專利名稱：一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，尤其是基于金雜化的納米介孔SiA復合材料的測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，納米材料在單分子水平的各種探針技術(shù)、納米集成陣列器件、電極表面修飾等方面的研究將取得了大范圍的進展。其中，將納米材料引入電極表面，能有效增加電極的比表面積，加快電子的傳遞，增強電極的導電性，提高生物大分子例如酶的固定量，增強傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，提高傳感器的響應速度等。納米介孔SiO2材料(MSN)具有比表面積大、孔徑較大、生物相容性較好等優(yōu)點，能有效地固定辣根過氧化物酶(HRP)，增強體系的催化活性，是組裝免疫傳感器的良好材料。金納米粒子具有比表面積大、表面反應活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力強等性能，良好的生物相容性和穩(wěn)定性，可用于固載和標記生物分子。將MSN和金納米粒子(Au)通過復鹽法合成得到MSN-Au復合材料， 即保留了兩者原有的優(yōu)點，又能進一步提高電子傳遞效率，增強酶的活性，可用于免疫傳感器的制備。甲胎蛋白(a -fetoprotein，AFP)是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白，血清中甲胎蛋白的升高對原發(fā)性肝癌診斷具有重要的意義。目前甲胎蛋白的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、間接血酶法和瓊脂雙擴散法等。這些方法靈敏、可靠，但酶不穩(wěn)定，放射性物質(zhì)設備要求高，且危害較大。近年來有報道采用電化學方法與免疫反應結(jié)合檢測甲胎蛋白，該法所需設備簡單、成本低廉，靈敏度高，檢出限低，并且將納米復合材料引入到電化學免疫傳感器，可以增強酶的活性。CN101441218建立了一種利用CdTe量子點和!^e3O4-Dextran納米顆粒檢測血清中的甲胎蛋白含量的方法，其步驟包括Fe3O4-Dextran-第一抗體復合物的制備及CdTe-第二抗體復合物的制備，根據(jù)熒光強度大小測定了肝癌病人的甲胎蛋白值。CN101566636A發(fā)明建立了一種定量檢測血液中甲胎蛋白的磁性免疫層析試紙條及其制備方法，該發(fā)明將磁性免疫層析技術(shù)和生物素親和素系統(tǒng)引入到血液中甲胎蛋白的定量檢測中，大大提高了檢測靈敏度。本發(fā)明基于MSN-Au為載體材料，建立了一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，提高了檢測的靈敏度，線性范圍寬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征包括以下步驟(1) (MSN-Au)-HRP-甲胎蛋白第二抗體(Ab2)復合物的制備；(2)硫堇(TH)-石墨烯(GS)混合溶液的制備；(3)建立電化學免疫傳感器，測定甲胎蛋白，繪制工作曲線。
本發(fā)明中所述的(MSN-Au)-HRP-Ab2復合物的制備，其特征在于過程具體包括以下步驟(I)MSN-Au納米復合材料的制備將氨基修飾的MSN和H4AuCl4按照質(zhì)量1.2 1的比例混合，在室溫下，用磁力攪拌器輕輕攪拌，然后加入鹽酸調(diào)節(jié)酸度，然后再攪拌，加入40mmol · L—1的硼氫化鈉，直到其顏色變成黑色(紫色、黑色)，離心，室溫真空干燥，即可獲得MSN-Au納米復合材料；(2) (MSN-Au) _HRP+Ab2 復合物的制備將1. Omg · ml^MSN-Au納米復合材料溶液和1. Omg · mL^HRP溶液以及 1. Omg .HiL-1Al32溶液按照1 1. 2 1 0. 5 1. 2的體積比進行混合，輕微搖晃吸附Mh， 離心，將所得的物質(zhì)再分散于0. 05mol · L-1PH = 7. 50的PBS緩沖溶液中備用。本發(fā)明中所述的TH-GS混合溶液的制備包括以下步驟將1. Omg · mL^GS溶液和 1. Omg · Hir1TH溶液混合并超聲20 30h。本發(fā)明中所述的建立電化學免疫傳感器，測定甲胎蛋白，繪制工作曲線，其特征在于包括以下步驟(1)將5mm直徑的玻碳電極依次用1. 0，0. 3和0. 05 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于0. 05mol -L"1鐵氰化鉀溶液中，在-0. 6 0. 6V 掃描，峰電流差小于85mA;(2)將3 8 μ L GS+TH溶液滴到玻碳電極表面，待晾干；(3)滴涂3 8 μ L體積分數(shù)為3%的戊二醛溶液保持潤濕，水清洗，晾干成膜；(4)滴涂3 8 μ L 1. Omg · mL—1甲胎蛋白第一抗體(Abl)至玻碳電極表面，放置一段時間保持潤濕，水清洗，晾干；(5)將3 8yL Ig "Γ1牛血清白蛋白溶液滴涂至玻碳電極表面，放置一段時間， 晾干；(6)將不同濃度的甲胎蛋白抗原溶液滴涂到玻碳電極表面，反應一段時間，測定其氧化還原電位變化；(7)將3 8 μ L(MSN-Au)-HRP-Ab2復合物溶液滴涂到含有甲胎蛋白抗原的玻碳電極上，反應0. 5 1. 5h，然后分別在5mL pH = 7. 50PBS緩沖溶液和含有l(wèi)mmol H2O2的5mL PH = 7. 50PBS緩沖溶液的溶液測定其氧化還原電位變化；(8)根據(jù)所得電流差值與甲胎蛋白抗原濃度呈線性關系，繪制工作曲線。本發(fā)明中石墨烯具有優(yōu)良的導電性。MSN-Au復合材料具有比表面積大、孔徑較大、 生物相容性較好等優(yōu)點，能夠固定更多的HRP，增強體系的催化活性。本發(fā)明的電化學免疫傳感器表現(xiàn)出了優(yōu)良的準確性、高靈敏度性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，免疫分析檢測迅速、方便，可用于臨床分析。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1步驟1.將氨基修飾的納米介孔SW2和H4AuCl4按照質(zhì)量1. 2 1的比例混合，在室溫下，用磁力攪拌器輕輕攪拌，然后加入鹽酸調(diào)節(jié)酸度，然后再攪拌，加入40mmol · L—1的硼氫化鈉，直到其顏色變成黑色(紫色、黑色)，離心，室溫真空干燥，即可獲得MSN-Au納米復合材料；步驟2.將 1. OmL 1. Omg · ml^MSN-Au 納米復合材料溶液和 1. OmL 1. Omg · mL^HRP 溶液以及1. OmL 1. Omg ^L4Ab2溶液進行混合，輕微搖晃吸附Mh，離心，將所得的物質(zhì)再分散于1. OmL 0. 05mol · L^pH = 7. 50的PBS緩沖溶液中備用；步驟3.將5mm直徑的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和0. 05 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，再用二次水沖洗干凈，然后將電極置于0. 05mol -L"1鐵氰化鉀溶液中，在-0. 6 0. 6V掃描，峰電流差為80mA ； 步驟4.將0. 5mL Img · mL^GS溶液和0. 5mL Img · mL^TH溶液混合并超聲24h,然后將5 μ L所得GS+TH溶液滴到玻碳電極表面，自然干燥；步驟5.滴涂體積分數(shù)為3%的戊二醛溶液大約1. Oh保持潤濕，超純水清洗，晾干成膜；步驟6.滴涂5yL LOmgmr1甲胎蛋白第一抗體至玻碳電極表面，放置一段時間保持潤濕，水清洗，晾干；步驟7.將3yL Ig "Γ1牛血清白蛋白溶液滴涂至玻碳電極表面，放置一段時間， 晾干；步驟8.將0. 01 16ng -πιΓ1不同濃度的甲胎蛋白抗原溶液分別滴到不同電極表面，反應1. 0h，測定其氧化還原電位變化；步驟9.將5 μ L(MSN-Au)-HRP-Ab2復合物溶液滴涂到含有甲胎蛋白抗原的玻碳電極上，反應1. 0h，然后分別在5mL pH = 7. 50PBS緩沖溶液和含有l(wèi)mmol H2O2的5mL pH = 7. 50PBS緩沖溶液的溶液測定其氧化還原電位變化；步驟10.根據(jù)所得電流差值與甲胎蛋白抗原濃度呈線性關系，繪制工作曲線；測定結(jié)果表明，甲胎蛋白在0. 02 15ng · mL-1范圍內(nèi)成線性關系，線性相關系數(shù)為0. 9991。 檢出限為epg^mLA
權(quán)利要求
1.一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)納米介孔SiO2-金復合材料(MSN-Au)-辣根過氧化物酶(HRP)-甲胎蛋白第二抗體 (Ab2)復合物的制備；(2)硫堇(TH)-石墨烯(GS)混合溶液的制備；(3)建立電化學免疫傳感器，測定甲胎蛋白，繪制工作曲線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述(MSN-Au)-HRP-Al32復合物的制備過程具體包括以下步驟，其特征在于包括以下步驟(1)MSN-Au納米復合材料的制備MSN-Au納米復合材料的制備將氨基修飾的MSN和H4AuCl4按照質(zhì)量1. 2 1的比例混合，在室溫下，用磁力攪拌器輕輕攪拌，然后加入鹽酸調(diào)節(jié)酸度，然后再攪拌，加入 40mmol · L—1的硼氫化鈉，直到其顏色變成黑色(紫色、黑色)，離心，室溫真空干燥，即可獲得MSN-Au納米復合材料；(2)(MSN-Au) -HRP-Ab2 復合物的制備將1. Omg · ml^MSN-Au納米復合材料溶液和1. Omg · mL^HRP溶液以及1. Omg · Hir1Ab2 溶液按照1 1.2 1 0.5 1.2的體積比進行混合，輕微搖晃吸附Mh，離心，將所得的物質(zhì)再分散于0. 05mol · L1PH = 7. 50的PBS緩沖溶液中備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TH-GS混合溶液的制備，其特征在于將1.Omg -mL^GS溶液和1. Omg · Hir1TH溶液混合并超聲20 30h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立甲胎蛋白電化學免疫傳感器，測定甲胎蛋白，繪制工作曲線，其特征在于包括以下步驟(1)將5mm直徑的玻碳電極依次用1.0,0. 3和0. 05 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理， 再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于0. 05mol · Γ1鐵氰化鉀溶液中，在-0. 6 0. 6V掃描，峰電流差小于85mA;(2)將3 8μ L GS+TH溶液滴到玻碳電極表面，待晾干；(3)滴涂3 8μ L體積分數(shù)為3 %的戊二醛溶液保持潤濕，水清洗，晾干成膜；(4)滴涂3 8μL 1. Omg · mL—1甲胎蛋白第一抗體至玻碳電極表面，放置一段時間保持潤濕，水清洗，晾干；(5)將3 8yLIg C1牛血清白蛋白溶液滴涂至玻碳電極表面，放置一段時間，晾干；(6)將不同濃度的甲胎蛋白抗原溶液分別滴涂到不同玻碳電極表面，反應一段時間，測定其氧化還原電位變化；(7)將3 8μL(MSN-Au)-HRP-Ab2復合物溶液滴涂到含有甲胎蛋白抗原的玻碳電極上，反應0. 5 1. 5h，然后分別在5mL pH = 7. 50PBS緩沖溶液和含有l(wèi)mmol H2O2的5mLpH =7. 50PBS緩沖溶液的溶液測定其氧化還原電位變化；(8)根據(jù)所得電流差值與甲胎蛋白抗原濃度呈線性關系，繪制工作曲線。
全文摘要
一種測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，尤其是基于金雜化的納米介孔SiO2復合材料的甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法。并采用該免疫傳感器建立了甲胎蛋白的測定方法。其特征在于首先合成納米介孔SiO2-納米金復合材料，將辣根過氧化物酶、第二抗體固定到該復合材料上形成了復合物；然后將硫堇-石墨烯復合物用于一抗的固定，從而制備了測定甲胎蛋白的電化學免疫傳感器，該免疫傳感器成功地用于甲胎蛋白的測定。本發(fā)明的電化學免疫傳感器表現(xiàn)出了優(yōu)良的準確性、高靈敏度性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，免疫分析檢測迅速、方便，可用于臨床分析，為癌癥的早期診斷提供了重要的依據(jù)。
文檔編號G01N33/68GK102507953SQ20111031989
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者吳丹, 崔振濤, 龐雪輝, 李燕, 李玉陽, 李賀, 杜斌, 楊健, 毛珂霞, 羅川南, 范大偉, 蔡燕燕, 趙燕芳, 辛曉東, 韓顏顏, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟南大學