2^5. 6 ；
氯化金交聯(lián)劑3. 8 4. 2 ；
聚乙二醇 6000:1.4 ；
聚醚三醇2. 4 ；
過碘酸鈉5. M ；
氫氧化鈉1. 46 ；
白磷乙醚飽和液8. 2 ；
蒸餾水余量。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒成份中，苯乙烯單體(純化)重量份優(yōu)化比例為12%，茶油乳化劑重量份優(yōu)化比例為5. 2%，氯化金交聯(lián)劑重量份優(yōu)化比例為3. 8%。如圖1所示為本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒制備流，其制備方法分為六個步驟，具體如下
步驟一、苯乙烯單體純化
按2:1重量份比例取聚苯乙烯單體和濃度為ImmoL/L的氫氧化鈉溶液于分液漏斗中， 萃取10分鐘，靜置15分鐘，分離并棄去下層氫氧化鈉水溶液，用蒸餾水如此反復處理，直至苯乙烯單體洗至中性為止； 步驟二、茶油乳化劑制備
取100毫升茶油和100毫升蒸餾水，加熱至60°C，攪拌1(Γ15分鐘，再加入氫氧化鈉固體20克和蒸餾水200毫升，加熱攪拌到80°C，加熱維持4(Γ60分鐘，直至皂化完全為止，即得到茶油乳化劑；
步驟三、氯化金交聯(lián)劑制備
由于氯化金易潮解，制備時將整個包裝(小瓶或安瓿瓶)一次性溶解，按1 :99重量份比例，用3. 5- 二甲硫基甲苯二胺配成氯化金交聯(lián)劑； 步驟四、苯乙烯單體的聚合按照重量份比例分別取出以下成份茶油乳化劑5. 2^5. 6
苯乙烯單體12
過碘酸鈉5. 54
氯化金交聯(lián)劑 3. 8 4. 2 聚乙烯醇6000:1.4
聚醚三醇2. 4
氫氧化鈉1. 46
白磷乙醚飽和液 8. 2 蒸餾水余量
在蒸餾水中首先加入茶油乳化劑加熱至60°C，以200次/分鐘速度連續(xù)攪拌5、分鐘， 再分別加入苯乙烯單體、過碘酸鈉，繼續(xù)加熱并維持85°C以上，且不停攪拌6小時，隨后取樣鏡檢，無單體油珠，聚合反應完成，即將苯乙烯單體聚合，得到聚苯乙烯微粒； 步驟五、聚苯乙烯微粒與氯化金交聯(lián)劑交聯(lián)
在步驟四中所得的聚苯乙烯微粒中，按照步驟四所述的重量份比例依次加入氯化金交聯(lián)劑、聚乙烯醇6000、聚醚三醇、氫氧化鈉，用工作頻率大于40KHz超聲波機進行超聲乳化 15分鐘，再加熱至沸騰，一次性快速加入步驟四所述的白磷乙醚飽和液，并混勻，再保持沸騰纊10分鐘，溶液顏色首先變黑，再逐漸變成混濁的酒紅色，交聯(lián)反應完成，交聯(lián)成聚苯乙烯金包微粒；
步驟六、金包微粒的粒徑篩選
取上述合成的聚苯乙烯金包微粒與蒸餾水按照2 8的重量份比例稀釋，分別倒入塑料管中，用轉速為4500轉/分鐘進行離心15分鐘，去除沉淀物厚，再放入高速離心機中，用 13000轉/分鐘轉速再離心15分鐘，即可得到30(T500nm粒度的微粒沉淀，在高倍鏡下可見淡紅色乳膠顆粒，此即聚苯乙烯納米金包微粒。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒，進行了如下兩個實例試驗，可供對照參考。實例1乳膠凝集試驗
乳膠顆粒對蛋白質等多種生物高分子物質雖有良好的吸附性能(但與金表面的吸附是無法相比的)，可以利用它作為載體吸附某種抗原(或抗體)，適合條件下，即可發(fā)生顆粒凝集現(xiàn)象，此為乳膠凝集試驗。若乳膠顆粒過大，在稀濃度懸液中穩(wěn)定性差，顆粒表面積大，不能定量吸附某種抗原(特別是抗體)，只能做定性或半定量試驗。實例2膠體金標記技術試驗
膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液(膠體金表面吸附很強但膠體穩(wěn)定性差)。利用它在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷范圍借靜電吸引而形成牢固結合，做成金標試劑，以硝酸纖維素膜為載體，將試劑及標本滴加在膜上，通過滲濾而逐步反應，陽性結果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點，為定性試驗。為進一步驗證本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒，進行了如下2項檢測檢測1金包微粒粒徑檢測
將上述合成的金包微粒，在4500轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，再棄去沉淀物， 再在13000轉/分鐘的高轉速下離心15分鐘，收集沉淀物。在油浸鏡下，用目鏡測微器和鏡臺測微器配合測其粒徑。結果為鏡下見到粒度均勻的淡紅色乳膠顆粒，粒徑均在 300nm^500nm,此即為聚苯乙烯納米金包微粒。檢測2將金包微粒水溶液稀釋后加電解質，做破膠試驗
將金包微粒分散液進行倍比稀釋，稀釋比例依次為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、 1:128……。用分光光度計進行比濁，使吸光度A(吸光度A=LgItlA,其中Itl為入射光強度， I為透過光強度)從0到0. 8的低濃度范圍(即符合朗白一比爾定律)，加入同體積生理鹽水進行24h破膠沉淀試驗。其結果是從低濃度到高濃度的金包微粒仍是均勻的水溶液。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒的水溶液為均勻分散的混懸液，未經(jīng)高速離心不會沉淀。金包微粒作為抗原或抗體載體參加免疫濁度反應，呈幾何級數(shù)放大了測定目標抗原或抗體的靈敏度，大大提高了免疫透射比濁法測定靈敏度，把復雜的化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫反應才能檢測的微克級、納克級的目標抗原或抗體，在生化分析儀即可直接測定，實際使用效果好。
8
權利要求
1.一種聚苯乙烯納米金包微粒，作為抗原或抗體載體參加免疫濁度反應，并在生化分析儀直接測定，其特征在于，所述的聚苯乙烯納米金包微粒由下列重量比例的成份構成苯乙烯單體(純化) 11. 8 12. 2; 茶油乳化劑5. 2^5. 6 ；氯化金交聯(lián)劑3. 8 4. 2 ；聚乙二醇 6000:1.4 ；聚醚三醇2. 4 ；過碘酸鈉5. M ；氫氧化鈉1. 46 ；白磷乙醚飽和液8. 2 ；蒸餾水余量。
2.如權利要求1所述的一種聚苯乙烯納米金包微粒，其特征在于，所述的苯乙烯單體 (純化)重量份比例為12%。
3.如權利要求1所述的一種聚苯乙烯納米金包微粒，其特征在于，所述的茶油乳化劑重量份比例為5. m。
4.如權利要求1所述的一種聚苯乙烯納米金包微粒，其特征在于，所述的氯化金交聯(lián)劑重量份比例為3. 8%。
5.如權利要求1所述的一種聚苯乙烯納米金包微粒，其特征在于，所述的聚苯乙烯納米金包微粒制備方法如下步驟一、苯乙烯單體純化按2:1重量份比例取聚苯乙烯單體和濃度為ImmoL/L的氫氧化鈉溶液于分液漏斗中， 萃取10分鐘，靜置15分鐘，分離并棄去下層氫氧化鈉水溶液，用蒸餾水如此反復處理，直至苯乙烯單體洗至中性為止； 步驟二、茶油乳化劑制備取100毫升茶油和100毫升蒸餾水，加熱至60°C，攪拌1(Γ15分鐘，再加入氫氧化鈉固體20克和蒸餾水200毫升，加熱攪拌到80°C，加熱維持4(Γ60分鐘，直至皂化完全為止，即得到茶油乳化劑；步驟三、氯化金交聯(lián)劑制備將整個包裝(小瓶或安瓿瓶)一次性溶解，按1 :99重量份比例，用3. 5- 二甲硫基甲苯二胺配成氯化金交聯(lián)劑；步驟四、苯乙烯單體的聚合按照重量份比例分別取出以下成份 茶油乳化劑5. 2^5. 6苯乙烯單體12過碘酸鈉5. 54氯化金交聯(lián)劑 3. 8 4. 2 聚乙烯醇6000:1.4聚醚三醇2. 4氫氧化鈉1. 46白磷乙醚飽和液 8. 2 蒸餾水余量在蒸餾水中首先加入茶油乳化劑加熱至60°C，以200次/分鐘速度連續(xù)攪拌5、分鐘， 再分別加入苯乙烯單體、過碘酸鈉，繼續(xù)加熱并維持85°C以上，且不停攪拌6小時，隨后取樣鏡檢，無單體油珠，聚合反應完成，即將苯乙烯單體聚合，得到聚苯乙烯微粒； 步驟五、聚苯乙烯微粒與氯化金交聯(lián)劑交聯(lián)在步驟四中所得的聚苯乙烯微粒中，按照步驟四所述的重量份比例依次加入氯化金交聯(lián)劑、聚乙烯醇6000、聚醚三醇、氫氧化鈉，用工作頻率大于40KHz超聲波機進行超聲乳化 15分鐘，再加熱至沸騰，一次性快速加入步驟四所述的白磷乙醚飽和液，并混勻，再保持沸騰纊10分鐘，溶液顏色首先變黑，再逐漸變成混濁的酒紅色，交聯(lián)反應完成，交聯(lián)成聚苯乙烯金包微粒；步驟六、金包微粒的粒徑篩選取上述合成的聚苯乙烯金包微粒與蒸餾水按照2 8的重量份比例稀釋，分別倒入塑料管中，用轉速為4500轉/分鐘進行離心15分鐘，去除沉淀物厚，再放入高速離心機中，用 13000轉/分鐘轉速再離心15分鐘，即可得到30(T500nm粒度的微粒沉淀，在高倍鏡下可見淡紅色乳膠顆粒，此即聚苯乙烯納米金包微粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚苯乙烯納米金包微粒及其制備方法。所述的聚苯乙烯納米金包微粒成份為苯乙烯單體(純化)、茶油乳化劑、氯化金交聯(lián)劑、聚乙二醇6000、聚醚三醇、過碘酸鈉、氫氧化鈉、白磷乙醚飽和液、蒸餾水；所述聚苯乙烯納米金包微粒制備方法包括苯乙烯單體純化、茶油乳化劑制備、氯化金交聯(lián)劑制備、苯乙烯單體的聚合、聚苯乙烯微粒與氯化金交聯(lián)劑交聯(lián)、金包微粒的粒徑篩選。本發(fā)明所述的聚苯乙烯納米金包微粒作為抗原或抗體載體參加免疫濁度反應，呈幾何級數(shù)放大了測定目標抗原或抗體的靈敏度，把復雜的化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫反應才能檢測的微克級、納克級的目標抗原或抗體，在生化分析儀即可直接測定，實際使用效果好。
文檔編號G01N33/531GK102507926SQ20111030817
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權日2011年10月12日
發(fā)明者王之侃 申請人:安徽信靈檢驗醫(yī)學科技有限公司