專利名稱：一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法
一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明是涉及一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，屬于中藥分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中藥板藍根，又稱北板藍根，自首載于《中國藥典》1977年版，此后歷版藥典均有收載，為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效。十字花科植物中富含芥子苷類化合物，板藍根中含有的主要芥子苷類化合物為R， S-告依春、原告依春、表原告依等，其中R，S-告依春為板藍根的主要活性成分之一，且為板藍根的特征性成分。目前對板藍根的質(zhì)量主要是根據(jù)R，S-告依春含量高低進行控制(2010 版《中國藥典》(一部)，國家醫(yī)藥科技出版社191)。
南板藍根為爵床科植物馬蘭Baphicacanthus eusia (Nees) Bremek.干燥根(2010 版《中國藥典》(一部)，國家醫(yī)藥科技出版社229)。自《中國藥典》1995年版將南板藍根單列品種開始，便有北板藍根、南板藍根兩種。南板藍根中不含有R，S-告依春等芥子苷類化合物，不作為板藍根使用，但目前市場上仍有南、北板藍根混用的現(xiàn)象。
板藍根顆粒和復(fù)方板籃根顆粒為常用的非處方藥品，是以板藍根為原料的最具代表性的制劑。板藍根顆粒是由板藍根經(jīng)水煎醇沉加工制成，復(fù)方板藍根顆粒是由板藍根和大青葉經(jīng)水煎醇沉加工制成，均具有清熱解毒、涼血利咽、消腫之功效。但迄今為止，板藍根顆粒以亮氨酸、精氨酸對照品作為TLC鑒別依據(jù)，無含量測定項O010版《中國藥典》(一部)，國家醫(yī)藥科技出版社800)；復(fù)方板藍根顆粒以氨基酸為對照進行TLC鑒別，以靛玉紅、靛藍為指標成分進行定量控制。上述質(zhì)量控制方法缺乏專屬性，且與現(xiàn)行板藍根藥材和飲片的標準不一致，無法保證板藍根制劑的質(zhì)量。
目前對板藍根及其制劑的指紋圖譜已有文獻報道(參見閆峻等，復(fù)方板藍根顆?？共《境煞諬PLC-UV指紋圖譜及LC-ESI-MSn研究[J]，化學學報，2011年，69 (2) :204 ；肖雪等，中藥板藍根高效液相色譜法指紋圖譜研究[J]，江西中醫(yī)學院學報，2010年，22C3) 67； 柏健等，板藍根顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J]，中草藥，2006年，37(1) :72)，但這些方法均為獨立的指紋圖譜研究方法，無法體現(xiàn)板藍根藥材與制劑的相關(guān)性，且不能與南板藍根相區(qū)別。目前尚無在同一高效液相色譜條件下針對板藍根、板藍根顆粒、復(fù)方板藍根顆粒和南板藍根進行指紋圖譜研究的方法。發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法。
本發(fā)明提供的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，包括如下步驟3
a)對待測的板藍根及其制劑樣品進行預(yù)處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液；
b)采用高效液相色譜法，測定經(jīng)預(yù)處理后的待測的板藍根及其制劑樣品，獲得特征指紋圖譜；所述的高效液相色譜法的色譜條件是采用反相十八烷基鍵合相硅膠色譜柱， 流動相由A相和B相組成，A相為pH = 3. 0,0. 02%的磷酸水溶液，B相為乙腈，按照以下條件進行梯度洗脫
0至10分鐘，流動相A與流動相B的體積比由99 1勻速變化至95 5 ；
10至15分鐘，流動相A與流動相B的體積比由95 5勻速變化至93 7 ；
15至30分鐘，流動相A與流動相B的體積比為93 7。
所述的待測的板藍根樣品是指板藍根藥材和板藍根飲片，包括南板藍根藥材；待測的板藍根制劑樣品是指板藍根顆粒和復(fù)方板藍根顆粒，包括含蔗糖型和無蔗糖型。
進一步，待測的板藍根樣品的預(yù)處理方法如下精密稱取待測樣品粉末，精密加入 50倍重量的水，稱重，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
進一步，待測的板藍根制劑樣品的預(yù)處理方法如下取制劑待測樣品，研細，混勻， 精密稱取，加入含蔗糖制劑樣品的10倍重量的水，或加入無蔗糖制劑樣品的20倍重量的水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
進一步，所述的高效液相色譜方法采用紫外檢測器，采集范圍為190 400nm，檢測波長為245nm ；反相十八烷基鍵合相硅膠色譜柱為Siiseido C18MG (4. 6mmX 250mm, 5 μ m) 色譜柱；混合流動相的流速為1. OmL/min ；進樣量為10 μ 1 ；柱溫為30°C。
所述的特征指紋圖譜是指高效液相色譜圖中保留時間tK為5. 2分鐘的1號胞苷峰，保留時間tK為8. 2分鐘的2號尿苷峰，保留時間tK為10. 1分鐘的3號腺苷峰，保留時間tK為11. 6分鐘的4號鳥苷峰，保留時間tK為18. 4分鐘的5號R，S-告依春峰。
板藍根、板藍根顆粒和復(fù)方板藍根顆粒的特征峰是5號R，S-告依春峰，南板藍根的高效液相色譜圖中不含5號R，S-告依春峰。
本發(fā)明的優(yōu)點是
(1)本發(fā)明方法為首次應(yīng)用同一高效液相色譜條件對板藍根、板藍根顆粒和復(fù)方板藍根顆粒進行特征指紋圖譜的檢測與分析。該方法能夠較全面體現(xiàn)整體化學信息，對板藍根及其制劑進行品質(zhì)評價具有重要指導意義，可應(yīng)用于新藥研發(fā)質(zhì)控等多個方面。
(2)本發(fā)明方法為首次應(yīng)用同一高效液相色譜條件對板藍根和南板藍根進行特征指紋圖譜的檢測與分析，對板藍根和南板藍根的鑒別和品質(zhì)評價具有重要指導意義，可應(yīng)用于新藥研發(fā)質(zhì)控等多個方面。
(3)本發(fā)明方法簡便快速、重復(fù)性好，通過高效液相色譜法對板藍根及其制劑進樣分析，測定特征指紋圖譜，分析成本低，有較強的實用性。


圖1為板藍根藥材的高效液相特征色譜圖。
圖2為板藍根飲片的高效液相特征色譜圖。
圖3板藍根顆粒(無蔗糖)的高效液相特征色譜圖。
圖4為板藍根顆粒(含蔗糖)的高效液相特征色譜圖。
圖5為復(fù)方板藍根顆粒(無蔗糖)的高效液相特征色譜圖。
圖6為復(fù)方板藍根顆粒(含蔗糖)的高效液相特征色譜圖。
圖7為板藍根和南板藍根高效液相特征色譜比較圖。
其中1為胞苷峰，2為尿苷峰，3為腺苷峰，4為鳥苷峰，5為R，S-告依春峰；A為板藍根，B為南板藍根。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的保護范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例1 測定板藍根藥材的高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取板藍根藥材粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中， 精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根藥材供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定將板藍根藥材供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別為5. 239分鐘，8. 224 分鐘，10. 157分鐘，11. 636分鐘和18. 459分鐘，完成板藍根藥材的高效液相色譜特征指紋圖譜測定，見圖1所示圖譜。
實施例2 測定板藍根飲片的高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取板藍根飲片粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中， 精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根飲片供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定將板藍根飲片供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 233分鐘，8. 227 分鐘，10. 220分鐘，11. 667分鐘和18. 493分鐘，見圖2所示圖譜。
實施例3 測定板藍根顆粒(無蔗糖)高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取板藍根顆粒(無蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約 1. Og,精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根顆粒(無蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定將板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是 5. 169分鐘，8. 191分鐘，10. 074分鐘，11. 522分鐘和18. 388分鐘，見圖3所示圖譜。
實施例4 測定板藍根顆粒(含蔗糖)高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取板藍根顆粒(含蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入IOmL水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(4)板藍根顆粒(含蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定將板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是 5. 192分鐘，8. 166分鐘，10. 059分鐘，11. 562分鐘和18. 305分鐘，見圖4所示圖譜。
實施例5 測定復(fù)方板藍根顆粒(無蔗糖)高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取復(fù)方板藍根顆粒(無蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min，93%A ；流速l.OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)復(fù)方板藍根顆粒(無蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定 將復(fù)方板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 164分鐘，8. 225分鐘，10. 116分鐘，11. 547分鐘和18. 408分鐘，見圖5所示圖譜。
實施例6 測定復(fù)方板藍根顆粒(含蔗糖)高效液相色譜特征指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取復(fù)方板藍根顆粒(含蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入IOmL水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)復(fù)方板藍根顆粒(含蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特征指紋圖譜測定 將復(fù)方板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 141分鐘，8. 212分鐘，10. 125分鐘，11. 551分鐘和18. 396分鐘，見圖6所示圖譜。
實施例7 測定南板藍根高效液相色譜指紋圖譜
(1)供試品溶液的制備取南板藍根粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中，精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過， 取續(xù)濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器采集范圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)南板藍根藥材供試品溶液的高效液相色譜指紋圖譜測定將南板藍根藥材供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，無R，S-告依春特征色譜峰，且與板藍根高效液相色譜指紋圖譜相似度差，直觀觀察即可區(qū)分，見圖7所示圖譜。
權(quán)利要求
1.一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，其特征在于，包括如下步驟a)對待測的板藍根及其制劑樣品進行預(yù)處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；b)采用高效液相色譜法，測定經(jīng)預(yù)處理后的待測的板藍根及其制劑樣品，獲得特征指紋圖譜；所述的高效液相色譜法的色譜條件是采用反相十八烷基鍵合相硅膠色譜柱，流動相由A相和B相組成，A相為pH = 3. 0,0. 02%的磷酸水溶液，B相為乙腈，按照以下條件進行梯度洗脫0至10分鐘，流動相A與流動相B的體積比由99 1勻速變化至95 5 ；10至15分鐘，流動相A與流動相B的體積比由95 5勻速變化至93 7 ；15至30分鐘，流動相A與流動相B的體積比為93 7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，所述的待測的板藍根樣品是指板藍根藥材和板藍根飲片，包括南板藍根藥材。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，其特征在于，所述的待測的板藍根樣品的預(yù)處理方法如下精密稱取待測樣品粉末，精密加入50倍重量的水，稱重，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，所述的待測的板藍根制劑樣品是指板藍根顆粒和復(fù)方板藍根顆粒，包括含蔗糖型和無蔗糖型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，其特征在于，所述的待測的板藍根制劑樣品的預(yù)處理方法如下取制劑待測樣品，研細， 混勻，精密稱取，加入含蔗糖制劑樣品的10倍重量的水，或加入無蔗糖制劑樣品的20倍重量的水，水浴加熱并振搖使其溶解，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，所述的高效液相色譜法采用紫外檢測器，采集范圍為190 400nm ；檢測波長為 245nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，所述的反相十八烷基鍵合相硅膠色譜柱為C18色譜柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，流動相的流速為1. OmL/min ；進樣量為10 μ 1 ；柱溫為30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法， 其特征在于，所述的特征指紋圖譜是指高效液相色譜圖中保留時間tK為5. 2分鐘的1號胞苷峰，保留時間tK為8. 2分鐘的2號尿苷峰，保留時間tK為10. 1分鐘的3號腺苷峰，保留時間tK為11. 6分鐘的4號鳥苷峰，保留時間tK為18. 4分鐘的5號R，S-告依春峰。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，其特征在于，板藍根、板藍根顆粒和復(fù)方板藍根顆粒的高效液相色譜圖中具有5號R， S-告依春峰，南板藍根的高效液相色譜圖中不含5號R，S-告依春峰。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定板藍根及其制劑的高效液相色譜特征指紋圖譜的方法，包括a)對待測的板藍根及其制劑樣品進行預(yù)處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；b)采用高效液相色譜法，測定經(jīng)預(yù)處理后的待測的板藍根及其制劑樣品，獲得特征指紋圖譜。本發(fā)明方法首次應(yīng)用同一高效液相色譜條件可對板藍根、板藍根顆粒、復(fù)方板藍根顆粒和南板藍根進行特征指紋圖譜的檢測與分析，具有簡便快速、重復(fù)性好、分析成本低等優(yōu)點，對板藍根及其制劑進行品質(zhì)評價和鑒別具有重要指導意義，可應(yīng)用于新藥研發(fā)質(zhì)控等多個方面，有較強的實用性。
文檔編號G01N30/89GK102507832SQ201110330388
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者李醫(yī)明, 王崢濤, 王瑞, 石燕紅, 謝智勇, 黃山君 申請人:上海中醫(yī)藥大學